全 文 ：青藤碱对肾小管上皮细胞转分化相关
基因表达的影响＊
＊　本课题为浙江省自然科学基金资助项目(No.Y204488)①　浙江省杭州市中医院肾病实验室　(杭州　310007)
杨汝春①　王永钧①　林京莲①　朱晓玲①　王　军①　鲁　盈①
　　〔摘　要〕　目的:探讨青藤碱干预炎症介质诱导的肾小管上皮细胞转分化及其相关基因的表达作用。方法:IL-1β
(10 ng/ml)诱导体外培养的小鼠肾小管上皮细胞株(MCT), 同时用青藤碱(10 μmol/ L、100 μmol/ L、500 μmol/ L 和
1 000 μmol/ L)进行干预。应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别测定细胞平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生
长因子 β(TGF-β)和纤连蛋白(Fn)的基因表达。 结果:结果:IL-1β 能够显著诱导肾小管上皮细胞α-SMA 的基因
表达上调 ,同时伴随着 TGF-β 和 Fn 的基因表达显著上调;而青藤碱各个浓度均具有显著抑制肾小管上皮细胞转分
化作用 , TGF-β 和 Fn 的基因表达也随之下调。结论:青藤碱可显著抑制 IL-1β 刺激下的肾小管上皮细胞转分化标
志物和细胞外基质的基因表达 ,其机制可能与部分下调TGF-β的表达有关。
〔关键词〕　青藤碱　肾小管上皮细胞　平滑肌肌动蛋白　白介素-1β　
Effects of Sinomenine on the Expression of Correlative Gene on Tubular
Epithelial Myofibroblast Transdifferentiation
YANG Ruchun , WANG Yongjun , LIN Jinglian , et al
Laboratory of Nephropathy in Hangzhou Traditional Medicine Hospi tal , Hangzhou (310007)
　　ABSTRACT　Objective:To expo re the effects o f Sinomenine on the expression of co rrelative gene on tubular epithelial
myofibroblast transdifferentiation.Methods:Cultured mouse tubular epithelial cell line(MCT)in vitro.IL-1β(10 ng/ ml)
was used to stimulate the expression ofα-smooth muscle actin(α-SMA)in MCT as model g roup.The cells of SIN g roups
were co-incubated with SIN(10 μmol/ L、100μmol/ L、500 μmol/ L 、1 000 μmol/ L)at same time.The cells without IL-
1β and SIN w as contro l g roup.α-SMA 、TGF-βand Fn mRNA w ere detected by using reverse transcription-polymerase
chain reaction analyses(RT-PCR).Results:IL-1β could upregulate the expression o fα-SMA、TGF-β and Fn on gene
liver distinctly in mice tubular epithelial cells.Sinomenine could dose-dependently reduce the gene expression of aboved-
mentioned indexes.Conclusion:Sinomenine could reduce the transdifferentiation of renal tubular epithelial cells stimulated by
inflammatory facto r and prevent renal interstitial fibrosis.
KEY　WORDS　Sinomenine　Renal tubular epithelial cells　α-smooth muscle actin　IL-1β
　　病理条件下 ,肾小管上皮细胞可转分化为肌成
纤维细胞 ,直接参与肾间质纤维化过程 。细胞骨架
蛋白α-SMA是肌成纤维细胞的表型标志物 ,肾小
管上皮细胞表达α-SMA 提示其出现转分化现
象[ 1] ,则可以了解病变程度 ,帮助判断预后 。国内
外研究发现 IL-1β可体外诱导肾小管上皮细胞发
生转分化 ,可能通过 TGF -β途径或部分通过诱导
TGF-β产生 ,再经其下游分子起作用[ 2 ,3] 。
青藤碱是从抗风湿中药青风藤中提取的生物
碱单体 ,现代药理研究表明该药具有抗炎及调节免
疫的功能 ,在风湿性疾病中具有确切的疗效[ 4] 。近
年来由于其副作用小 ,在肾脏疾病治疗中得到应
用 。实验表明青藤碱能降低循环免疫复合物 ,减少
蛋白尿和改善肾功能[ 5] 。但是否有助于青藤碱防
治肾小管间质纤维化尚不明确 。本实验拟通过观
察青藤碱对肾小管上皮细胞转分化及相关因子的
影响 ,进一步探讨其肾保护的作用和机制 。
材料与方法
1　主要试剂　rhIL -1β(北京宝赛生物技术
公司)、青藤碱纯品(西安天成医药生物公司)、
DMEM/F12培养基(Gibco)、胎牛血清(杭州四季
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青生物技术公司)、RNA提取试剂 Trizol、逆转录扩
增试剂盒 、引物(均购自上海生物工程公司)。
2　实验方法
2.1　小鼠肾小管上皮细胞株(MCT)传代培
养　小鼠肾小管上皮细胞株 MCT 由法国巴黎第
七大学 Gerard 教授惠赠。将细胞复苏后 , 用含
10%胎牛血清的 DME M/F12培养液(内含青链霉
素各100 U/ml 、转铁蛋白 5 μg/ml)培养 ,消化传代
采用 0.25%胰酶-0.02%EDTA ,培养条件为 5%
CO2 、37 ℃。
2.2　实验分组　将体外培养的 MCT 细胞分
为以下几组:(1)正常对照组:用普通培养液培养;
(2)模型组:在培养液中加入 IL -1β ,使其终浓度
为 10 ng/ml;(3)青藤碱各浓度治疗组:在模型组的
基础 上 加 入 青 藤 碱 , 使 其 终 浓 度 分 别 为
10 、100 、500 、1 000 μmol/L。
2.3 　RT -PCR方法检测 α-SMA 和 Vi-
mentin mRNA表达　将 MCT 细胞传代于培养瓶
中 ,待长至 60%～ 70%融合时用无血清培养液同
步24 h ,再加入上述各组试剂培养 24 h 。去上清 ,
用预冷的 PBS 液洗涤 1 ～ 2次 。Trizol试剂提取各
组细胞总 RNA ,两步法进行逆转录和产物聚合酶
链扩增反应(RT -PCR), GAPDH 作为内参照 。
PCR反应条件为:95 ℃ 5 min;95 ℃30 s , 56 ℃
30 s , 72 ℃30 s , 35个循环;72 ℃10 min;扩增产物
经1.7%琼脂糖凝胶电泳后 ,凝胶成象系统成像 ,用
Bio Rad quanity one 软件对条带进行半定量分析 ,
α-SMA 和 VimentinmRNA 的相对含量分别用其
与GAPDH 特异性条带的积分光密度之比值表示 。
引物序列:α-SMA(520 bp):上游 5′CTGAA-
GAGCATCCGACAC 3′, 下游 5′GACTCCATCC-
CAATGAAAG 3′;TGF -β (423 bp):上游 5′
GGCGGTGCTCGCGCTTTGTA 3′,下游 5′CCCT-
GTA TTCCGTCTCCTT 3′;Fn(430 bp):上游 5′
CTGAAGTCACTTCTCGGGGTGC 3′, 下游 5′GCA-
CAACAGACCACCAAACTCG 3′;GAPDH(307 bp):上
游 5′GCAGTGGCAAAGTGGAGATTG 3′, 下游 5′
GCAGAAGGGGCGGAGATGAT 3′。
3　统计学方法　用 SPSS 11.5软件对数据进
行分析处理 ,计量资料用( x ±s)表示 ,组间比较采
用 t 检验 , P<0.05为有统计学差异。
结　　果
α-SMA mRNA 在正常 MCT 细胞呈极微弱
表达 , IL -1β(10 ng/ml)能使 MCT 细胞α-SMA
基因表达上调近 6 倍 ,与正常组比较有明显差异
(P <0.01)。青藤碱各浓度干预均能显著抑制
MCT 细胞α-SMA基因表达 ,并随青藤碱浓度升
高而逐渐下降 ,呈一定的剂量依赖关系 。 IL -1β
亦可刺激 MCT 表达 TGF -β 和 Fn mRNA 增加
(P <0.05);浓度为 10 、 100 的青藤碱有下调
TGF-β mRNA表达的趋势 , 但没有统计学意义 ,
当青藤碱浓度达 500 、1 000 μmol/L 时 ,则可显著
下调 TGF -β mRNA 的高表达(P <0.05)。以上
各浓度青藤碱都可显著降低 MCT Fn mRNA 的表
达 。见图 1 ～ 图 4 、表 1 。
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表 1　青藤碱对肾小管上皮细胞α-SMA 、TGF-β 和 Fn m RNA表达的影响　( x±s)
组　别 α-SMA/ GAPDH　　 TGF-β/ GAPDH　　 Fn/GAPDH　　
正常组 0.143±0.021 1.055±0.075 1.620±0.489
模型组 0.987±0.239■ 1.823±0.432■ 1.909±0.376■
青藤碱 10 μmol/ L 0.649±0.137■＊ 1.418±0.273■ 1.647±0.337＊
青藤碱 100 μmol/ L 0.603±0.141■＊ 1.456±0.210■ 1.660±0.315＊
青藤碱 500 μmol/ L 0.076±0.001■■＊ 1.237±0.461＊ 1.580±0.258＊
青藤碱 1 000 μmol/ L 0.426±0.061■＊ 1.093±0.447＊ 1.415±0.314＊＊
　注:与正常组比较 , ■P <0.05 , ■■P<0.01;与模型组比较 , ＊P<0.05 , ＊＊P<0.01
讨　　论
近年来研究表明 ,肾小管-间质损害程度与肾
脏预后的关系甚至较肾小球损害更为密切 。肾间
质纤维化几乎是各种肾脏疾病进展至终末期肾衰
竭的共同表现和主要病理基础 。肌成纤维细胞与
肾间质纤维化的发生关系最为密切 ,是肾间质纤维
化的重要效应细胞。在肾间质纤维化相关的动物
模型中 ,肌成纤维细胞数量增加部分归因于肾小管
上皮细胞的转分化。此项研究结果显示 ,正常组细
胞呈鹅卵石形 ,在浓度为 10 ng/ml IL -1β 刺激肾
小管上皮细胞 48 h ,可诱导细胞表型发生改变 ,细
胞及细胞核变大 ,形状由鹅卵石变成梭形;诱导细
胞 24 h即可使α-SMA 、TGF-β的基因表达显著
升高 ,细胞外基质成份 Fn的基因表达也同时上调 。
尽管已经认识到抑制肾间质纤维化在肾功能
预后中的重要性 ,但目前用于临床的有效防治肾间
质纤维化和细胞表型转化的药物非常有限 ,且其应
用和作用也存在着一定的局限性 ,而中药在防治肾
硬化和纤维化方面具有比较好的临床疗效和优势 ,
因此近年来国内的一些研究者将目光投向了中医
中药 。
青藤碱是从防己科植物青风藤中提取的生物
碱单体 ,研究表明抗炎效果确切[ 8] ,能明显抑制
IL-1β 、IL-2等炎症介质和细胞因子的蛋白质合
成和基因表达[ 6 , 7] ;药理研究也显示它具有明显的
抗炎和免疫抑制作用 ,临床上多用于长期治疗类风
湿性关节炎等风湿免疫性疾病[ 4] 。
本研究显示:青藤碱各浓度均可显著下调肾小
管上皮细胞α-SMA 的基因表达 ,并呈一定的剂量
依赖关系 ,而 Fn mRNA表达同时下调 。此结果提
示青藤碱可抑制 IL-1β诱导的肾小管上皮细胞表
型转化以及细胞外基质(ECM)合成的增加 。本研
究还显示 ,低浓度的青藤碱(10 、100 μmol/L)对 IL
-1β刺激后 MCT 细胞TGF-β的基因表达没有显
著抑制作用 ,但高浓度青藤碱(500 、1 000 μmol/ L)
可显著抑制肾小管上皮细胞 TGF -β的基因表达 。
结果提示青藤碱阻逆肾小管上皮细胞转分化 , Fn
mRNA 上调作用可能部分通过 TGF -β途径。
该结果在细胞和分子生物学水平证明祛风中
药青风藤主要提取物青藤碱在治疗肾病或延缓肾
病发展的有益作用。
参　考　文　献
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duces human proximal tubule cell injury , α-smooth muscle
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2002 , 62(1):31-40.
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8.田桂芝 , 庞炳三.青风藤的功效与药用价值.西安联合大
学学报(自然科学版), 2000 , 3(2):26-30.
(收稿:2005-08-16　修回:2005-10-30)
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