全 文 ：江苏农业学报(Jiangsu J． of Agr． Sci．) ，2013，29(1) :216 ～ 218
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黄志伟，郑亚凤，许 明，等． 竹节人参角鲨烯合成酶基因的克隆与生物信息学分析［J］．江苏农业学报，2013，29(1) :216-218．
doi:10． 3969 / j． issn． 1000-4440． 2013． 01． 037
竹节人参角鲨烯合成酶基因的克隆与生物信息学分析
黄志伟， 郑亚凤， 许 明， 郑金贵
(福建农林大学农产品品质研究所，福建 福州 350002)
收稿日期:2012-06-19
基金项目:国家自然科学基金项目(30671276) ;国家转基因重大专
项项目(2009ZX08001 － 032B) ;福建省自然科学基金项
目(2009J05044) ;福建省教育厅科技项目(JA12110)
作者简介:黄志伟(1978-) ，男，福建诏安人，博士研究生，助理研究
员，主要从事植物品质生物技术研究。(Tel)0591-
83789231;(E-mail)hzwfau@ 163． com。郑亚凤为共同第一
作者。
通讯作者:郑金贵，(E-mail)jgzheng@ fjau． edu． cn
关键词: 竹节人参;人参皂苷;角鲨烯合成酶;基因克隆;序列分析
中图分类号: Q781 文献标识码: A 文章编号: 1000-4440(2013)01-0216-03
Cloning and bioinformatics analysis of squalene synthase gene from Panax
japonicus C． A． Mey．
HUANG Zhi-wei， ZHENG Ya-feng， XU Ming， ZHENG Jin-gui
(Institute of Agricultural Product Quality，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China)
Key words: Panax japonicus C． A． Mey．;ginsenoside;squalene synthase;gene cloning;sequence analysis
人参(Panax ginseng C． A． Mey．)属于五加科(Araliace-
ae)人参属(Panax)植物，是传统的名贵中药材，人参属的所有
植物均具有较高的药用价值，其主要活性成分是皂苷［1-2］。人
参根的总皂苷含量为 2% ～ 7%，而竹节人参(Panax japonicus
C． A． Mey．)根的总皂苷含量高达 15%以上，约为前者的 2 ～ 7
倍、西洋参的 3倍，是总皂苷含量最高的人参属植物［2-3］。
人参皂苷属于类异戊二烯代谢途径三萜类合成支路的
产物，是由角鲨烯通过不同方式环合形成的，而角鲨烯则是
由法尼基焦磷酸(Farnesyl pyrophosphate，FPP)在角鲨烯合
成酶(Squalene synthase，SQS)的催化下合成的，角鲨烯的合
成是从类异戊二烯中央代谢途径进入三萜类合成支路的分
支点，SQS是人参皂苷生物合成的关键酶［4-6］，SQS基因的过
表达可显著提高人参中的皂苷含量［7］。因此，分离克隆 SQS
基因是研究人参皂苷代谢调控及其基因工程的前提。目前，
已有拟南芥［8］、烟草［9］、辣椒［10］、青蒿［11］等多种植物的 SQS
基因克隆的报道，但尚未见有关竹节人参 SQS 基因克隆的
报道。为此，本研究根据已知植物 SQS 基因的保守区域设
计引物，结合 RT-PCR和 cDNA末端快速扩增(Rapid amplifi-
cation of cDNA ends，RACE)技术，从竹节人参中克隆 SQS基
因的全长 cDNA 序列，并进行序列分析和功能预测，为下一
步对水稻等农作物进行品质遗传改良提供目的基因。
1 材料与方法
1． 1 材料
竹节人参(P． japonicus)采自江西省井冈山市，取其 3 年
生植株的根。大肠杆菌 DH5 #由福建农林大学农产品品质
研究所保存。焦碳酸二乙酯(DEPC)原液购自美国 Amresco
公司，rTaq DNA 聚合酶、PrimeSTAR  HS DNA 聚合酶、
DNA marker和 pMD18-T 载体均购自宝生物工程(大连)有
限公司，RevertAidTM第一链 cDNA 合成试剂盒购自美国 Fer-
mentas公司，柱式胶回收试剂盒购自美国 Omega 公司，RNA
提取试剂 TRIzol、3-RACE 试剂盒、5-RACE 试剂盒和 Gen-
eRacerTM试剂盒均购自美国 Invitrogen公司，其余试剂均为国
产分析纯。引物合成和测序均由上海英骏生物技术有限公
司完成。
1． 2 方法
1． 2． 1 总 RNA的提取和检测 取 0. 5 g 新鲜的竹节人参
612
根，用液氮速冻后迅速研磨成细粉，约取 0. 1 g 细粉提取总
RNA，RNA沉淀用 50 μl DEPC 处理的超纯水溶解。用超微
量紫外分光光度计(ND-2000C)检测其浓度和 OD260 /280值，并
经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后，－ 80 ℃保存备用。
1． 2． 2 引物设计 根据已知植物 SQS基因同源性较高的区
域，利用 Vector NTI 7． 0 软件设计特异引物 ZRRT1(5-CAC-
TATGTWGCTGGGCTTGTTG-3)和 ZRRT2 (5-GCACCAT-
AGACATCAGCCATTG-3)。再根据获得的保守序列设计 3-
RACE的特异引物 ZRF1(5-CACTATGTTGCTGGGCTTGTTG-
3)和 ZRF2 (5-TGGGCTTGTTGGATTAGGATTG-3) ，5-
RACE 的 特 异 引 物 ZRR1 (5-GACAATCCTAATCCAA-
CAAGCC-3)和 ZRR2 (5-CTAATCCAACAAGCCCAGCAAC-
3)。将获得的保守序列和 3末端、5末端的序列进行拼接，
获得全长 cDNA序列，设计编码序列两端的特异引物 ZRF3
(5-ATGGGAAGTTTGGGGGCAATTC-3)和 ZRR3(5-TCAT-
GAACTGTGGTTCTCACTG-3)。
1． 2． 3 RT-PCR 将总 RNA 反转录成第一链 cDNA 后作为
模板，进行 PCR反应。PCR反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30
s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环;然后 72 ℃ 10 min。PCR
产物回收、连接后转化大肠杆菌 DH5α，PCR 鉴定阳性克隆
后进行测序。将测序结果登录到 NCBI 网站上用 BLAST 程
序进行同源性分析，以确定所获得的片段是否为目的基因片
段。大肠杆菌感受态细胞的制备和转化等操作参照分子克
隆实验指南［12］。
1． 2． 4 3-RACE 将总 RNA 反转录成 3-RACE 的第一链
cDNA，先以 AUAP与 ZRF1 为上下游引物，进行以 3-RACE
第一链 cDNA 为模板的 PCR;再以此 PCR 产物为模板，以
AUAP与 ZRF2 为上下游引物，进行巢式 PCR，得到目的基因
的 3末端。PCR反应条件参照方法 1． 2． 3。PCR 产物的回
收、连接、转化和测序等同方法 1． 2． 3。
1． 2． 5 5-RACE 将总 RNA 反转录成 5-RACE 的第一链
cDNA，先以 GeneRacerTM 5 Primer 与 ZRR1 为上下游引物，
进行以 5-RACE 第一链 cDNA 为模板的 PCR;再以此 PCR
产物为模板，以 GeneRacerTM 5 Nested Primer 与 ZRR2 为上
下游引物，进行巢式 PCR，得到目的基因的 5末端。PCR 反
应条件参照方法 1． 2． 3。PCR 产物的回收、连接、转化和测
序等同方法 1． 2． 3。
1． 2． 6 编码序列的扩增 以方法 1． 2． 3 中的第一链 cDNA
为模板，用高保真的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶进行 PCR
扩增，PCR反应条件参照方法 1． 2． 3，其中 35 个循环结束
时，向 PCR反应液中加入 0. 1 μl rTaq，混匀后 72 ℃ 10 min。
PCR产物的回收、连接、转化和测序等同方法 1． 2． 3。
2 结 果
2． 1 总 RNA的提取和检测
总 RNA的电泳图谱呈现出 3 条清晰的条带，其中 28S
和 18S条带明显比 5． 8S 亮，28S 与 18S 条带的亮度比约为
1∶ 1。经检测，总 RNA 的浓度为 569. 7 ng /μl，OD260 /280 =
1. 88。说明获得的总 RNA较完整，可用于后续试验。
2． 2 SQS基因全长 cDNA的克隆
2． 2． 1 RT-PCR 以第一链 cDNA 为模板，扩增得到约 500
bp的片段，命名为 ZRRT。测序结果表明 ZRRT 长度为 494
bp。Blast分析发现，ZRRT 与人参、烟草、光果甘草及大豆
SQS基因的同源性分别为 83%、83%、84%、84%，故可初步
认为 ZRRT是 SQS基因 cDNA的一个片段。
2． 2． 2 3-RACE 以 3-RACE的第一链 cDNA为模板，扩增
得到 900 bp左右的片段，命名为 ZR3。测序结果表明 ZR3
长度为 891 bp。Blast 分析发现，ZR3与人参、光果甘草、雷
公根及大豆 SQS 基因的同源性分别为 89%、85%、85%、
84%，故可初步认为 ZR3是 SQS基因 cDNA的一个片段。
2． 2． 3 5-RACE 以 5-RACE的第一链 cDNA为模板，扩增
得到 650 bp左右的片段，命名为 ZR5。测序结果表明 ZR5
长度为 621 bp。Blast 分析发现，ZR5与人参、雷公根、马铃
薯及辣椒 SQS基因的同源性分别为 93%、91%、83%、83%，
故可初步认为 ZR5是 SQS基因 cDNA的一个片段。
2． 2． 4 编码序列的扩增 将 ZRRT、ZR3和 ZR5的序列进
行拼接，得到 SQS基因的全长 cDNA 序列，其中包含一个完
整的开放阅读框(Open reading frame，ORF)。以方法 1． 2． 3
中的第一链 cDNA为模板，扩增 SQS 基因的编码序列，得到
约 1. 3 kb的片段，命名为 ZRORF。测序结果表明该序列长
为1 266 bp，与通过拼接得到的编码序列长度一致。Blast 分
析发现，ZRORF 与人参、雷公根、马铃薯及烟草的 SQS 基因
的同源性分别为 90%、87%、82%、82%，故可进一步确认它
是 SQS基因的编码序列。
采用 RACE 技术克隆获得的竹节人参 SQS 基因全长
cDNA命名为 PjSQS(1 495 bp)，包含1 266 bp 的开放阅读框
(87 ～1 352 bp)。由 PjSQS 编码序列推导出 SQS 的氨基酸序
列，共 421 个氨基酸残基，分子量为 4． 80 × 104，pI为 6. 17。
2． 3 竹节人参 SQS基因的序列分析及功能预测
2． 3． 1 核苷酸与氨基酸序列的同源性分析 Blast 搜索结
果表明:在核苷酸水平上，PjSQS 与人参、雷公根、马铃薯、烟
草 SQS基因分别有 93%、87%、82%、82%的同源性;在氨基
酸水平上，PjSQS与人参、雷公根、大豆、紫花苜蓿 SQS 的氨
基酸序列分别有 94%、89%、87%、84%的相同性和 97%、
95%、93%、92%的相似性。因此，竹节人参 SQS 基因与人
参、雷公根、烟草、大豆等植物的 SQS 基因，无论是从核酸水
平还是蛋白质水平都存在较高的同源性，故可推测该基因具
有角鲨烯合成酶基因的功能。
2． 3． 2 竹节人参 SQS 的结构分析和功能预测 CDD(Con-
served domain database)搜索结果表明:竹节人参 SQS的氨基
酸序列具有 3 个保守区域:1 ＇-1 反式异戊烯二磷酸合成酶，
该酶催化 2 个异戊烯二磷酸“头-头”缩合反应;反式异戊烯
712黄志伟等:竹节人参角鲨烯合成酶基因的克隆与生物信息学分析
二磷酸合成酶和类异戊二烯生物合成酶，属于类异戊二烯生
物合成酶家族的第一族，可催化合成牻牛儿基焦磷酸(Gera-
nyl pyrophosphate，GPP)、FPP或更长的类异戊二烯产物。催
化位点包括一个巨大的中心空腔，该空腔由 2 个位于壁上的
富天门冬氨酸区(DXXXD)反向平行的 α 双螺旋组成，主要
起结合异戊烯磷酸基团的作用，可分别催化 2 个 15-C(法尼
基)异戊烯二磷酸和 2 个 20-C(牻牛儿基牻牛儿基)异戊烯
二磷酸进行 1-1 缩合反应。作为角鲨烯合成酶，它催化两
分子的 FPP缩合产生角鲨烯。
CDART(The conserved domain architecture retrieval tool)
是一个蛋白质保守区相似性搜索工具，搜索蛋白质结构与功
能的相似性而不是序列的相似性。CDART搜索发现竹节人
参 SQS蛋白质具有角鲨烯合成酶的结构，因此可推断该竹
节人参 SQS蛋白质具有角鲨烯合成酶的功能，与上述 CDD
搜索的分析结果一致。
在 Blocks 数据库(http:/ /blocks． fhcrc． org)中进行功能
结构域检索，发现竹节人参 SQS与已知植物的 SQS 一样，具
有角鲨烯 /八氢番茄红素合成酶家族的 3 个功能结构域，第
1 个域为38 ～ 78，第 2 个域为168 ～ 177，第 3 个域为201 ～
226。
综上所述，推测 PjSQS具有角鲨烯合成酶基因的功能。
3 讨 论
一般来说，用于 RT-PCR和 RACE等分子生物学实验的
RNA应完整无降解。因为在 RACE-PCR 过程中，部分降解
(如28S∶ 18S约为1∶ 1)的 RNA 往往导致大量的非特异条
带或成片的“Smear”［13］，尤其是 5-RACE，原因是截短的
mRNA反转录成第一链 cDNA并加上同聚物尾后，在后续的
PCR中会得到优先扩增［12］。而竹节人参的根经液氮速冻后
难以研磨，导致提取的 RNA难以避免部分降解。为此，必须
对经典 RACE方法进行改进或选用 RLM-RACE 技术等［14］，
以避免或缓解 RNA部分降解带来的影响。
GeneRacerTM Kit(RLM-RACE)在开始 RACE 之前，先用
牛小肠碱性磷酸酶(CIP)对 mRNA 进行脱磷酸化(对全长
mRNA无影响，因为全长 mRNA 在其末端有甲基化 G-帽保
护) ，可使末端脱帽、降解的 mRNA 脱磷酸化。因此，只有完
整无降解的 mRNA才能在连接酶介导的连接反应中与 RNA
Oligo相连接，从而排除了产生非全长目的基因 5端的可
能［15-16］。
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