全 文 ：!引言
细胞间隙连接通讯 #$%& ’()*+,-). ,)+/0*/11(1%0.
*-22(),*%+,-)3 .45678 是细胞间的一种重要连接方
式!在细胞分化生长控制及维持体内环境平衡等
方面起重要作用# 近年来研究表明!肿瘤和转化细
胞中普遍存在 4567的缺陷9:;!4567在肿瘤的发生及
转移过程中扮演着极为重要的角色9<;$ 为此!许多学
者热衷于研究上调 4567的药物! 以此来实现其抑
制肿瘤生长%分化转移等作用$ 本实验在体外观察
复方藤梨根制剂 =>>?@48 对 A4细胞生长及其对
4567的影响!并进一步探讨其作用机制$
:...材料与方法
:B:...试剂与药物 !B培养基F??IFJK.和 C!G碳氧荧光素醋酸盐& C!
G#7>IL’ !均购于 J,$2%公司$@J7F为德国 MN6JJO
@JF.C:!公司产品$ 复方藤梨根制剂& 由藤梨根%水
杨梅根%虎杖根%党参等组成’ 由浙江中医学院制剂
教研室提供$
:B<...细胞来源及培养 高转移性人肺癌细胞株
& A4’由北京大学医学院免疫生化室王力民研究员
惠赠$ 用含 :!.P灭活小牛血清的 EAF6$ :GH! 培养
液培养并传代$
:BQ体外噻唑兰& F??’ 法 取对数生长期的人肺
癌细胞株 =A4细胞8:B!R:!GS2@分装于 TG 孔培养
板$ 设阴性对照组和不同浓度的复方藤梨根制剂组
& :!2$S2@%:!!2$S2@’ !各组设 C个平行孔!置 QUV培养 U<.W!
实验终止前 H.W 加入 F??液!再培养 H.W!测试前加
入 IFJK! 待结晶溶解后置于 CU!. )2 波长 !用
I4Q!<<酶联检测仪测每孔的 L值! 按下列公式求
出生长抑制率并进行评价$
生长抑制率& P’ X& :Y 用药组平均 L值 S.对照
组平均 L值’Z:!!.P
:BH...激光扫描共聚焦显微镜检测 4567 的功能 用
激光扫描共聚焦显微镜!按荧光漂白后的恢复技术
& >ELA’ 测定各组肿瘤细胞荧光恢复速度& 4567
功能’ $ 将空白对照组及依据 F??试验的结果所确
定的不同浓度复方藤梨根制剂& :!.2$S2@%复方藤梨根制剂上调 A4细胞间隙
[\]^_‘abc
姚庆华 :! 郭 勇 :! 杨维泓 :! 陈清勇 <
9摘 要;目的( 探讨复方藤梨根制剂对高转移性人肺癌细胞& A4’ 的生长及细胞间隙连接通讯功能
的影响# 方法(采用 F?? 法体外观察不同浓度复方藤梨根制剂对 A4 细胞的杀伤作用)应用激光共聚
焦显微镜检测用药后细胞间隙连接通讯功能& 4567’ 的变化# 结果(H个浓度的复方藤梨根制剂对 A4
细胞均有杀伤作用!呈剂量依赖关系#与空白对照组相比!一定浓度的复方藤梨根制剂能上调 4567#结
论(复方藤梨根制对 A4 细胞具有生长抑制作用!其机制可能与上调细胞间隙连接通讯功能有关#
关键词(复方藤梨根制剂)高转移性人肺癌细胞 )细胞间隙连接通讯
中图分类号(EUQY QGdEUQHB!#$% &’ () #*!+),#-./&0 &1 ,.* 2#03/&0 /0)+4)--#-.+ 4&55#0/4.!
/&0 6% () 1#1708 90,-/,90 5/:#+9 !# $%&’()* +)# !#&’* !&’ ,-%(#&’* -. /0
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%&.-46-//)/4 6#==)&%6.%#&>+?@AB #5 C+ 6-// /%&-D 5D>HIJ=G 1(- &.%E34#/%5-4.%#& -55-6.7 #5 5#)4 ;%55-4-&.
6#&6-&.4.%#& #5 8)5&’ 1-&’/%’-& 9%2.)4- #& C+ 6-// /%&-7 :-4- ;-.-4=%&-; :%.( 911 77FD G7-4 76&!
&%&’ 6#&5#6/ =%464#76#3F :7 )7-; .# ;-.-4=%&- +?@A 5.-4 .4-.=-&. :%.( 8)5&’ 1-&’/%’-& 9%2.)4-D +D!
=KL>=G 8#)4 ;%55-4-&. 6#&6-&.4.%#&7 ;#7-E;-3-&;-&./F %&(%H%.- .(- 34#/%5-4.%#& #5 C+ 6-// /%&-7D A#=34-;
:%.( 6#&.4#/ ’4#)3I +?@A ’4;)//F %&64-7-;D 4IMALK=EIMG 8)5&’ 1-&’/%’-& 9%2.)4- 6#)/; %&(%H%. ’4#:.( #5
C+ 6-// /%&-7D 1(- =-6(&%7= #5 &.%E.)=#4 %7 77#6%.-; :%.( )3E4-’)/.%#& +?@A #5 C+ 6-// /%&-D
NDO PI?J=G 8)5&’ 1-&’/%’-& 9%2.)4-J K%’(/F =-.7..%6 ()=& /)&’ 6&6-4 6-// /%&-J +3 <)&6.%#&
%&.-46-//)/4 6#==)&%6.%#&
收稿日期(基金项目(作者单位(:B浙江省中医院肿瘤科!浙江 杭州 Q:!!!G)医院!浙江 杭州 Q:!!!G
肿瘤研究与临床 !#$!%&’()培养液常规培养成单层后!用含有 *+,-
#.,-的 /0洗 1 次 2)3 次! 加 (43)567()8.956荧
光染料 3!&羟基荧光素乙酸乙酰盐# 3!&*:;<$ !
=>)?孵育 ,()5@A%用含 *+,-#.,-的 /0洗 ’次!以
洗去细胞外多余的荧光染料!再加入少量无血清培
养基进行 :!<分析&在显微镜’ B1(倍油镜$下!
完成感兴趣区域’ CD.@EAF)EG)@AHDCDFHI)!J$$ 的定义以
及 !J$ 漂白功能( /KD+LM9N@5D)0DC@DF)0L+A) 等过程%
通过 !J$ 漂白后不同间隔时间’ 743)5@A$ 的各次扫
描图像!获得漂白细胞荧光的恢复及相邻接触的未
漂白细胞的荧光变化 % 全部的 :!< 实验应在
O()5@A 内完成!包括染料负载*漂洗*细胞选择*淬
灭细胞及扫描%
743)))统计学分析 上述每个实验均重复 = 次!利用
000774(统计软件进行统计% 各组数据采用’ !P$
表示!多组数据间比较用 : 检验%以 Q(4(3为差异
有显著性!R(4(7为差异有非常显著性%
,)))结果
,47)))复方藤梨根制剂对 S 细胞杀伤活性的测定
浓度为 7()5.956即表现出一定的杀伤力! 且随药
物浓度的增加!作用加强’ 见表 7$ % 其中以浓度为
3()5.956时生长抑制率最高达 &O4&>)T!当浓度提
高至 >3)5.956*7(()5.956时!从肉眼及镜下均可看
到被杀伤而漂浮起来死亡的 S细胞I 说明在该浓
度下复方藤梨根制剂能直接杀伤肿瘤细胞% 据计算
当浓度为 O,43)5.956时达半数抑制率%
,4,)))复方藤梨根制剂对 SU$* 的影响 依据复方藤
梨根制剂的 $*3(值! 取浓度为 7()5.956*,()5.956*
,3)5.956*O()5.956 为复方藤梨根制剂的各实验
组!以观察不同浓度剂量组对 S细胞 SU$*功能的
影响% 经不同浓度的复方藤梨根制剂作用 >,)M 后!
在 S 细胞生长受到抑制的同时!S 细胞的 SU$*
随药物浓度的增加而上调!经统计学分析差异有显
著性 ’ 见表 ,$ % 表明复方藤梨根制剂具有上调
SU$*的作用%
O)))讨论
细胞间隙连接通讯’ SU$*$ 是多细胞生物体内
普遍存在的一种通讯方式!是细胞群内信号传递的
主要途径% 它能够传输生长调控信号!调节细胞的
增生与分化!在肿瘤的发生*发展和组织自身稳定
的维持中具有重要作用%
近几年来! 国内外对 SU$*与癌变的关系进行
了大量的研究!发现多数肿瘤细胞无 SU$*功能!其
间隙连接’ SU$ 少或无!而邻近的正常组织或良性
肿瘤的间隙连接正常% 少数肿瘤细胞有脆弱的连接
通讯!但很容易受到破坏!其间隙连接数量很少!所
以认为 SU$*在肿瘤的发生过程中扮演着极为重要
的角色VOW% NE5+@等V’W用电传导法观察人肺癌细胞株
中 SU$*功能!结果显示+7> 个肺癌细胞株中仅有
,个存在广泛的细胞间隙连接通讯功能!7& 例新鲜
肺癌组织中没有显示细胞间隙连接通讯功能% 从同
样肺癌组织中分离的纤维细胞却存在着广泛的细
胞间隙连接通讯功能% 进一步研究发现 SU$*与肺
癌的转移能力密切相关!具有一定的预后价值% 目
前对于能上调 SU$*的药物!研究较多的有 L<#)V3W*
维 <酸V&W*X#胡萝卜素V>W,中药提取物如姜黄素类似
物*茶多酚等上调 SU$*功能的研究已有报道 VYW!但
复方中药对 SU$*的影响尚未见文献报道%
本实验研究的复方藤梨根制剂是依据中医理
论- 正气存内!邪不可干) *( 邪之所凑!其气必虚)
及 ( 扶正祛邪) 治则的指导下研制出的纯中药制
剂% 该处方很好地将健脾益气与清热解毒*活血祛
淤结合在一起!使得人体的正气得以补益!正气存
内则邪不可干,同时人体内气滞*痰凝*血淤等所致
的毒邪也得以祛除!从而起到了扶正祛邪的治疗效
果% 经过长期*大量的临床实践证实该方对多种恶
性肿瘤有较好的疗效% 细胞学*免疫学*分子生物学
等前期研究表明该方具有控制原发性肿瘤的生长*
控制肿瘤的远处转移及广泛的免疫调控作用 VZW,逆
转肿瘤细胞多药耐药性,保护细胞 ;[<损伤*促进
;[<损伤修复!对化疗药物的减毒增效作用V7(W% 但
表 7)))不同浓度复方藤梨根制剂对 S 细胞的
杀伤活性’ #NN法$
<值 生长抑制率(4,Y&O](4(3’&
(4,3Y,^(4(17>7_ Y4,Z7_
(4,7(Z‘(4(’’’,_ ,&4O’,_
(47ZY’a(4(>77,_ O34ZY,_
(47(’(b(4((ZO,_ &O4&>,_
组别
对照组
复方藤梨根制剂组 7()5.956
,()5.956
,3)5.956
3()5.956
))7$ 与对照组比较 c(4(3%
,$ 与对照组比较 d(4(7%
表 ,)))复方藤梨根制剂对 S 细胞 SU$* 功能和
*e’O 的影响
分组 !J$的平均荧光强度
&4’>f14=(
g(4(1h7g4(7
&g4gYigZ4gY7_
&>43gj7&4=Y7_
7g1437k7g47>7_
)7$ 与对照组比较 l(4(7%
对照组
复方藤梨根制剂组 7()5.956
g()5.956
g3)5.956
3()5.956
m
肿瘤研究与临床 g((1年 %(月第 %& 卷第 3 期=(1. .
! 癌症杂志征订启事
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复方中药的抗肿瘤机制较复杂’ 多数呈多靶点#多
步骤作用& 本实验旨在探讨复方藤梨根制剂对 IJ
细胞的生长和 J-*,的影响’以此证实 J-*,是复方
藤梨根制剂抗肿瘤的靶点之一&
&KK试验显示复方藤梨根制剂在 !1%DL8D)M
31%DL8D) 浓度之间对 IJ 细胞均有杀伤活性 ’
01%DL8D)%即可表现出一定的杀伤作用’且随药物浓
度的增加’作用加强’呈剂量依赖性关系& 实验结果
表明’IJ细胞 J-*,功能较弱’ 将不同剂量的复方
藤梨根制剂作用于 IJ细胞后’ 其生长受到明显抑
制的同时’J-*,功能上调’并呈剂量依赖关系&说明
复方藤梨根制剂抗肿瘤作用可能与其调节 J-*,功
能有关’ 通过上调 J-*,功能进而调控细胞的增生
分化和代谢等功能&
本实验初步探讨了复方藤梨根制剂对 IJ细胞
间隙连接通讯功能的影响’ 结果证实 J-*,是复方
藤梨根制剂抗肿瘤的作用靶点之一’但详细作用位
点不清& 细胞内控制信息是借助一些离子和小分子
物质$ 如钙离子#碱基#氨基酸#核苷酸#高能磷酸
盐#:N&I 等% 传递的’这些物质在细胞间的流动受
到 J-的精细控制& 复方藤梨根制剂是否通过调节
上述离子和小分子物质中的某些物质在细胞间的
传递’从而起到调节 J-*,功能的作用’还有待进一
步的深入研究&
O参考文献P
OQ!%P 林仲翔$间隙连接通讯!生长调控癌变三者之间的关系O-P$%细
RSTUVWX!YYAX!17!!!#!!3$
O%0%P )F?%-%ZX%)FE?L%[%)X%)F?%<4FE>%\%[$%,E?:]^Q:4]D_6^]‘]?5F_?Qa=Q5]EQ
6_G=64]?_GL4Q DF5_5F:Q :5F_?Q aG_:cEb] O-P$ Q
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O%/%P h>:4%h%-$ %K4]%^_G]%_i%LE6%;>?:E5F_?EG%F?5]^:]GG>GE^%:_DD>?F:E5F_?%
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:_DD>?F:E5F_?%F?%:>G5>^]b%4>DE?%G>?L%:E^:F?_DE%:]GG< O-P$ %)>?L%
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O%3%P []EL]^%&X %+F:4_c<_?%d%-$ %\5^>:5>^]%_i%LE6%;>?:5F_?%F?5]^:]GG>GE^%
:4E??]G^^%l6F?%\5^>:5%dF_GX%!YYX%j0f7%!A/$
O%%P mFGG]:c]%ZX%k]??]DE??%kX%(E4G%’X%]5%EG$%K4]%bF‘]^L]?]?:5F_?EGQ6^_5]F?^Q-Q,]GGQdF_GXgYYgXQ37
g&B$
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5F_?D_Q^FL]?]D_^Q:]GG:(+NQ^]5E^bj0/f7g1B1g’g1B13$
OQAQP k_Gb]^Q-QmXQ’GD_^]Q’XQdE^^]55Q-Q,$QJE6Q;>?:5F_?Qi>?:5F_?QE?bQ:E?C
:]^O-P$Q,E?:]^Qh]OQYQP 林 玲X王泽时X俞丽霞$Q三根去瘤方对 )]9F< 肺癌等的抗肿瘤
pqrstuO-P$Q浙江中医学院学报 gYY3XgYjgf7/B)/Y$
Og1P 林 玲X王泽时X俞丽霞$Q三根去瘤方对 (+N损伤的保护及对化
vwxyz{|}~O-P$€浙江中医学院学报XQ!YYBXQ0!j3f7/1*
//$
作者简介(姚庆华$ !YB2, % ’女’011/ 年毕业于浙江中医学
院’硕士’医师&
$ 责编(李旭清 校对(李旭清%
姚庆华’等 复方藤梨根制剂上调 IJ细胞间隙连接通讯功能的研究 /13- -