全 文 ：黑曲霉 CGMCC0774和朱红密孔菌 CGMCC1115
两步转化阿魏酸制备生物香兰素
郑　璞1 ,郑丽蓉1 ,孙志浩1 ,王明君1 ,白彦兵2 ,汪　军2 ,过鑫富2
(1.江南大学　生物工程学院生物催化研究室 ,工业生物技术教育部重点实验室 ,无锡　214036;
2.浙江杭州鑫富药业股份有限公司 ,杭州　311300)
摘　要:在 25 L 发酵罐中黑曲霉 Aspergillus niger CGMCC0774 转化阿魏酸可生成香草酸 2.24 g L , 摩尔转化率
64.6%;朱红密孔菌 Pycnoporus cinnabarinus CGMCC1115 转化提取的香草酸可生成香草醛 1.45 g L , 摩尔转化率为
79.9%。将两步微生物转化有机串联 , 即用黑曲霉转化液加预先培养的朱红密孔菌 Pycnoporus cinnabarinus CGM-
CC1115 菌丝体继续转化 , 可产香草醛 1.06 g L, 对原料阿魏酸的摩尔转化率 34.0%。用米糠提取的天然阿魏酸做原
料 ,两步串联微生物转化制备的生物香兰素经13C 同位素的分析 ,符合生物香草素的等同要求。
关键词:阿魏酸;香草酸;香草醛;黑曲霉;朱红密孔菌;微生物转化
中图分类号:Q819　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1672-3678(2005)03-0069-05
Preparation of bio-vanillin with two-step bioconversion by Aspergillus niger
CGMCC0774 and Pycnoporus cinnabarinus CGMCC1115
ZHENG Pu
1 ,ZHENG Li-rong1 ,SUN Zhi-hao1 ,WANG Ming-jun1 ,
BAI Yan-bing2 ,WANG Jun2 ,GUO Xin-fu2
(1.Laboratory of Biocatalysis , School of Biotechnology , Southern Yangtze University;The Key Laboratory of Industrial Biotechnology ,
Ministry of Education Wuxi　214036 , China;2.Zhejiang Hangzhou Xinfu Pharmaceutical Co Ltd ,Hangzhou　311300 , China)
Abstract:The bio-vanillin production from natural ferulic acid by two filamentous fungi was scaled-up at 25 L
bioreactor level.As a result , vanillic acid production by Aspergillus niger CGMCC0774 from ferulic acid was up
to 2.24 g L , corresponding to a moler yield of 64.6%, and vanillin production by Pycnoporus cinnabarinus
CGMCC1115 from vanillic acid was reached to 1.45 g L with a moler yied of 79.9%.When two-step biotrans-
formation process combined , the system produced 1.06 g L vanillin from ferulic acid with a moler yied of
34.0%.The 13C isotope analysis revealed that the quality of vanillin prepared by the present mcthaol met the
criteria of nature vanillin.
Key words:ferulic acid;vanillic acid;vanillin;Aspergillus niger;Pycnoporus cinnabarinus;microbial transfor-
mation
　　香兰素 ,即香草醛 ,是一种以奶油香草为特征的
风味物质 ,广泛用于冰淇淋 、巧克力 、乳制甜点 、奶油
糖果 、焙烤食品 、豆奶 、可乐饮料和烈酒等食品制造
中 ,堪称世界上使用最广的增香剂[ 1] 。目前世界香兰
繲收稿日期:2005-08-15
基金项目:国家十五攻关项目(2004B7130508)
作者简介:郑　璞(1966-),女 ,副教授 ,主要研究生物催化与生物转化。
　第 3卷第3期
2005年 8月
生 物 加 工 过 程
Chinese Journal of Bioprocess Engineering
Aug.2005
·69　 ·
素的年销量超过1万吨 ,其中以愈创木酚和木质素为
原料合成的香兰素占主导[ 2] 。从香子兰花荚植物中
提取的天然香兰素 ,由于香子兰花荚植物的种植受地
域和气候环境的限制 ,年产量约 20 t ,仅占全球销量
的0.2%,但价格却是化学合成香兰素的 300倍[ 3] 。
欧洲的立法机构建议在食品中使用天然香草醛
(European Direcive 88 388 CEE , JO NO.LI84 , 22nd of
June 1988),美国 FDA(CFR21)规定由天然原料 ,通过
生物催化法(酶作用)获得的香料属天然的。对天然
香草醛的需求 ,加速了生物技术生产香草醛的研究 ,
其中瑞士的奇华顿罗亚有限公司 、德国的哈尔曼及
赖默股份有限公司 、法国国家农业研究所等研究组
在生物香草醛的制备方法上取得了一定进展[ 4 ～ 6] 。
最近法国 Rhodia 公司推出了微生物转化阿魏酸生
产的“生物香兰素”产品 Rhovanil® Natural。国内江
南大学生物催化研究室于 2000年开始开展了两步
微生物转化阿魏酸生产香草醛[ 7] 和大豆粗酶及微生
物转化异丁香酚制备香草醛的研究 ,其中郑志强等
研究了黑曲霉 Aspergillus niger CGMCC0774(SW-33)
转化阿魏酸生成香草酸的条件[ 8] ,王明君等对朱红
密孔菌 Pycnoporus cinnabarinus CGMCC1115(SW0203)
转化香草酸生成香草醛的条件进行了优化[ 9] 。稻米
加工的副产物米糠中含有丰富的阿魏酸[ 10] ,通过微
生物催化水解方法 ,提取其中天然阿魏酸 ,作为生产
原料 ,在发酵罐水平上利用CGMCC0774转化阿魏酸
生成香草酸 、CGMCC1115转化香草酸生成香草醛及
两步转化的串联进行研究 ,为国内“生物香兰素”的
工业生产奠定基础。
1　材料与方法
1.1　材　料
阿魏酸 、香草酸 、香草醛 ,标准品购于 Sigma 化
学试剂公司。生物香草醛(Rhovanil® Natural)、Rhod-
ia特纯香草醛购于法国 Rhodia 公司。合成香草酸 、
米糠油脚由浙江鑫富生化股份有限公司提供 。米糠
市售 。天然阿魏酸:米糠饼和米糠油脚 ,经微生物或
阿魏酸酯酶等水解 , 得到 阿魏酸粗品(含量
87.2%)。25 L 发酵罐:HLF22 型 , BIOENGINEER-
ING 。15 L 发酵罐:BIOSTAT C10-3型 , B.Braun Bio-
tech International。
1.2　微生物菌株
黑曲霉 Aspergillus niger CGMCC0774(SW-33),朱
红 密 孔 菌 Pycnoporus cinnabainrus CGMCC1115
(SW0203),江南大学生物催化研究室选育 ,均为专
利菌株 ,保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普
通微生物保藏中心 。
1.3　培养基及培养条件
斜面培养基:20%马铃薯浸汁 1 000 mL ,葡萄糖
20 g , 琼脂 20 g , pH 自然。种子培养基:麦芽糖
20 g L ,酒石酸二铵 1.82 g L ,KH2PO4 0.2 g L ,CaCl2
1.32 mg L ,MgSO4·7H2O 0.5 g L ,酵母膏 0.5 g L。黑
曲霉 Aspergillus niger CGMCC0774发酵培养基:同种
子培养基。朱红密孔菌 Pycnoporus cinnabarinus CG-
MCC1115发酵培养基:葡萄糖 20 g L ,酵母膏 8 g L ,
KH2 PO4 0.2 g L , CaCl2 1.32 mg L , MgSO4 ·7H2 O
0.5 g L ,pH 5.0。
1.4　培养与转化方法
15 L 或25 L 发酵罐中黑曲霉的培养和对阿魏
酸的转化:装液量 8 L 或 16 L , 罐温 37 ℃,转速
200 r min , 通气 量 1 L min , 接种量 10%, 罐压
0.1MPa 。生长约 48 h ,加入终质量浓度为 1 ～ 4 g L
的底物阿魏酸 ,每 6 h 跟踪测定 , 当香草酸最大时
(48 ～ 60 h),放罐。(pH 、溶氧等参数为罐上在线显
示)。
25 L发酵罐中朱红密孔菌的培养和对香草酸的
转化:装液量 16 L ,10%接种量 ,温度 30 ℃,转速 100
r min ,发酵阶段通气量 16 L min ,培养约 48 h ,加入
终质量浓度为2 g L 的底物 ,同时温度升至35 ℃,通
气量降为 5 L min ,加入底物后 12 h以 10%(质量体
积比)加入吸附剂 ,每 6 h跟踪测定 ,当香草醛最大
时 ,放罐 。(pH 、溶氧等参数为罐上在线显示)。
1.5　两种微生物的串联转化
黑曲霉转化天然阿魏酸生成的香草酸发酵液过
滤除菌 ,清液处理后 ,与培养好朱红密孔菌游离菌丝
体混合 ,35 ℃下转化生成香草醛。
1.6　阿魏酸 、香草酸和香草醛HPLC测定[ 11]
样品进样前用 0.22 μm 的微孔滤膜过滤处理 ,
滤液立即上 HPLC 进行分析 ,用 C18柱(LiChrospher
100 RP-18 ,5μm ,125×4mm),检测波长 280 nm ,柱温
30 ℃,流动相流速为 1 mL min ,由 A 、B 两种溶液组
成(A:0.01%的醋酸溶液和 B:甲醇),比例为 7∶3 ,用
外标法进行定量。
1.7　香草醛13C同位素测定
由中国石化石油勘探开发研究院石油地质研究
所协助测试 。
　·70　 · 生物加工过程 第3卷第3期
2　结果与讨论
2.1　15 L发酵罐中黑曲霉转化阿魏酸生成香草酸
在 15 L 全自动发酵罐中接种黑曲霉 CGM-
CC0774进行发酵。由图 1可见 ,接种发酵 10 h ,溶
氧下降到 60%,生物量快速增加;菌体生长 44 h时 ,
加入 10 g L的无菌阿魏酸钠盐溶液 1 L。同时发酵
pH逐步下降 ,当 48 h时溶氧接近 20%,菌体生长进
入稳定期 。此时加入底物进行转化的初期(0 ～ 8 h)
菌体耗氧较少 ,表明菌体对底物有一个适应的过程 ,
随着转化的进行 ,香草酸的生成 ,溶氧也不断下降 ,
表明黑曲霉对阿魏酸的转化过程是一个需氧过程 。
转化阶段 ,pH维持在 4.0 ～ 4.5间 ,菌体量基本保持
稳定 。取样观察 ,菌丝球形态未发生改变 ,但颜色由
嫩黄变为白色 ,转化液清亮并可闻到香草酸特有的
气味 。发酵罐中菌体的生长与对底物的转化速度都
优于摇瓶水平(表 1)。转化 34 h时 ,阿魏酸基本耗
尽 ,香草酸浓度为 0.51 g L , 相应的摩尔转化率为
83.3%,菌体生物量(菌体干重)可达到 4.8 g L。
— △—生物量;— □—pH;— ○—溶氧;
— ◎—阿魏酸;— ◆—香草酸
图 1　黑曲霉CGMCC0774发酵转化过程
Fig.1　Fermentation and conversion of ferulic acid by Aspergillus
niger CGMCC0774
表 1　摇瓶与 15 L发酵罐产香草酸情况比较
Table 1　Comparison of vanillic acid yield between flask and 15 L
fermentation
250 mL三角摇瓶 15 L发酵罐
生物量(干重) (g L) 4.2 4.8
香草酸 (g l) 0.455 0.506
摩尔转化率 % 57.81 83.32
发酵转化周期 h 96 78
2.2　25 L 发酵罐中黑曲霉对高底物质量浓度的转
化
虽然黑曲霉 CGMCC0774菌株在 15 L 发酵罐中
对阿魏酸的摩尔转化率可达 83.3%,但产物香草酸
含量较低 ,为 0.50 g L。若发酵液作为含香草酸溶
液直接用于朱红密孔菌 CGMCC1115生产香草醛 ,则
CGMCC1115转化底物香草酸的质量浓度过低。研
究表明 CGMCC1115转化较佳香草酸的质量浓度在
1 ～ 2 g L[ 9] ,本文对提高黑曲霉转化底物的质量浓度
进行试验 。将阿魏酸质量浓度提高到 4 g L ,分别采
用直接添加和一次补加方法 ,在 25 L 发酵罐上进行
比较。A:在菌体生长进入稳定期后 ,加入 64 g 阿魏
酸调成的无菌阿魏酸钠盐溶液1 L(测得底物终质量
浓度3.3 g L);B:在菌体生长进入稳定期后 ,先加
入 36 g阿魏酸调成的无菌阿魏酸钠盐溶液 1 L(测
得质量浓度 2.0 g L),转化 36 h 后 ,再一次性补加
33 g阿魏酸调成的无菌阿魏酸钠盐溶液 1 L。用
HPLC 跟踪测定的两种条件下的底物和产物质量浓
度(图 2-A和2-B)。A条件下 ,与图 1相比提高底物
浓度 , 转化到 60 h 时 , 产物达到高峰 , 香草酸
1.55 g L ,摩尔转化率 54%,继续转化时 ,产物反而
快速降解 ,与图 2-B 相比 ,一次加入过多的底物 ,转
化前期(0 ～ 36 h)底物消耗速度减慢 ,说明高底物质
量浓度对转化存在抑制作用。通过底物两次补加 ,
虽然转化时间有所延长 ,但可部分解除抑制作用 ,转
化 72 h时 ,香草酸质量浓度为 2.24 g L ,摩尔转化率
64.6%,此时转化液中阿魏酸含量接近于零。
— ◎—阿魏酸;— ◆—香草酸;— ■—摩尔转化率
图 2-A　25 L发酵罐中高底物质量浓度的转化时间曲线
Fig.2-A 　Time courses of vanillic acid formation with high sub-
stance concentration in 25 L fermentation
2.3　25 L 发酵罐中朱红密孔菌转化香草酸生产香
草醛
朱红密孔菌属白腐真菌 ,其生产香草醛的过程
　2005年 8月　　郑　璞等:黑曲霉 CGMCC0774和朱红密孔菌 CGMCC1115两步转化阿魏酸制备生物香兰素 ·71　 ·
可分生长和转化两个阶段 。生长阶段的目的是获得
最大量的有最佳转化香草酸能力的菌体 。当加入底
物香草酸后即进入转化阶段 。朱红密孔菌 CGM-
CC1115在发酵罐中培养 ,当转速过慢时菌丝体会结
为棉花状粘于罐壁上 ,过快会把菌体打得太碎 ,选择
转速 100 r min ,在温度 、种量 、培养基确定的情况下 ,
通气量是影响发酵的主要因素之一 。分别按通气比
1∶0.5 ,1∶0.8 , 1∶1在 25 L 发酵罐中培养菌体 ,将生
长好的菌液转到摇瓶中于摇床上进行香草酸的转
化 ,同时以摇瓶生长的菌体为对照 ,进行转化香草酸
的能力比较(表 2)。
— ◎—阿魏酸;— ◆—香草酸;— ■—摩尔转化率
图 2-B　25 L发酵罐中流加底物的转化时间曲线
Fig.2-B 　Time courses of vanillic acid formation with substance
supplemented in 25 L fermentation
表 2　不同生长通气比对朱红菌生产香草醛的影响
Table 2　Effect of various aeration rates on vanillin yield
与摇瓶对照比 生长通气比 产物质量浓度 (g L)
摩尔转化率
%
79% 1∶0.5 0.882 0.487摇瓶对照 1.110 0.612
72% 1∶0.8 0.873 0.482摇瓶对照 1.210 0.669
96% 1∶1 1.004 0.555摇瓶对照 1.046 0.578
生长阶段 CGMCC1115对氧的要求较高 ,加底物
进入转化阶段后 ,由于从香草酸到香草醛是还原的
过程 ,通气比需减小 。转化阶段选择通气比 1∶0.3
与1∶0.5(通气量分别为 5 L min 、8 L min)进行比较 ,
结果产香草醛分别达到 1.44 g L 和 1.34 g L。可见
减小通气比有利于转化。但因朱红密孔菌的代谢途
径还存在香草醛与香草醇间转换反应[ 12] ,通气量也
不能过小 ,以免香草醛的进一步还原。在摇瓶试验
中则要控制装液量[ 12] 。
确定生长和转化两阶段的通气量后 ,按 1.4方
法试验朱红密孔菌 CGMCC1115在 25 L发酵罐中转
化香草酸生产香草醛 ,发酵转化过程如图 3 ,转化 50
～ 60 h 时 , 香草醛达 1.45 g L , 摩尔转化率为
79.9%。
— △—生物量;— □—pH;— ◆—香草酸;— ★—香草醛
图 3　朱红密孔菌 CGMCC1115 发酵转化过程
Fig.3　Fermentation and conversion of vanillic acid by Pycnoporus
cinnabarinus CGMCC1115
2.4　黑曲霉 CGMCC0774和朱红密孔菌 CGMCC1115
串联转化阿魏酸生产香草醛
朱红密孔菌自身具有代谢阿魏酸生成少量香草
醛和香草酸的能力 ,同时还存在代谢阿魏酸的其它
途径 ,如其漆酶可作用阿魏酸生产二聚体等 ,发酵液
成分复杂[ 13] 。先采用黑曲霉将阿魏酸转化为香草
酸 ,再利用朱红密孔菌代谢香草酸的能力 ,可减少转
化液中的成分 ,提高产物香草醛的产量 ,并且产物易
于提取。实验中将两步微生物转化有机的串联 ,既
可省去了香草酸的提取过程 ,缩短整个转化的周期 ,
又可减少香草酸在提取过程的损失。
取黑曲霉CGMCC0774发酵转化48 h的过滤液 ,
其含香草酸质量浓度为 1.960 g L ,残留的阿魏酸质
量浓度为0.897 g L ,经调 pH5.0 ,补加终质量浓度为
5.0 g L的葡萄糖灭菌后 ,接入10%的培养48 h的朱
红密孔菌菌丝体进行串联转化 ,其转化时间曲线如
图 4 ,当转化 56 h时 ,产香兰素最高为 1.1 g L ,对香
草酸摩尔转化率 60.1%,对阿魏酸的摩尔转化率达
34.01%。香兰素的产量略低于分步转化 ,其原因可
能是黑曲霉发酵转化液中阿魏酸残留的过多。
按文献[ 9]的方法对转化液中的香草醛提取 ,所
得香草醛样品的含量由 HPLC 测定为 98.0%,进行
13
C同位素测定 ,其碳13C 12C比率明显不同于愈创木
酚原料化学合成的香草醛 ,与 Rhovanil® Natural(天
然等同)一致(表 3)。经13 C 同位素的分析结果表
　·72　 · 生物加工过程 第3卷第3期
明:将米糠饼和米糠油脚经微生物催化水解得到的
阿魏酸作为原料制备的香草醛 ,符合生物香兰素的
等同要求 。
— ★—香草醛;— ◆—香草酸;— ◎—阿魏酸;
— —对香草酸转化;— ■—对阿魏酸转化
图 4　朱红密孔菌对黑曲霉发酵转化液的转化过程
Fig.4　Time course of vanillin Formation from liquid of vanillic acid
with Aspergillus niger by Pycnoporus cinnabarinus
表 3　香兰素同位素13C 特征
Table 3　The 13C isotope characteristic of of various vanillin
种类 13C
合成香兰素(愈创木酚原料)[ 14] -26.88
Rhodia特纯香兰素 -36.76
Rhovanil® Natural(天然等同)Rhodia -36.67
本课题以天然米糠阿魏酸前体研制香兰素 -36.11
3　结论
由农副产品加工副产物米糠中提取的阿魏酸为
起始原料 ,在 25 L发酵罐中进行黑曲霉 CGMCC0774
转化生成香草酸的试验 ,采用补加底物的方式进行
转化 。72 h 香草酸质量浓度达到 2.24 g L ,摩尔转
化率为 64.6%。在 25 L 发酵罐中进行了朱红密孔
菌培养试验 ,控制培养阶段高通气量转化阶段低通
气量有利于产物的生成 ,最高香草醛达到 1.45 g L ,
摩尔转化率达到 79.6 %。
由黑曲霉转化生成的香草酸溶液经过处理 ,与
朱红密孔菌的游离菌丝体混合 ,进行转化香草醛的
反应 ,两步微生物转化的有机结合 ,香草醛的质量浓
度达到 1.1 g L , 对原料阿魏酸的摩尔转化率为
34.01%。本研究应用生物转化可再生植物资源技
术生产香草醛 ,不用苯基石化原料 ,简化操作步骤 ,
减少了原材料和溶剂的消耗 ,生产香草醛的过程对
环境友好。
参考文献:
[ 1] 　汪多仁.香草醛的开发与应用[ J] .北京日化 , 2000 , 60(3):13-
18.
[ 2] 　春　梅.我国制药用香兰素有待开发[ J] .中国化工信息 , 2004
(21):8.
[ 3] 　Nicholas JW , ArjanNB, Craig BF ,et al.Novel approaches to biosynthe-
sis of vanillin[ J] .Current Opinion in Biotechnology , 2000 , 11:490-
496.
[ 4] 　Mueller B ,Muence T.Process for the production of vanil lin[ P] .EP:
0885968, 1998.
[ 5] 　Rabenhorst Juergen ,Hopp Rudolf.Process for the preparation of vanil-
lin and suitable microorganisms[ P] .EP:0761817 , 1997.
[ 6] 　Christelle S , Laurence LM , Oddou J ,et al.Design of a fungal bioprocess
for vani llin production from vani lli c acid at scalable level by Pycnoporus
cinnabarinus[ J] .J of Biosci and Bioengineering , 2000 , 89(3):223-
230.
[ 7] 　孙志浩.一种黑曲霉及用其生产香草酸和香兰素的微生物转化
方法[ P] .中国专利:ZL 02125561.X ,2004-09-08.
[ 8] 　郑志强 ,朱书峰 ,孙志浩.微生物转化方法生产香草酸与香草醛
的初步研究[ J] .工业微生物 , 2002 , 32(4):1-7.
[ 9] 　王明君 , 郑　璞 , 孙志浩 , 等.微生物转化香草酸生产香草醛
[ J] .食品发酵工业 , 2004 , 30(2):43-47.
[ 10] 许仁溥 ,许大申.阿魏酸应用开发[ J] .粮食与油脂 , 2000, 6:7-9.
[ 11] 李永红 ,郑志强 ,孙志浩.反相高效液相色谱法同时测定发酵液
中的阿魏酸 、香草酸和香草醛[ J] .分析化学 , 2004 , 32(3):409.
[ 12] Laurence LM , Michel D , Mireille H , et al.A Two-step bioconversion
process for vani llin production from ferulic acid combining Aspergillus
niger and Pycnoporus cinnabarinus[ J] .J Biotechnol , 1996 , 50:107-
113.
[ 13] Falconnier B , Lapierre C , Lesage ML , et al.Vanillin as a product of fer-
ulic acid biotransformation by the white-rot fungus Pycnoporus cinnaba-
rinus Ⅰ-937:Identifi cation of metabolic pathways[ J] .Journal of Bio-
technology ,1994 , 37:123-132.
[ 14] Bensaid FF ,Wietzerbin K , Martin GJ.Authentication of natural vanilla.
avorings:isotopic chracterization using degradation of vanillin into guai-
acol[ J] .J Agric Food Chem , 2002, 50:6 271-6 275.
　2005年 8月　　郑　璞等:黑曲霉 CGMCC0774和朱红密孔菌 CGMCC1115两步转化阿魏酸制备生物香兰素 ·73　 ·