全 文 ：细胞生物学杂志 Chinese Journal of Cell Biology 2007, 29: 267-271 http://www.cjcb.org
适用于生命科学各研究领域的宝尔超纯水系统，使实验数据更逼真 Tel: 021-64040161 www.baolor.com
收稿日期: 2006-10-12　　接受日期: 2006-11-28
国家自然科学基金 (No.30472167) 和河北省自然科学基金(No.
C2005000722) 资助项目
*通讯作者。 Tel: 0311-86265563, E-mail: hanmei@hebmu.edu.cn
旋覆花内酯抑制血管平滑肌细胞炎性应答与
阻断NF-kB活化有关
刘月平　韩　梅*　温进坤　郑　斌
(河北医科大学基础医学研究所, 河北省医学生物技术重点实验室, 石家庄 050017)
摘要　　应用免疫细胞化学染色及Western 印迹检测血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle
cells, VSMC) 环加氧酶-2 (cyclo-oxygenase-2, COX-2) 表达、NFkB抑制蛋白a (IkB-a)水平和NF-
kB p65 核转位的变化; 电泳迁移率改变分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)确定旋覆花
内酯(1-o-acetylbritannilactone, ABL) 对核内 NF-kB p65与DNA调控元件的结合活性的影响。结果
表明, 脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS) 处理的VSMC, p65核转位加快,细胞核内的NF-kB p65 水平
快速升高, 同时伴有IkB-a的减少; 用ABL预处理VSMC后, LPS诱导的p65核转位增加及IkB-a
减少受到明显抑制, 抑制作用呈剂量依赖性。EMSA结果显示, LPS处理VSMC, 其核蛋白与含有
NF-kB 结合位点的探针的结合活性升高; 而用ABL 预处理的 VSMC, LPS 诱导的核蛋白与探针结合
活性的升高受到明显抑制。进而, ABL对NF-kB活化启动的下游炎性基因COX-2 表达也具有较强
的抑制效果。因此, ABL是一种抗炎物质, 通过抑制NF-kB活化和炎性基因COX-2的表达而减弱
或消除LPS诱导的VSMC炎症应答反应。
关键词　　旋覆花内酯; 血管平滑肌细胞; NF-kB; 炎症反应
动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄和高血压
等心血管疾病是由多种因素对血管内皮刺激所触发
的慢性炎症反应, 伴随发生的血小板活化和聚集、单
核细胞黏附及炎性介质的释放和由此导致的VSMC
由中膜向内膜下迁移和增殖均属于炎症相关事件。
VSMC 作为主要的细胞成分, 在血管炎性病变发生发
展过程中, 约有上百种基因表达出现异常, 进而引起
细胞表型与功能的改变。基因调控区序列同源性比
对分析发现, 在炎性因子诱导下VSMC表达异常的基
因大多受核因子-kB (nuclear factor-kB, NF-kB) 的反
式激活[1]。因此, 调制血管细胞NF-kB活性, 阻断炎
性应答信号通路, 减少血管损伤部位炎性介质的释放,
已成为目前研究新型抗心血管疾病药物的重要策
略。欧亚旋覆花是一种用于治疗偏头痛的传统中药,
具有消炎、镇痛、活血化瘀的功效, 我们用有机溶
剂萃取法从欧亚旋覆花中分离得到一种具有抗炎镇痛
作用的单体——旋覆花内酯(1-o-acetylbritannilactone,
ABL), 并证实ABL对LPS 诱导的单核/巨噬细胞活化
和COX-2基因表达具有显著抑制作用[2]。而VSMC
是单核/巨噬细胞源性炎性因子作用的主要靶细胞,
为确定 ABL 对VSMC 炎症应答的影响,本研究观察
ABL 对 LPS 诱导的VSMC NF-kB 活化及其下游基因
表达的抑制效应, 并初步探讨其机制。
1 材料与方法
1.1 材料
ABL 由我校药学院分离及鉴定, 其化学结构见
图1。SD大鼠由河北省实验动物中心提供; DMEM
培养基购自Promega; 引物由上海生工生物技术公司
合成, 凝胶阻滞分析系统 (Promega); NF-kB p65 多克
隆抗体、COX-2单克隆抗体、IkB-a单克隆抗体购自
Santa Cruz; [g-32P]ATP 购自北京福瑞生物工程公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及实验分组 采用5周龄SD大
图1　ABL化学结构式
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鼠, 取其胸腹主动脉, 按贴块法分离培养VSMC, 待
VSMC爬满瓶底后, 用0.25%胰蛋白酶消化传代, 取
4~6代细胞进行实验。传代培养的细胞在含10% 胎
牛血清的 DMEM培养液中生长至 70%~80% 汇合
时, 无血清饥饿培养24 h, 使细胞处于静止期, 分别加
入10 mg/ml LPS 或用不同浓度(5、10、20 mmol/L)
的ABL预温育1 h 后, 再加LPS 处理不同时间, 收集
细胞用于下列实验。
1.2.2 核蛋白提取及电泳迁移率改变分析 (electro-
phoretic mobility shift assay, EMSA) 不同条件处
理的细胞用冷PBS洗涤3次后, 按文献[3]方法提取核
蛋白, 用改良的Lowry 法进行蛋白质定量。EMSA
按照Promega 公司的试剂盒说明书进行。将含有
NF-kB顺式作用元件模体(5 -AGTTGAGGGGACTT-
TCCCAGGC-3) 的双链寡核苷酸片段用 [g-32P]ATP
进行5末端标记。取0.1 pmol 标记探针(2 000 cpm)
与5 mg 核蛋白在20 ml 结合缓冲液 [20%甘油, 5
mmol/L MgCl2, 2.5 mmol/L EDTA, 2.5 mmol/L DTT,
250 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 2 mg
poly(DI-dC)]中室温反应20 min, DNA-核蛋白复合
物经5% PAGE分离后, 于-70 ℃放射自显影。
1.2.3 细胞总蛋白提取及Western 印迹 收集各
组细胞用冷PBS洗涤3次后, 将细胞重悬于细胞裂解
液 (1% NP40, 150 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris-HCl,
pH 7.5, 10% 甘油, 1 mmol/L Na3VO4, 1 mmol/L PMSF)
中, 冰浴 30 min, 使细胞充分裂解。4 ℃, 8 000 r/min
离心10 min, 收集上清液, 用改良的Lowry法进行蛋
白定量。取等量蛋白质样品经 SDS-PAGE 分离后,
电印迹至PVDF膜, 按文献[4]方法, 将印迹的PVDF膜
置于5%脱脂奶粉中封闭, 依次与第一抗体、第二抗
体结合, 抗体结合区带用化学发光法检测。
1.2.4 细胞免疫化学染色 培养在玻片上的
VSMC经4% 多聚甲醛室温固定15 min, PBS洗3次。
1% Triton X-100室温透化处理20 min, PBS 洗3次。
5%正常羊血清封闭后, 分别加入抗p65 (1∶200)、
抗 IkB-a (1∶200) 或抗 COX-2 (1∶ 00) 抗体, 4 ℃
温育过夜, PBS洗3 次。滴加生物素-辣根过氧化
物酶标记的二抗, 37 ℃温育 1 h, PBS洗3 次。DAB
显色后, 于镜下观察。阴性对照用PBS替代一抗, 随
机选取5个视野, 计数核p65阳性染色细胞。
1.2.5 MTT分析 生长于96孔板中的VSMC 用
不同浓度的ABL分别处理1 h、16 h 后, 每孔加入
20 ml 5 g/L MTT, 37 ℃温育4 h , 弃去培养基, 每孔加
入100 ml二甲基亚砜静置10 min, 用酶标仪490 nm
处测定各组细胞(6个孔)的A值, 以此表示细胞的相
对活力。
1.2.6 统计学处理 实验结果采用x－ ± s表示, 组
间资料应用单因素方差 (One way ANOVA) 分析, 各
项统计均用 SPSS 10.0 软件在计算机上完成。
2 结果
2.1 ABL抑制LPS诱导的VSMC NF-kB核转位
Western 印迹结果显示, 在处于静止期的VSMC
中, NF-kB p65在胞浆和胞核的分布均较少。给予
LPS刺激后, VSMC核内的NF-kB p65 水平逐渐升
高, 于刺激10 min 时达高峰, 1 h 后逐渐降低, (结果未
显示)。用不同浓度(5、10、20 mmol/L)的ABL预
处理VSMC 后, LPS 诱导的p65水平升高及核转位
增加受到明显抑制(图 2A), 抑制作用的强度呈剂量
依赖性。免疫组化染色可见, LPS 处理的VSMC, 其
细胞内 p65在核内的分布明显增多 核内出现较多的
棕黄色阳性颗粒。不同浓度(5、10、20mmol/L)的
ABL预处理的VSMC再用LPS刺激后, 核p65阳性染
色的细胞数明显减少(图2B)。在上述 LPS或ABL刺
激条件下, 细胞的相对活力无明显差异, 说明这些变
化并非细胞毒作用。结果表明ABL可抑制LPS诱导
的NF-kB p65表达与核转位。
2.2 ABL抑制LPS诱导的VSMC IkB-a降解
NF-kB的核转位是继发于IkB-a磷酸化降解之
后的事件。为了确定ABL抑制NF-kB核转位的上游
机制, 本研究进一步观察了ABL处理后, 由LPS诱导
的IkB-a降解的变化。结果显示, LPS处理的VSMC,
其胞内IkB-a水平明显降低。而且, LPS诱导IkB-
a减少幅度与NF-kB核转位速率具有明显的正相关
关系。而用不同剂量ABL (10、20 mmol/L) 预处理
的VSMC, LPS 诱导的IkB-a减少受到明显抑制, 与
未经ABL 预处理的细胞比较, 胞浆IkB-a水平未出
现明显的降低(图3)。提示ABL可能具有抑制IkB-
a降解, 提高其稳定性的作用。
2.3 ABL抑制LPS诱导的p65与DNA顺式元件
的相互作用。
为了确定ABL是否影响核内NF-kB p65与DNA
调控元件的结合活性, 以5末端标记的含有NF-kB结
合模体的双股寡核苷酸为探针, 分别与不同条件处理
的VSMC核蛋白进行结合反应。DNA-核蛋白复合
物经电泳分离后, 放射自显影可见, LPS 刺激的VSMC
269刘月平等: 旋覆花内酯抑制血管平滑肌细胞炎性应答与阻断NF-kB活化有关
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核蛋白与探针的结合活性明显升高, 由DNA-核蛋白
复合物形成的滞后迁移区带可被100倍过量的非标
记探针所消除, 而经ABL(10、2 mmol/L)预处理的
VSMC, LPS诱导的核蛋白与探针结合活性的升高受
到抑制, 且ABL的抑制效应具有剂量依赖关系(图 4)。
2.4 ABL抑制NF-kB依赖的炎性基因的表达
为了观察ABL抑制NF-kB 活化后对下游炎性基
因表达的影响, 本实验检测了炎性标志物COX-2在
VSMC中的表达。结果如图5, 正常培养的VSMC中
图2　ABL 对LPS诱导的VSMC NF-kB p65核转位的抑制作用
(A) ABL抑制LPS诱导的NF-kB p65核转位的 Western 印迹; (B)
免疫细胞化学染色(SP, 200×)。1: 未经任何处理的VSMC; 2~5:
ABL (0、5、10、20 mmol/L)预温育1 h后再换用LPS刺激1 h。
与LPS处理组相比, *P<0.05。
(A)
图3　ABL抑制LPS诱导的VSMC IkB-a的降解
(A) IkB-a的Western印迹分析; (B) IkB-a免疫细胞化学染色(SP,
200×)。1: 未经任何处理的VSMC; 2~4: ABL (0、10、20 mmol/L)
预温育1 h 后再换用LPS刺激1 h。与 LPS处理组相比, *P<0.05。
(B)
(A)
图4　EMSA检测ABL对VSMC NF-kB-DNA结合活性的影响
1: 游离探针; 2: 100倍未标记NF-kB寡聚核苷酸冷探针; 3: 对照组; 4~6:
ABL (0、1、20 mmol/L)预温育1 h后再换用LPS刺激60 min。
图5　ABL抑制LPS诱导的VSMC COX-2表达
(A)COX-2的Western 印迹分析; (B) COX-2的免疫细胞化学染色。
1: 未经任何处理的VSMC; 2~4: ABL (0、5、10 mmol/L) 预温育
1 h后再换用LPS刺激16 h。与LPS处理组相比, *P<0.05。
(B)
(A)
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几乎检测不出COX-2; LPS刺激16 h后, COX-2水
平明显升高, 约是对照组的2.6 倍。低剂量(5 mmol/L)
ABL预处理的 VSMC, 对LPS诱导的 COX-2 表达影
响不明显; 而中等剂量(10 mmol/L) ABL 即可明显抑
制 LPS 对 COX-2 表达的诱导活性(P<0.05), COX-2
免疫区带变浅(图5A), 相对COX-2水平下降约 60%,
接近至本底。免疫细胞化学染色也得到相似的结果
(图5B)。
3 讨论
慢性炎症反应是动脉粥样硬化、血管成形术后
再狭窄等心血管疾病发生发展的重要原因[5]。VSMC
是构成各种慢性血管炎症性疾病的主要细胞成分之
一。病变局部产生的各种细胞因子和/或致炎因子
通过自分泌和旁分泌作用来调节VSMC的生物行为
和功能, 已有研究显示, 参与血管炎症反应的基因多
达160 多种, 其中绝大多数受控于NF-kB[6]。因此,
NF-kB是血管炎症发生和发展的关键转录调控因子。
通过抑制NF-kB活化而进行的抗炎治疗已成为
防治该类心血管疾病的新策略。尽管目前用于治疗
的抗动脉粥样硬化药物可通过调整内皮功能而对血
管炎症的启动和进展具有一定的缓解作用, 但它们对
VSMC炎症应答的抑制作用尚不明确[7]。近年有人
试图通过用抑制剂阻断NF-kB 活化以达到防治动脉
粥样硬化的目的, 结果令人失望[8]。ABL是欧亚旋覆
花氯仿提取物中含有的一种具有抗炎、止痛的有效
单体, 其对单核/巨噬细胞的活化及炎性介质的释放
具有明显的抑制作用[2], 本研究从VSMC角度观察
ABL的抗炎机制, 结果显示, ABL可显著抑制LPS诱
导的VSMC NF-kB核转位和与顺式元件的结合活性,
其抑制作用的强度呈剂量依赖性。而且证实, ABL
对 NF-kB活化的抑制作用与其减少IkB-a降解、提
高胞浆IkB-a水平有关, 这是ABL抗炎机制与其他类
型NF-kB抑制剂不同的特征。并且在整体水平, 给
与大鼠每天口服(26 mg/kg)旋覆花素, 显著抑制了球
囊损伤术后的新生内膜形成及NF-kB激活(另有文章
发表)。一些研究显示, 受NF-kB调节的下游基因中
既有促炎基因, 也有抑炎基因( IkB-a、IL-10)[9], NF-
kB 特异性抑制剂在抑制血管炎症反应的同时, 也削
弱了机体自身的抗炎功能。而ABL对NF-kB下游基
因表达活性的抑制是具有选择性的。用ABL预处理
的VSMC, 致炎因子诱导的COX-2表达活性被削弱,
但同时IkB-a的水平并未发现明显的降低。IkB-a既
是NF-kB转录激活的下游基因之一, 也是NF-kB活化
的抑制因子, 通过与NF-kB结合而使后者以非活性形
式存在于胞浆中, 各种因素诱导的IkB-a磷酸化及与
NF-kB的解离和降解是NF-kB活化的初始步骤[10,11]。
因此, 降低IkB-a磷酸化水平, 提高 IkB-a稳定是抑
制NF-kB 活化的有效途径。ABL可快速抑制LPS诱
导的IkB-a降解, 并在较短时间内使其水平恢复至正
常状态, 说明ABL对NF-kB 活性的抑制是具有选择
性的。上述结果提示, ABL对VSMC炎症应答具有
调制作用, 通过选择性抑制促炎基因表达, 提高IkB-
a稳定性而抑制VSMC炎症表型的持续, 后者是阻断
或缓解动脉粥样硬化和血管再狭窄的发生发展所必
需的。因此, ABL是一种具有良好应用前景的抗血
管慢性炎症性疾病的有效单体。
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271刘月平等: 旋覆花内酯抑制血管平滑肌细胞炎性应答与阻断NF-kB活化有关
适用于生命科学各研究领域的宝尔超纯水系统，使实验数据更逼真 Tel: 021-64040161 www.baolor.com
1-o-acetylbritannilactone Inhibits Inflammatory Response by
Suppressing NF-kB Activation
Yue-Ping Liu, Mei Han*, Jin-Kun Wen, Bin Zheng
(Laboratory of Medical Biotechnology, Institute of Basic Medical Science, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China)
Abstract Immunocytochemistry and Western blot analysis were adopted to measure the nuclear translo-
cation of NF-kB p65 and the expression of IkB-a, cyclo-oxygenase-2 (COX-2). Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA) was performed to detect DNA-binding activity of NF-kB in vascular smooth muscle cells (VSMC) pre-
treated with ABL. Western blot and immunocytochemistry analysis showed that lipopolysaccharide (LPS) treatment
resulted in increasing nuclear translocation of NF-kB p65, and declining levels of IkB-a in VSMC. However, 1-o-
acetylbritannilactone (ABL) pretreatment inhibited the nuclear translocation of p65 and degradation of IkB-a in-
duced by LPS, and the inhibitory effect of ABL was concentration-dependent. LPS increased the binding of nuclear
extracts from VSMC induced by LPS to double strands oligonucleotide probe containing NF-kB binding site using
EMSA. The shift bands were abolished when a 100-fold excess of unlabeled NF-kB oligonucleotide probe was
included. Pretreatment with ABL significantly reduced the nuclear level of NF-kB and declined the binding activity of
nuclear extracts with DNA probe induced by LPS. Furthermore, ABL consequentially inhibited the expression of
NF-kB-dependent COX-2 gene induced by LPS. These results suggest that ABL may be one anti-inflammatory drug
which inhibits the expression of COX-2 gene by blocking NF-kB activation and thus suppresses the inflammatory
response to LPS in VSMC
Key words 1-o-acetylbritannilactone; NF-kB; vascular smooth muscle cells; inflammation
Received: October 12, 2006 Accepted: November 28, 2006
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30472167) and the Natural Science Foundation of
Hebei Province (No.C2005000722)
*Corresponding author. Tel: 86-311-86265563, E-mail: hanmei@hebmu.edu.cn