全 文 ：收稿日期:2004 12 21
作者简介:何方奕(1960 ),女(汉族), 辽宁鞍山人 , 硕士研究生 , 现在鞍山师范学院化学系工作;李发美(1947 ), 女
(汉族),江西兴国人 , 教授 ,博士生导师 , 主要从事药物分析学研究 , Tel.024 23986289 , E mail fameili@163.com。
文章编号:1006 2858(2006)01 0018 04
无梗五加果中总香豆素和 6 ,7 二甲氧基
香豆素的含量测定
何方奕 , 韩　莹 , 刘　曼 , 刘　瑞 , 李发美
(沈阳药科大学 药学院 ,辽宁 沈阳　110016)
摘要:目的 测定无梗五加果中总香豆素及 6 , 7 二甲氧基香豆素的含量。方法 以东莨菪内酯为对
照品 ,采用分光光度法 , 于348 nm处测定总香豆素含量。采用 HPLC 法测定 6 , 7 二甲氧基香豆素
含量。色谱柱为 Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm , 5μm), 流动相为甲醇 磷酸水溶液(pH3.0)
乙腈 四氢呋喃(体积比为 15∶77∶6∶2), 检测波长为340 nm。结果 总香豆素质量浓度在 3.44 ～
12.9 mg·L-1(r=0.999 2)内 、6 , 7 二甲氧基香豆素质量浓度在 1 ～ 40 mg·L-1(r=0.999 9)内线
性关系良好;平均回收率分别为 100.6%、97.7%;总香豆素和 6 , 7 二甲氧基香豆素的质量百分含
量分别为 0.12%、0.0037%。结论 方法准确 、可靠 ,可为无梗五加果的质量控制提供参考依据。
关键词:紫外分光光度法;高效液相色谱法;无梗五加果;总香豆素;6 , 7 甲氧基香豆素
中图分类号:R917;TQ460.72　　　文献标识码:A
　　无梗五加又称短梗五加(Acanthopanax ses-
si li f lorus(Rupr.et M axim.)Seem.)为五加科五加
属的一种灌木或小乔木 ,广泛分布于我国东北 、河
北等地区 ,东北地区资源丰富 。《中华本草》记载 ,
无梗五加的根茎具有祛风湿 、补肝肾 、强筋骨 、活
血脉的作用 。主治风寒湿痹 、腰膝疼痛 、筋骨痿
软 、小儿迟行等症[ 1] 。国内有王广树等对无梗五
加叶进行化学成分的研究[ 2] ,高凤兰等对无梗五
加根化学成分提取分离鉴定[ 3] ,吴立军等对无梗
五加茎叶化学成分进行研究[ 4] 。但目前尚无关
于无梗五加果的化学成分和药理作用的文献报
道 ,作者对无梗五加果的化学成分进行了初步的
研究 ,发现无梗五加果含有香豆素类成分 ,对其进
行了分离纯化 ,鉴定其中一种成分为 6 , 7 二甲氧
基香豆素(结构式见图 1)。为了解无梗五加果中
香豆素类物质的含量 ,更全面 、综合地评价这一药
用植物 ,挖掘传统中药材的潜力 ,作者对无梗五
加果中总香豆素以及6 ,7 二甲氧基香豆素的含量
Fig.1　The structure of 6 , 7-dimethoxycoumarin
进行了测定。该方法准确 、可靠 、快速 ,可为进一
步了解其药理作用和合理开发无梗五加果这一药
用资源提供参考。
1　仪器与材料
752型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器
有限公司), SHIMADZU 高效液相色谱仪(日本
岛津公司):LC 10ATvp输液泵 ,SPD 10Avp紫外
检测器 ,ANASTAR色谱工作站。
乙腈 、甲醇均为色谱纯(山东禹王实业有限公
司禹城化工厂),四氢呋喃为色谱纯(天津市科密
欧化学试剂开发中心),水为重蒸馏水。东莨菪内
酯(北京丰特斯公司), 6 ,7 二甲氧基香豆素
(ALDRICH 公司),无梗五加果(丹东农业科学院
提供 ,经沈阳药科大学孙启时教授鉴定)。
2　方法与结果
2.1　总香豆素含量测定
2.1.1　对照品溶液的制备
称取东莨菪内酯对照品 8.6 mg ,置 100 mL
量瓶中 ,加乙醇溶解并稀释至刻度 ,精密量取该溶
液5 mL置 10 mL 量瓶中 ,加乙醇稀释至刻度 ,得
对照品溶液。
2.1.2　供试品溶液的制备
第 23 卷 第 1 期
2 0 0 6 年 1 月
沈　阳　药　科　大　学　学　报
Journal of Shenyang Pharmaceutical University
Vol.23 　No.1
Jan.2006 p.18
取无梗五加果粉末约1 g ,精密称定 ,加入
100 mL乙醇摇匀 ,避光浸泡24 h ,摇匀 ,过滤 ,定
容于100 mL量瓶中得供试品溶液 。
2.1.3　标准曲线的制备
精密量取“ 2.1.1”条对照品溶液 0.8 、1.2 、
1.6 、2.0 、2.4 、3.0 mL ,分别置10 mL量瓶中 ,加乙
醇稀释至刻度。以相应溶液为空白 , 于波长
348 nm处测定吸光度 ,以吸光度(A)为纵坐标 、质
量浓度(ρ)为横坐标 ,绘制标准曲线 。回归方程
为:A =0.042 8ρ+0.009 1 , r =0.999 2。东莨菪
内酯对照液质量浓度在 3.44 ～ 12.9 mg·L-1内呈
现良好的线性关系。
2.1.4　精密度试验
精密吸取“2.1.1”条对照品溶液 ,重复测定
6次 ,记录吸光度值 , RSD为 0.1%(n=6)。
2.1.5　重复性试验
取同一批无梗五加果粉末 5 份 ,每份约1 g ,
精密称定 ,按“2.1.2”条操作 ,采用标准曲线法测
定总香豆素的含量 ,求得平均 RSD为 1.3%。
2.1.6　稳定性试验
取供试品溶液 ,每隔1 h测定一次吸光度 ,测
定 8次 ,发现在避光条件下 RE值为 1.3%,而在
不避光条件下以相同方法测定吸光度 RE 为
-5.8%,表明供试品溶液在避光条件下保存 8 h
稳定 。
2.1.7　加样回收试验
取已知总香豆素含量的无梗五加果粉末
9份 ,每份约0.5 g ,精密称定 ,分别加入一定量的
东莨菪内酯对照品溶液 ,按“2.1.2”和“2.1.3”条
方法测定总香豆素的含量 ,计算平均加样回收率。
结果见表 1。
Table 1　The result of the recoveries of total coumarin(n=9)
m added/ mg m found/ mg Recovery/ % RSD/ %
0.713 0.718 100.7 0.8
0.602 0.609 101.2 0.3
0.473 0.480 101.5 0.6
2.1.8　样品测定
取无梗五加果粉末约1 g ,精密称定 ,然后按
“2.1.2”和“2.1.3”条方法测定总香豆素的含量 ,
无梗五加果中总香豆素的质量百分含量为
0.12%。
2.2　6 ,7 二甲氧基香豆素的含量测定
色谱条件　色谱柱:Hypersil BDS C18(4.6 mm×
250 mm ,5μm);流动相:甲醇 磷酸水溶液(pH3.0)
乙腈 四氢呋喃(体积比为 15∶77∶6∶2);流速:
0.8 mL·min-1;检测波长:340 nm;柱温:室温;进样
量:20μL。
2.2.1　对照品溶液的制备
精密称取 6 , 7 二甲氧基香豆素对照品5 mg ,
加入甲醇制成质量浓度为0.1 g·L-1的溶液 ,作为
对照品溶液。
2.2.2　供试品溶液的制备
取无梗五加干燥果实 ,除去种子 ,粉碎 ,取粉
末约1 g ,精密称定后置锥形瓶中 ,加入5 mL蒸馏
水浸润 ,放置过夜 ,加入氯仿100 mL ,超声提取
30 min ,振荡30 min ,滤过 ,滤液挥干 ,残渣用甲醇
溶解 ,过0.45 μm微孔滤膜 ,用甲醇定容于5 mL量
瓶中 ,作为供试品溶液。
2.2.3　线性关系考察
分别精密量取对照品甲醇溶液 0.1 、0.3 、
0.5 、1.0 、2.0 、4.0 mL置10 mL量瓶中 ,甲醇稀释
至刻度 。进样20 μL ,以色谱峰面积为纵坐标 ,质
量浓度为横坐标绘制工作曲线 ,回归方程为 A =
4.330×107ρ～ 1.215×104 , 6 ,7 二甲氧基香豆素
对照液质量浓度在 1 ～ 40 mg·L-1内呈现良好的
线性关系(r=0.999 9)。
2.2.4　精密度试验
精密吸取“2.2.1”条对照品溶液20 μL ,重复
进样 6 次 ,结果 6 , 7 二甲氧基香豆素峰面积的
RSD为 0.9%。
2.2.5　重复性考察
取同一批样品 ,按“ 2.2.2”条方法平行制备
6份供试品溶液 ,测定含量 , RSD为 1.3%。
2.2.6　稳定性试验
取同一供试品溶液 ,分别于 0 、2 、4 、6 、8 h进
行测定 ,结果峰面积的 RSD为 0.4%。
2.2.7　加样回收试验
精密称取含量已知的样品1.0 g ,共 9份 ,分别
加入 6 , 7 二甲氧基香豆素对照品溶液适量 , 按
“2.2.2”条和“2.2.3”条进行提取测定 ,结果见表 2。
Table 2　The result of the recoveries of 6 , 7 dimethoxy-
coumarin(n=9)
madded/μg m found/μg Recovery/ % RSD/ %
60 57.83 96.4 0.8
40 39.53 98.8 0.6
20 19.58 97.9 0.5
2.2.8　样品测定
分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各
19第 1 期 何方奕等:无梗五加果中总香豆素和 6 , 7 二甲氧基香豆素的含量测定　　　
20μL ,进行 HPLC 法测定 ,按外标法计算含量 , 样品质量百分含量为 0.0037%,色谱图见图 1。
6 , 7—dime thoxycoumarin
Fig.2　The HPLC chromatograms of standard substance(A)and sample(B)
3　讨论
3.1　总香豆素的测定
提取条件的选择:比较了不同浓度的乙醇 、甲
醇 、乙酸乙酯 ,并分别采取冷浸 、超声或回流等方
法提取不同的时间 ,结果确定加入100 mL乙醇避
光浸泡24 h提取较完全 ,方法简便。
3.2　6 ,7 二甲氧基香豆素的测定
提取溶剂的考察:分别采用了体积分数 95%
乙醇 、乙醇 、甲醇 、氯仿回流或超声提取。结果醇
类提取的样品颜色较深 ,杂质较多 ,对色谱柱损害
较大;氯仿提取的样品颜色较浅 ,减少了色素及糖
类物质的干扰 ,因此采用氯仿作为提取溶剂。
检测波长的确定:6 , 7 二甲氧基香豆素在最
大吸收波长227 nm处有较强吸收 ,但在227 nm处
溶剂吸收影响较大 ,而340 nm处各峰分离度和重
复性良好 ,故以340 nm为测定波长 。
流动相的选择:分别考察了乙腈 磷酸水溶
液 、甲醇 磷酸水溶液 、甲醇 磷酸水溶液 四氢呋
喃及甲醇 磷酸水溶液 乙腈 四氢呋喃等体系的
不同配比 ,确定最优条件为甲醇 磷酸水溶液 乙
腈 四氢呋喃(体积比为 15∶77∶6∶2),分离度及峰
形均佳 ,理论塔板数达到5 000以上。
参考文献:
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Determination of the contents of total coumarin and
6 , 7-dimethoxycoumarin in fruit of Acanthopanax
sessilif lorum(Rupr.et Maxim.)Seem.
HE Fang-yi , HAN Ying , LIU Man , LIU Rui , LI Fa-mei
(School of Pharmacy , Shenyang Pharmaceut ical Universi ty , Shenyang 　110016 , China)
Abstract:Objective To determine the contents of total coumarin and 6 ,7-dimethoxycoumarin in fruit of A-
canthopanax sessi lif lorum(Rupr.et Maxim.)Seem.Methods The content of to tal coumarin w as determined
20 　　　沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 23卷
w ith ultraviolet spect rophotometry at 348 nm using scopolet ine as reference.The separation and quantitat ion
of 6 , 7-dimethoxycoumarin w as performed on a Hypersil BDS C18(4.6 mm ×250 mm , 5 μm)w ith mobile
phase consisted of methanol-H3PO4(pH3.0)-acetonit rile-tetrahydrofuran(V∶V∶V∶V =15∶77∶6∶2)and
detection at 340 nm.The f low rate was 0.8 mL·min-1.Results The standard curve w as linear in the range
of 3.44-12.9 mg·L-1 fo r total coumarin(r =0.999 2)and 1-40 mg·L-1 fo r 6 , 7-dimethoxycoumarin
(r=0.999 9).The average recoveries of to tal coumarin and 6 , 7-dimethoxycoumarin w ere 100.6% and
97.7%, respectively.Conclusions The methods are simple , accurate w ith good reproducibili ty and can be
used to assess the quality of f ruit of Acanthopanax sessili f lorum(Rupr.et Maxim.)Seem.
Keywords:UV;HPLC;fruit Acanthopanax sessi li f lorum(Rupr.et Maxim.)Seem.;total coumarin;
6 ,7-dimethoxycoumarin
(上接第 14页)
化合物Ⅴ:黄色粉末(MeOH),mp>300 ℃,盐酸
镁粉反应紫红色 , 推测为黄酮类化合物 。 1H
NMR(300 MHz , DMSO d6 , δ)谱上 12.50(1H ,
s)和 10.79(1H , s)分别为A 环 5位和 7位羟基质
子信号。 6.18(1H , d , J =2.5 Hz , H 6)、6.42
(1H , d , J =2.5 Hz , H 8)说明 A 环为 5 , 7 二取
代;6.87(1H , d , J =8.8 Hz)、 7.53(1H , dd ,
J =2.5 ,8.8 Hz)、7.67(1H ,d , J =2.5 Hz)为典型
AMX偶合系统 。9.60(1H , s)、9.38(1H , s)和
9.32(1H , s)分别为 3 , 3′, 4′位 3个羟基质子信号 ,
推测 B环为 3′, 4′取代 。经与文献[ 5]对照 ,确定
化合物Ⅴ为槲皮素(quercetin)。
参考文献:
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Studies on chemical constituents of Leonurus japoni-
cus
CAI Xiao-han1 , CHE Zhen-tao2 , WU Bin1 , GAO Hui-yuan1 , WU Li-jun1
(1.School of Traditional Chinese Materia Medica , Shenyang Pharmaceutical Universi ty , Shenyang 　
110016 , China;　2.School of Chinese Medicine , The Chinese University of Hongkong , Shatin , N.
T ., Hongkong S AR , China.)
Abstract:Objective To isolate and elucidate the structures of the constituents f rom Leonurus japonicus
Houtt.Methods The compounds were isolated by chromatography on silica gel and Sephadex LH-20 column
and NMR were employed fo r structure identification.Results Five compounds were obtained and elucidated
as 5 , 7 , 3′, 4′, 5′-pentamethoxy f lavone(Ⅰ), wogonin(Ⅱ), apigenin-7-O-glucopy ranoside(Ⅲ), daidzein
(Ⅳ),quercetin(Ⅴ).Conclusions Compound Ⅰ , Ⅱ and Ⅲ are isolated f rom Leonurus for the first t ime , Ⅳ
and Ⅴ are isolated f rom Leonurus japonicus Houtt fo r the first time.
Key words:Leonurus japonicus Hout t;chemical consti tuents;f lavones
21第 1 期 何方奕等:无梗五加果中总香豆素和 6 , 7 二甲氧基香豆素的含量测定