全 文 ：苋菜培养细胞中角鲨烯的提取与含量测定
岳才军 ,何彦平 ,阮洪生 ,孟 婧　(黑龙江八一农垦大学生命科学与技术学院 ,黑龙江大庆 163319)
摘要　[目的 ]建立苋菜培养细胞中角鲨烯提取与含量测定的方法。 [方法]以苋菜叶片为外植体诱导愈伤组织 ,用皂化和不同有机溶
剂浸泡的方法提取苋菜愈伤细胞中角鲨烯 ,并用 HLPC测定其含量。[结果 ]用皂化法提取苋菜愈伤细胞的角鲨烯含量高于用有机溶剂
浸泡方法提取的含量。苋菜愈伤细胞提取的角鲨烯在HLPC上与标准品出峰时间一致 ,而且该峰与其他峰有很好的分离。 [结论 ]皂化
法是提取苋菜愈伤细胞中角鲨烯较好的方法。用HLPC测定苋菜愈伤细胞中角鲨烯含量可行。
关键词　角鲨烯;苋菜愈伤组织;皂化;高效液相色谱;测定
中图分类号　Q946　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)10-05104-02
ExtractionandContentDeterminationofSqualeneinAmaranthustricolorCalli
YUECai-junetal　(ColegeofLifeScienceandBiotechnology, HeilongjiangAugustFirstLandReclamationUniversity, Daqing, Hei-
longjiang163319)
Abstract　[ Objective] TheresearchaimedtoestablishamethodforextractionanddeterminationofsqualeneinAmaranthustricolorcalli.
[ Method] ThecalliwereinducedfromtheleavesofAmaranthustricolor.SqualeneinA.tricolorcaliwasextractedwithvarioussolutionand
directsaponification.ThesqualenecontentsofA.tricolorcaliweredeterminedbyHPLC.[ Result] Thecontentofsqualeneextractedbysa-
ponificationwashigherthanthatofsqualenesextractedwithvarioussolutions.TheretentiontimeofsqualeneextractedfromA.tricolorcali
wasthesameasthatofstandardsqualene.ThepeakofsqualeneextractedfromA.tricolorcaliwasseparatedcompletelyfromotherpeaks.
[ Conclusion] Theextractionofdirectlysaponifingcaluscelswasabeterway.HPLCwasasuitabletoolforthedeterminationofsqualene
contentsintheextractionfromcali.
Keywords　Squalene;Amaranthustricolorcali;Saponification;HLPC;Determination
基金项目　黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划项目(1152G024)。
作者简介　岳才军(1967-),男 ,黑龙江鸡西人 ,博士 , 副教授 , 从事植
物细胞工程研究。
收稿日期　 2009-12-28
　　角鲨烯为无色的油状液体 ,具有令人愉快的气味 ,属于
非皂化脂类 。角鲨烯的化学名为 2, 6, 10, 15, 19, 23-六甲基
2, 6, 10, 14, 18, 22-二十四碳六烯 ,属开链三萜 ,也称鱼肝油
萜 。动物和微生物细胞中都含有角鲨烯。植物细胞中也含
有角鲨烯。在许多植物的种子 、叶片等部分存有角鲨烯 ,其
中苋菜(Amaranthustricolor)含量较高 [ 1] 。角鲨烯是植物细
胞中的一个重要代谢物 ,是许多植物甾醇和三萜类皂甙等化
合物的生物合成前体。了解角鲨烯在细胞中的含量 ,对认识
植物甾醇 、皂苷等次级代谢物的代谢有重要意义。
目前 ,小样品中角鲨烯的提取测定多数采用有机溶剂浸
泡 、皂化提取和气相色谱法 ,也有采用高效液相色谱法
(HPLC)测定植物种仁油脂和裂殖壶菌(Schizochytriumman-
grovei)中角鲨烯含量的报道 [ 2-3] 。然而 ,对植物培养细胞中
角鲨烯含量的测定尚未见报道。笔者以苋菜愈伤组织为材
料 ,参考裂殖壶菌中角鲨烯含量的测定方法 [ 3] ,探讨了植物
培养细胞中角鲨烯的提取 、测定方法 ,试图为当今正在发展
的植物细胞培养特别是次级代谢调控的研究提供植物离体
培养细胞中角鲨烯含量的测定方法 。
1　材料与方法
1.1　试剂与器材　角鲨烯标准品 ,美国 Sigma公司 ,纯度≥
97%;色谱纯乙腈;其他为国产分析纯 。LC2010AHT高效液
相色谱仪 ,日本岛津公司生产。
1.2　无菌苗的培养　取苋菜种子 ,用浓度 1%洗洁精洗涤 ,
并用自来水清洗后 ,用纱布包住若干种子 ,系住 ,用浓度 70%
酒精消毒 30 s,无菌水冲洗 3 ～ 4次 , 1 g/L升汞消毒 5min,无
菌水冲洗 3 ～ 5次 ,接种于基本培养基(MS+浓度 0.8%琼
脂)上 ,培养 28d。
1.3　愈伤组织的诱导和继代培养　取无菌苗 ,在无菌培养
皿上将叶片切成 0.5 cm2左右的方块 ,接种到诱导培养基
(MS+6-BA0.5 mg/L+2, 4-D1.0mg/L+0.8%琼脂 +
3%蔗糖)中 。在温度(26±1)℃、12h光照下培养 30 d后获
得愈伤组织 ,然后进行继代培养。继代培养基选用 1/2 MS,
其他培养条件同愈伤诱导。
1.4　样品烘干处理　取继代培养 30 d的苋菜愈伤细胞在
50 ℃下烘干至恒重 ,并用研钵研成粉末 。
1.5　苋菜愈伤细胞中角鲨烯的提取
1.5.1　溶剂浸泡法。在 4 ℃条件下提取 24 h。在 16 000
×g下离心 10 min,收集上层液;残余物用 5 ml溶液萃取 1
次 ,然后在相同条件下再次离心。合并上层溶液 ,并且在 50
℃的真空干燥箱中蒸发至无溶剂。将残留物溶解在 1 ml色
谱乙腈中 , 16 000×g离心 15 min,取上清备用。
1.5.2　皂化法。准确称取 0.1 g干细胞 ,置于 20 ml具塞试
管中;加入 2 ml浓度 10%KOH-浓度 75%乙醇皂化液 ,混合
均匀;放入 50℃水浴中皂化 10 min,并每隔 1 ～ 2min混合几
秒;将皂化混合物冷却至室温 ,加入 5ml正己烷进行萃取;振
荡萃取 2次 ,收集上层萃取液;真空挥干后用 2 ml乙腈溶解
残留物 ,在 16 000×g下离心 15min,取上层样品备用 。
1.6　标准角鲨烯溶液的配制　取 50 mg角鲨烯 ,用乙腈充
分溶解 ,定容至 10 ml,再从中取出 200 μl,加乙腈稀释至 10
ml,混匀即制得 0.1mg/ml角鲨烯标准品溶液。
1.7　苋菜愈伤细胞中角鲨烯含量的测定　采用高效液相色
谱法测定。控制条件参照微生物细胞中角鲨烯含量的测定
并略作改动。色谱柱:KromasilC18 (5 μm, 4.6 mm×250.0
mm);测定波长:195nm;流动相:浓度 100%乙腈 ,流速为 1.5
ml/min;进样量为 20 μl;柱温为 30 ℃;每个样品测定时间为
30 min。进样前 ,必须经 0.45μm滤膜过滤。
2　结果与分析
2.1　标准曲线和回归方程　由图 1可知 ,在该试验条件下 ,
责任编辑　刘月娟　责任校对　卢瑶安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(10):5104-5105
角鲨烯标准品(含 0.5 μg)出峰时间在 25.1min。
图 1　角鲨烯标准品的 HLPC
Fig.1　HLPCchromatographofstandardsqualene
　　精确稀释角鲨烯标准品母液 ,分别进样 ,使样品中角鲨
烯含量分别为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和 3.0 μg,记录峰面积 。
以峰面积对含量进行线性回归。经计算 ,得到的线性回归方
程为:角鲨烯含量 =0.302×峰面积 -0.065,线性相关的确定
系数 R2 =0.997 2。这说明用高效液相色谱仪法测定 0.5 ～
3.0μg角鲨烯标准品 ,所得的峰面积与含量有较好的线性关
系 ,可以用来计算未知样品中的角鲨烯含量 。标准曲线如图
2所示。
图 2　角鲨烯的标准曲线
Fig.2　Thestandardcurveofsqualene
2.2　苋菜愈伤组织的诱导　消毒的苋菜种子播种在基本培
养基上 , 28d后长成无菌苗。无菌苗的叶片经 30d的诱导可
得到愈伤组织 ,随后进行继代培养 。从图 3可以看出 ,愈伤
组织生长良好 ,均匀一致 ,适宜用作角鲨烯提取方法对比试
验的材料。
2.3　苋菜愈伤细胞中角鲨烯的含量　从图 4可以看出 ,角
鲨烯出峰时间与标准品一致 ,表明所选用的提取角鲨烯和
HPLC测定条件是可行的。
　　采用有机溶剂浸提法 ,乙酸乙酯 /甲醇(1/1, V/V)、二氯
甲烷 /甲醇(2/1, V/V)、乙酸乙酯 /甲醇(4/1, V/V)、乙醚 /甲
醇(1/1, V/V)、乙醚 /甲醇(1/4, V/V)、乙醚 /甲醇(4/1, V/V)
提取苋菜愈伤细胞 ,经 HPLC测定 ,角鲨烯含量分别为
0.394、0.325、0.188、0.161、0.081、0.000 4 mg/g。而采用皂
化法提取 ,并用 HPLC测定 ,角鲨烯含量达 0.579 mg/g。由
此可知 ,采用皂化法提取的角鲨烯含量最高 ,而用乙醚 /甲醇
(4/1, V/V)浸泡提取的角鲨烯含量最低。
3　讨论
图 3　经继代培养 30d的苋菜愈伤组织
Fig.3　ThecaliofAmaranthustricoloraftersub-culturefor30
days
图 4　苋菜愈伤细胞经皂化提取后样品的 HLPC
Fig.4　HPLCofthecalisamplesofAmaranthustricolorafter
saponificationextraction
研究表明 ,皂化是提取苋菜培养细胞中角鲨烯较好的方
法。皂化反应是碱催化下的酯水解反应 ,尤指油脂的水解。
角鲨烯是一种非皂化的脂类 ,即不发生皂化反应。皂化处理
可以将能皂化的脂类与非皂化脂类分开 ,让非皂化脂类充分
游离出来 ,所以经皂化处理后测定的细胞中角鲨烯含量可能
更接近实际。皂化提取苋菜培养细胞中角鲨烯的另一个优
点是耗时短。
HPLC是测定经皂化处理的植物细胞提取物中角鲨烯含
量较方便的方法。笔者曾采用 HPLC测定微生物细胞中角
鲨烯含量 [ 3] ,方便 ,快捷。该研究采用 HPLC测定苋菜培养
细胞中角鲨烯含量 ,同样干扰少 ,样品处理方便 ,耗时少 ,重
复性好 。笔者利用皂化处理结合 HPLC检测技术对苋菜悬
浮培养细胞 、人参悬浮培养细胞等材料的角鲨烯含量进行测
定 ,结果均良好。因此 ,该文所用方法可能适用于更多的植
物细胞中角鲨烯含量的测定 。
参考文献
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510538卷 10期　　　　　　　　　　　　　　　　岳才军等　苋菜培养细胞中角鲨烯的提取与含量测定