全 文 :116 2015, Vol.36, No.24 食品科学 ※成分分析
红外光谱结合多元统计分析快速鉴别
不同种类牛肝菌
杨天伟1,2,张 霁2,史云东3,李 涛3,王元忠2,*,刘鸿高1,*
(1.云南农业大学农学与生物技术学院,云南 昆明 650201;2.云南省农业科学院药用植物研究所,云南 昆明 650200;
3.玉溪师范学院资源环境学院,云南 玉溪 653100)
摘 要:采用傅里叶变换红外光谱结合多元统计分析方法快速鉴别不同种类食用牛肝菌。采集10 个不同种类93 个
牛肝菌子实体的红外光谱,分析食用牛肝菌的红外光谱特征;用多元散射校正(multiplicative signal correction,
MSC)、标准正态变量(standard normal variate,SNV)、二阶导数(second derivative,SD)、Norris平滑
(ND)、正交信号校正(orthogonal signal correction,OSC)、小波压缩等方法对光谱进行优化处理;经优化处
理的光谱数据分别建立马氏距离分类模型及偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-
DA)。结果显示,牛肝菌在3 325、2 934、2 927、1 637、1 547、1 402、1 375、1 259、1 453、1 081、1 029 cm-1
等附近有多个吸收峰,主要归属为蛋白质、多糖、氨基酸等的特征吸收峰。MSC+SD+ND(15∶5)和SNV+SD+
ND(15∶5)两种预处理方式前10 个主成分累积贡献率分别为95.58%、95.54%,基于两种预处理方法建立马氏距
离分类模型,验证集预测准确率分别为90%和95%。PLS-DA结果显示经MSC+SD+ND(15∶5)和SNV+SD+ND
(15∶5)预处理不易于区分牛肝菌种类;原始光谱经正交信号校正及小波压缩(orthogonal signal correction wavelet
compression,OSCW)、优化处理并进行PLS-DA分析,能够很好地区分不同种类牛肝菌。马氏距离分类模型不仅
能反映样品的分类情况,同时计算出与测试样品相似度最大的物种,可为食用菌种类鉴别和未知物种鉴定提供可靠依
据;OSCW预处理后进行PLS-DA分析能有效鉴别不同种类牛肝菌,为野生食用菌的鉴别分类提供一种辅助方法。
关键词:红外光谱;牛肝菌;鉴别;马氏距离;偏最小二乘判别分析
Infrared Spectroscopy Combined with Multivariate Statistical Analysis to
Quickly Identify Different Species of Bolete Mushrooms
YANG Tianwei1, 2, ZHANG Ji2, SHI Yundong3, LI Tao3, WANG Yuanzhong2,*, LIU Honggao1,*
(1. College of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China;
2. Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650200, China;
3. College of Resources and Environment, Yuxi Normal University, Yuxi 653100, China)
Abstract: Fourier transform infrared spectroscopy combined with multivariate statistical analysis was used to establish a
rapid method for the identification of different species of edible bolete mushrooms. The infrared spectral characteristics of 93
bolete samples of 10 different species were analyzed. The original infrared spectra were pretreated by multiplicative signal
correction (MSC), standard normal variate (SNV), second derivative, Norris smooth, orthogonal signal correction (OSC) and
wavelet compression. The optimized spectral data were used to establish a mahalanobis distance classification model and a
partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) model. The results showed that the characteristic absorption peaks of
protein, polysaccharide and amino acid appeared at wavenubmers around 3 325, 2 934, 2 927, 1 637, 1 547, 1 402, 1 375,
1 259, 1 453, 1 081, and 1 029 cm−1. The cumulative contribution rates were 95.58% and 95.54% in the PLS-DA model
based on MSC + SD + ND (15:5) and SNV + SD + ND (15:5) pretreatment, respectively. The Mahalanobis distance
classification model was established base on the two pretreatment methods and the prediction accuracies of validation
收稿日期:2015-01-21
基金项目:国家自然科学基金地区科学基金项目(31260496;31160409;31460538);国务院农村综合改革专项(2014NG007-18);
云南省教育厅科学研究基金项目(2013Z074)
作者简介:杨天伟(1989—),男,硕士研究生,主要从事野生食用菌资源研究。E-mail:yangtianweizj@126.com
*通信作者:王元忠(1981—),男,助理研究员,硕士,主要从事药用植物和真菌资源研究。E-mail:yzwang1981@126.com
刘鸿高(1974—),男,教授,博士研究生,主要从事野生食用菌资源研究。E-mail:honggaoliu@126.com
※成分分析 食品科学 2015, Vol.36, No.24 117
食用菌营养丰富、食味独特,是集营养、保健、
药用于一体的健康食品,大量研究表明食用菌富含蛋白
质、膳食纤维、多糖、氨基酸、维生素、矿质元素等营
养物质[1-4],可作为人体8 种必需氨基酸和易缺乏微量元
素Ca、Fe、Mg、Mn、Zn、Se等的重要来源[3,5-6];多糖
类物质具有抗氧化、防癌抗癌、防病治病、增强人体免
疫力等功效 [7-9]。我国食用菌种类多、产量大,是世界
上最大的食用菌生产国和出口国[10];云南多样的立体气
候和丰富的森林资源孕育了大量的野生食用菌资源,牛
肝菌、松茸、块菌等珍稀食用菌深受消费者亲睐,已远
销欧洲、日本等国家,其中牛肝菌成为菌类产品中出口
量大、换汇率高的畅销产品。野生食用菌不与人争粮,
不与农争时、争地的特征及人们日益增长的消费需求,
市场价格不断增涨,推动了农民采集野生食用菌的积极
性,成为增收的重要来源之一。然而食用菌种类繁多,
种间形态相似性高,不易准确鉴别,因误食引起的中毒
事件时有发生;市场上出现以假充真、以次充好的现
象,甚至有不法商贩收购有毒牛肝菌,制成干片后混淆
出售,严重威胁消费者健康、扰乱食用菌市场。
王向华[11]从云南市场上收购了6 种当地称为“北风
菌”的真菌,研究发现这6 种野生菌中有一类为皂味口蘑
(Tricholoma saponaceum (Fr .) Kummer),该菌为有毒
真菌不宜食用;食用菌市场上同名异物的“北风菌”仅
为一例,其他形态相似极易混淆物种还大量存在。英国
真菌学家Dentinger等[12]报道用超市购买的中国云南出口
美味牛肝菌进行DNA测序分析,发现同一包装袋内15 片
牛肝菌中有3 种新牛肝菌物种,提出丰富多样的牛肝菌种
类也许对消费者存在安全隐患。这些研究一方面表明真
菌的物种多样性及中国野生食用菌的丰富多样性,另一
方面提示人们准确鉴别不同种类野生食用菌的重要性。
野生食用牛肝菌的准确鉴别是保障消费者安全,深
入开发、研究和市场质量控制的前提基础。传统野生食
用菌鉴别主要凭借经验,根据牛肝菌生长特性、外观型
貌、显微结构、菌肉菌管的颜色及变色反应等进行鉴别
分类[13],该方法受主观因素干扰较大。目前对食用菌鉴
别分类研究主要有光谱法和分子生物学方法,本课题组
依据牛肝菌紫外光谱特征结合化学计量学方法研究了牛
肝菌不同产地、种类和部位的鉴别方法[14-15],周在进[13]、
时有明[16]等运用傅里叶红外光谱结合光谱检索、聚类分
析法鉴别了部分食用菌。Feng Bang等[17]通过分析牛肝菌
3 个基因片段的DNA系列变异情况,揭示我国牛肝菌物
种多样性;Mello等[18]根据ITS片段设计引物,用分子生
物学方法鉴别了铜色牛肝菌(Boletus aereus Bull.)和美
味牛肝菌(Boletus edulis Bull.);李艳春等[19]研究了市
场上常见4 种牛肝菌的DNA条形码,结果表明4 种牛肝
菌样品代表了12 个物种;Wu Gang等[20]分析了牛肝菌属
的DNA系列,并结合牛肝菌形态特征、显微结构等建立
了牛肝菌科分子发育系统框架;分子生物学方法价格昂
贵,操作复杂,不适宜推广应用。
傅里叶红外光谱具有操作简便、样品量少、分析
快速、样品无损等优点 [21-22],已广泛应用于中药材产
地、物种鉴别[23-24],食品分析[25-26],农业[27]等领域。本
研究通过采集10 种野生食用牛肝菌93 个子实体的红外
光谱信息,对原始光谱进行平滑、求导、多元散射校
正(multiplicative signal correction,MSC)、标准正态
变量(standard normal variate,SNV)、正交信号校正
(orthogonal signal correction,OSC)等优化处理;经优化
处理的光谱数据分别建立马氏距离分类模型及进行偏最小
二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,
PLS-DA),为快速鉴别牛肝菌种类提供辅助方法。
1 材料与方法
1.1 实验材料
表 1 牛肝菌样品信息
Table 1 Information about Boletus samples
种类 名称 拉丁名 子实体数 编号
1 华丽牛肝菌 Boletus magnificus Chiu 10 1#~10#
2 小美牛肝菌 Boletus speciosus Forst. 10 11#~20#
3 砖红绒盖牛肝菌 Xerocomus spadiceus (Fr.) Quél 9 21#~29#
4 黄褐牛肝菌 Boletus impolitus Fr. 10 30#~39#
5 褐盖牛肝菌 Boletus brunneissimus Chiu 7 39#~46#
6 紫红牛肝菌 Boletus purpureus Fr. 10 47#~56#
7 皱盖疣柄牛肝菌 Leccinum rugosicepes (Peck) Sing 7 57#~64#
8 栗色牛肝菌 Boletus umbriniporus Hongo 10 65#~74#
9 绒柄牛肝菌 Boletus tomentipes Earle 10 74#~83#
10 美味牛肝菌 Boletus edulis Bull. Fr 10 84#~93#
set were 90% and 95% respectively. Bolete species could not be well distinguished by the PLS-DA model, when the data
were pretreated by the MSC + SD + ND (15:5) and SNV + SD + ND (15:5). PLS-DA analysis of the original spectra after
optimization with orthogonal signal correction wavelet compression (OSCW) could distinguish different species of boletes.
The Mahalanobis distance classification model could reflect the classification of the samples and compute the greatest
similarity with the tested species, which can provide a reliable basis for the classification of edible mushrooms and for the
identification of unknown species. OSCW pretreatment combined with PLS-DA analysis can effectively identify different
species of boletes, providing an auxiliary method for the identification of wild edible mushrooms.
Key words: infrared spectroscopy; boletes; discrimination; Mahalanobis distance; partial least squares discriminant analysis (PLS-DA)
中图分类号:TS201.2 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2015)24-0116-06
doi:10.7506/spkx1002-6630-201524020
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10 种牛肝菌均于2012年采自云南省玉溪市易门县,
由云南农业大学刘鸿高教授鉴定,保存于云南农业大
学,详细信息见表1。
1.2 仪器与试剂
Frontier型傅里叶变换红外光谱仪(采用DTGS检测
器,光谱分辨率为4 cm-1) 美国Perkin Elmer公司;
YP-2型压片机 上海市山岳科学仪器有限公司;FW-
100型高速粉碎机 天津市华鑫仪器厂;80 目标准筛盘
浙江上虞市道墟五四仪器厂。
KBr(分析纯) 天津市风船化学试剂科技有限
公司。
1.3 方法
1.3.1 采集光谱信息
牛肝菌样品采集后清洗干净, 5 0 ℃烘干至质
量恒定,粉碎,过80 目筛,备用。称取牛肝菌样品
(1.5±0.2) mg、KBr(100±2) mg,在红外线灯下充
分混合研磨,混合均匀的粉末放入模具将其压成厚度均
匀的透明薄片。设定光谱扫描范围4 000~400 cm-1,累
计扫描次数:16 次,每个样品测定3 次,取平均光谱。
样品1#重复称取7 份,分别压片测定,考察重复性,取同
一片样品重复测定7 次,考察方法精密度,取同一片样品
分别在0、10、20、30、40、50、60 min时测定(每次测
完立即放到红外线灯下,以防吸水),考察稳定性。实
验过程中时时扣除背景干扰。
1.3.2 光谱优化处理和数据分析
光谱数据采集时受仪器噪音、样品差异、环境等诸
多因素影响;对原始光谱进行优化处理,可以降低或消
除噪音、背景等的干扰,提高光谱分析的精度。常用的
光谱预处理方法主要有平滑、求导、MSC、SNV、OSC
等,这些方法各具优点,如光谱平滑能减弱噪音干扰,
光谱数据进行求导可以消除基线漂移和噪音干扰,MSC
可减小散射光带来的误差,OSC能有效去除与目标变量
无关的干扰信息,提高光谱分析的准确度[28-29]。优化处理
后的红外光谱数据分别建立马氏距离判别分类模型和进
行PLS-DA分析。
2 结果与分析
2.1 实验方法学考察
运用Omnic 8 . 2软件的光谱检索功能,建立重
复性、精密度、稳定性的光谱数据库:A 1、A 2、
A 3,分别计算用于方法学考察样品的匹配分值,
匹配分值越大方法越可靠 [ 13 ]。结果显示重复性、精
密度、稳定性的匹配值分别在9 9 . 4 2 %~9 9 . 9 3 %、
99.90%~99.99%、99.21%~99.97%之间,表明方法
稳定性好,精密度高。
2.2 不同种类牛肝菌红外光谱分析
4 000
a
3 000 2 000 1 000⌒ᮠ/cmˉ1 12345678910
4 000
ˉ0.008ˉ0.0040.0000.0040.0080.012
3 000 2 000 1 000⌒ᮠ/cmˉ1੨ݹᓖ b
4 000
ˉ0.008ˉ0.006ˉ0.004ˉ0.0020.0000.0020.004
3 000 2 000 1 000
c ⌒ᮠ/cmˉ1੨ݹᓖ
2 000 1 500 1 000 500
d ⌒ᮠ/cmˉ1
1~10.牛肝菌种类编号,同表1。
a.原始图谱;b.一阶导数;c.二阶导数;d. SNV-小波压缩。
图 1 不同种类牛肝菌平均红外光谱
Fig.1 Mean FTIR spectra of different species of boletus
由图1可看出,不同种类牛肝菌红外光谱的峰形、峰
位基本一致,而峰高(吸光度)等具有差异,表明不同
种类牛肝菌的化学组分基本相同,而对化学成分的积累
量不同。牛肝菌在3 325 cm-1附近的强吸收峰归属为蛋白
质、多糖、纤维素等的O—H伸缩振动和蛋白质中的N—H
伸缩振动;2 934、2 927 cm-1附近明显的吸收峰主要为
多糖、蛋白质等甲基的对称伸缩振动;1 637 cm-1附近吸
收峰归属为蛋白质酰胺Ⅰ带和C=O伸缩振动;1 547 cm-1
附近为蛋白质C=N、N—H的伸缩振动;1 453 cm-1附近
归属为亚甲基的弯曲振动;1 402、1 375、1 259 cm-1等
附近为多糖、蛋白质等的C—O—H弯曲振动和亚甲基的
变形振动;1 081、1 029 cm-1附近分别为糖类的C—O和
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C—C伸缩振动;950~710 cm-1范围多个弱吸收峰,主要
为糖类异构体的特征峰。
2.3 光谱预处理
运用TQ8.0软件对原始光谱进行平滑、求导、MSC、
SNV等优化处理,运用SIMCA-P10.0软件对原始光谱进行
SNV-小波压缩优化处理,以减弱噪音、散射光、基线漂移
等的干扰,提高光谱分析的准确度,结果见图1和表2、3。
表 2 不同预处理方法的主成分累积贡献率
Table 2 Principal component cumulative contribution rates of
different pretreatment methods
预处理方法 主成分数 累积贡献率/%
NONE 10 92.87
MSC+FD+ND(15∶5) 10 94.28
MSC+SD+ND(15∶5) 10 95.58
SNV+FD+ND(15∶5) 10 94.15
SNV+SD+ND(15∶5) 10 95.54
注:MSC.多元散射校正;SNV.标准正态变量;FD.一阶导数;SD.二阶
导数;ND. Norris平滑。
由图1和表2可知,MSC+SD+ND(15∶5)和SNV+
SD+ND(15∶5)两种光谱优化方法,前10 个主成分的
累积贡献率均大于95%,效果较好。表3显示了正交信
号校正及小波压缩(orthogonal signal correction wavelet
compression,OSCW)预处理的参数,OSCW选取了特
征值大于1的3 个主成分,选用多贝西小波函数和离散小
波变换法进行压缩;结果显示,第3主成分的剩余平方和
为26.07%,表明与牛肝菌分类变量无关的73.93%干扰信
息已被消除。
表 3 OSCW预处理结果
Table 3 Results of OSCW pretreatment
主成分 正交角度/(°) 剩余平方和/% 特征值
1 90.00 61.34 35.95
2 89.99 36.51 23.10
3 89.98 26.07 9.71
2.4 不同种类牛肝菌马氏距离分类模型
随机选取20 个样品为验证集,其余样品为训练集,
将10 种不同牛肝菌种类定义为1~10类;用TQ8.0软件选
择MSC+SD+ND(15∶5)和SNV+SD+ND(15∶5)两
种光谱优化方法建立不同种类牛肝菌的马氏距离分类判
别模型,结果见表4。由表4可知,基于MSC+SD+ND
(15∶5)光谱优化处理方法建立的分类模型,20 个验证
集中9#和67#样品分类错误,其余样品分类正确,样品分
类预测正确率为90%;经SNV+SD+ND(15∶5)光谱预
处理建立的模型,只有9#样品分类错误,其余样品分类
正确,预测正确率达95%。
表4不仅显示了20 个验证集样品的分类结果,验证
集样品的计算类别与真实类别之间的马氏距离,还计算
出验证集样品与下一个最接近类别的马氏距离,能反映
两类样品的相似性。例如2#样品真实类别为第1类(华
丽牛肝菌),计算结果也为第1类,表明2#样品分类正
确,2#样品到真实分类的马氏距离为0.811;除真实值外
与2#样品最近的类别为第4类,马氏距离为1.088,表明
2#(第1类)样品与第4类样品的相似度较大,可以推测
两类牛肝菌样品化学组分及含量相似。MSC+SD+ND
(15∶5)和SNV+SD+ND(15∶5)两种预处理方法建立
的马氏距离分类模型结果基本一致,如23#样品计算分类
到真实分类的距离及与最接近类别的距离最大,53#样品
马氏距离最小。
表 4 牛肝菌种类马氏距离分类模型预测结果
Table 4 Prediction results for boletus classification by the Mahalanobis
distance classification model
编
号
MSC+SD+ND(15∶5) SNV+SD+ND(15∶5)
真实
类别
计算
类别
马氏
距离1
最接近
类别
马氏
距离2
真实
类别
计算
类别
马氏
距离1
最接近
类别
马氏
距离2
2# 1 1 0.811 4 1.088 1 1 0.802 4 1.115
9# 1 6* 0.890 4 1.226 1 6* 0.913 4 1.202
13# 2 2 0.588 4 1.575 2 2 0.570 5 1.551
15# 2 2 0.957 5 1.937 2 2 0.962 5 1.842
20# 2 2 1.026 5 1.477 2 2 1.016 5 1.472
23# 3 3 1.440 1 2.014 3 3 1.446 1 2.025
29# 3 3 0.880 1 1.552 3 3 0.889 1 1.530
34# 4 4 1.211 1 1.595 4 4 1.192 1 1.556
36# 4 4 1.112 1 1.515 4 4 1.105 1 1.593
42# 5 5 0.642 9 1.588 5 5 0.650 9 1.525
47# 6 6 0.842 7 1.012 6 6 0.851 7 1.011
53# 6 6 0.297 7 0.950 6 6 0.313 7 0.979
59# 7 7 0.869 6 1.377 7 7 0.895 6 1.425
64# 7 7 1.015 9 1.427 7 7 1.011 9 1.348
67# 8 5* 1.016 8 1.346 8 8 1.111 6 1.130
71# 8 8 0.774 6 1.218 8 8 0.766 6 1.219
77# 9 9 0.925 8 1.661 9 9 0.925 8 1.605
82# 9 9 0.915 8 1.585 9 9 0.878 5 1.566
88# 10 10 0.675 9 1.748 10 10 0.589 9 1.740
92# 10 10 0.655 7 1.329 10 10 0.673 7 1.354
注:马氏距离1:计算出的分类与实际类之间的马氏距离;最接近类别:
与该样品最接近的下一个类别;马氏距离2:样品到最接近下一个类别的
马氏距离。*.分类错误。
2.5 PLS-DA
将M S C+S D+N D(1 5∶5)和S N V+S D+N D
(15∶5)预处理后的光谱数据导入SIMCA-P软件进行
PLS-DA,结果见图2。图2为前3 个主成分的三维得分
图,由图2a可看出,不同种类牛肝菌样品只有部分样品
可以很好的聚类,很多样品出现离散分布,不易区分不
同种类牛肝菌样品,图2b反映出不同种类牛肝菌分类效
果明显优于图2a的分类效果,但部分样品的聚类效果不
明显如:砖红绒盖牛肝菌;不同种类牛肝菌样品互相堆
叠,难以鉴别牛肝菌种类,表明SNV+SD+ND(15∶5)
和MSC+SD+ND(15∶5)光谱预处理方法结合PLS-DA
分析不适宜用于牛肝菌种类鉴别。
120 2015, Vol.36, No.24 食品科学 ※成分分析ˉ50ˉ100020ˉ2040ˉ40
100
50
0
ѫᡀ࠶
3 ѫᡀ࠶
2
a
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 ˉ202040 ˉ40ˉ 50ˉ1000 1234567891050100b ѫᡀ࠶3 ѫᡀ࠶ 1
图 2 MSC+SD+ND(15∶5)(a)和SNV+SD+ND(15∶5)(b)
预处理后PLS-DA分析的三维得分图
Fig.2 3D score plot of PLS-DA after MSC + SD + ND (15∶5) (a) and
SNV + SD + ND (15∶5) (b) pretreatment
0 0
20
40
60
80
100ˉ5ˉ10ˉ20510 12345678910ѫᡀ࠶ 2ѫᡀ࠶ 19ṧ૱
图 3 OSCW预处理后PLS-DA分析的三维得分图
Fig.3 3D score plot of PLS-DA after OSCW pretreatment
OSCW预处理后的光谱数据进行PLS-DA分析,结果
见图3,基于OSCW建立的PLS-DA分类模型能够很好地
将不同种类牛肝菌样品区分开,可用于不同种类牛肝菌
的鉴别分析。图中9#样品与该类(华丽牛肝菌)其他样
品的距离较远,结果与马氏距离分类判别模型中9#样品
分类错误的结果一致。与图2相比,OSCW红外光谱预处
理方法能够更有效地去除与分类变量无关的信息,保留
有用信息,为不同种类牛肝菌的鉴别分析提供更可靠的
依据。
3 结 论
采用傅里叶变换红外光谱法测定了10 种牛肝菌的
红外光谱,根据牛肝菌的红外吸收峰分析其成分特征。
应用平滑、求导、MSC、SNV、OSC-小波压缩等方法
对原始光谱进行优化处理。结果显示MSC+SD+ND
(15∶5)和SNV+SD+ND(15∶5)两种预处理方法前
10 个主成分累积贡献率均在95%以上,OSCW预处理方
法能有效去除与牛肝菌种类无关的干扰信息提高光谱分
析的准确度。
基于MSC+SD+ND(15∶5)和SNV+SD+ND
(15∶5)预处理方法建立马氏距离分类判别模型,验证
集样品的预测正确率分别为90%和95%,得到满意的结
果。马氏距离分类模型不仅可以预测牛肝菌分类结果,
而且可以看出与某一牛肝菌样品最相近的种类及到该种
类的马氏距离,此方法可为牛肝菌等食药用真菌的物
种鉴定、鉴别提供科学依据。经预处理后的光谱数据
分别进行PLS-DA分析,结果显示,用MSC+SD+ND
(15∶5)和SNV+SD+ND(15∶5)预处理结合PLS-DA
分析,不能有效区分牛肝菌种类,不适宜牛肝菌种类鉴
别分类;OSCW预处理后的光谱数据进行PLS-DA分析,
能够明显区分不同种类牛肝菌样品,结果满意,可用于
野生食用菌种类鉴别分析。
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