全 文 ：第 50 卷 第 2 期
Vol． 50 No． 2
山 东 大 学 学 报 (医 学 版)
JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY(HEALTH SCIENCES)
2012 年 2 月
Feb． 2012
收稿日期:2011-07-01
基金项目:山东省中青年科学家科研奖励基金资助项目(2007BS03061)。
作者简介:孙雪飞(1974 － ) ，男，副教授，副主任医师，硕士研究生导师，主要从事肺癌的基础研究。E-mail:sunxuefei1974@ 163． com
通讯作者:杨国涛(1964 － ) ，男，教授，主任医师，博士研究生导师，主要从事胸部肿瘤的基础研究。E-mail:yanggtxwk@ 163． com
文章编号:1671 － 7554(2012)02 － 0038 － 05 DOI:10． 6040 / j． issn． 1671-7554． 2012． 02． 009
藤梨根提取物对肺癌 A549 细胞
裸鼠移植瘤的抑制作用
孙雪飞，裴艳涛，尹秋伟，杨国涛，王德江
(山东大学齐鲁医院胸外科，济南 250012)
摘要:目的 研究藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌 A549 细胞裸鼠移植瘤的生长抑制及凋亡诱导作用，并探讨其作
用机制。方法 建立肺癌 A549 细胞裸鼠移植瘤模型，观察藤梨根乙酸乙酯提取物的作用，设置对照组、治疗组
(低剂量组、高剂量组)。通过测量移植瘤体积变化绘制生长曲线，根据终末瘤质量比较计算抑制率，采用 TUNEL
法检测移植瘤凋亡指数，采用免疫组化法检测移植瘤 Survivin蛋白表达、增殖指数，采用逆转录 －聚合酶链式反应
(RT-PCR)检测移植瘤 Survivin mRNA 变化。结果 各治疗组经藤梨根乙酸乙酯提取物治疗后移植瘤生长缓慢，
治疗结束时治疗组移植瘤质量及瘤体积明显低于对照组，高、低剂量组的瘤质量抑制率分别为 69． 00% 和
45． 09%。各治疗组移植瘤组织凋亡指数则明显高于对照组，而 Survivin mRNA 及蛋白表达较对照组明显减少，高
剂量组尤其明显，各组间上述指标比较差异均有统计学意义(P ＜ 0． 01)。结论 藤梨根乙酸乙酯提取物在体内对
肺癌 A549 细胞生长有抑制作用，可以诱导移植瘤细胞发生凋亡，促进癌细胞凋亡并下调瘤细胞 Survivin 蛋白和
mRNA 表达。
关键词:藤梨根提取物;肺肿瘤;小鼠，裸;细胞凋亡;基因，Survivin;免疫组织化学;逆转录聚合酶链式反应
中图分类号:R734． 2 文献标志码:A
Inhibitory effect of Radix Actinidiae extract on transplanted
tumors of the lung cancer cell line A549 in nude mice
SUN Xue-fei，PEI Yan-tao，YIN Qiu-wei，YANG Guo-tao，WANG De-jiang
(Department of Thoracic Surgery，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，China)
Abstract:Objective To study the inhibitory effect and apoptosis-inducing action of acetidin extract of Radix Actinidi-
ae on transplanted tumors of lung cancer A549 cells in nude mice，and to explore its mechanisms． Methods A model
of transplanted tumors bearing lung cancer A549 cells was established in nude mice，and the effect of acetidin extract of
Radix Actinidiae in vivo was detected． The control group and treatment groups (high-dose group and low-dose group)
were set for comparison． According to the transplanted tumor volume，the transplanted tumor growth curve was drawn．
According to the final tumor weight，the inhibitory ratio was calculated． Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated
UTP nick-end labeling (TUNEL)was used to determine the apoptosis index of transplanted tumors． Expressions of Sur-
vivin protein and mRNA in transplanted tumors were detected by immunohistochemistry (SP)and RT-PCR，respective-
ly． Results The growth of transplanted tumors in treatment groups was slowed after taking the drug． The final tumor
volume and tumor weight in treatment groups were smaller than those in the control group． Tumor weight inhibitory
rates in the high-dose group and low-dose group were 69． 00% and 45． 09%，respectively． The apoptosis index of trans-
planted tumor in treatment groups was higher than that in the control group． Expression of Survivin mRNA and protein
in treatment groups were lower than those in the control group，and they was more signifi cantly decreased in the high-
孙雪飞，等．藤梨根提取物对肺癌 A549 细胞裸鼠移植瘤的抑制作用 39
dose group． Differences were significant in the above indexes between each two groups(P ＜ 0． 01)． Conclusion The
acetidin extrac of Radix Actinidiae has an inhibitory effect on growth of transplanted tumors of lung cancer A549 cells in
nude mice，inhibiting proliferation activity of transplanted tumor，degrading expressions of Survivin protein and mRNA，
and inducing apoptosis of cancer cells．
Key words:Radix Actinidiae extractive;Lung neoplasms;Mice，nude;Apoptosis;Gene，Survivin;Immunohisto-
chemistry;Reverse transcriptase polymerase chain reaction
近年随着化学药品的开发渐趋艰难和药害问题
不断被认识，植物药的研究越来越受到人们的关注，
从中草药和天然药物中筛选和提取防治肿瘤的有效
成分也成为治疗肿瘤的希望和新途径，成为当前研
究的热点之一。藤梨根为猕猴桃科猕猴桃属软枣猕
猴桃的根，味甘、咸寒、微涩，具有清热解毒、消肿疥、
祛风湿的功效。既往常用于抗肿瘤治疗，尤其对消
化道肿瘤疗效较佳。研究结果显示，猕猴桃属其他
种类猕猴桃根提取物在体外对肿瘤细胞生长也有抑
制作用，因此其药理研究和临床验证受到广泛关
注［1-3］。本研究制备藤梨根乙酸乙酯提取物，并发
现其对体外培养的肺癌细胞有较好的抑制作用，可
通过对凋亡相关基因的调节来诱导肺癌细胞发生凋
亡［4］。现通过肺癌裸鼠移植瘤模型，观察藤梨根乙
酸乙酯提取物对体内肺癌细胞生长的影响，探讨其
可能作用机制，为其进一步临床应用提供依据。
1 材料与方法
1． 1 材料 藤梨根购自济南建联药店;肺癌 A549
细胞系由山东省医学科学院基础所惠赠;35 只
BALB /C(nu /nu)雄性裸小鼠购自北京维通利华实
验动物有限公司，SPF级，鼠龄 3 ～ 4 周，体质量 16 ～
18 g;SP免疫组化染色试剂盒、鼠抗人 Survivin单克
隆抗体、TUNEL 试剂盒均购自北京中山生物技术有
限公司;RPMI 1640 培养基、胎牛血清购自 Gibco
公司;溴化乙锭(BE )、胰蛋白酶为美国 Sigma 公司
产品;捷达 801 系列形态学分析系统系江苏捷达科
技发展有限公司产品;RNA 提取液(TRIzol)购自
Life Technologies公司;RT-PCR试剂盒购自TaKaRa
公司;Centrifuge 5415D 普通高速离心机和 BioPho-
tometer型微量核酸定量仪为 Eppendorf 公司产品;
Alpha Imager TM2200 凝胶成像系统为英国Alpha
Innotech 公 司 产 品;MJ-PTC200 PCR 仪 为 MJ
research公司产品。
1． 2 方法
1． 2． 1 藤梨根乙酸乙酯提取物的制备 将藤梨根
500 g 粉碎成 20 目的粗粉，加 8 倍水煮 2 次，每次
1 h，过滤浓缩，加入乙酸乙酯溶媒萃取 3 次(每次
300 mL) ，回收溶媒，得浓缩物约 25 g(含三萜类物
质) ，蒸馏水热溶，过滤，滤液供实验用(无菌)。
1． 2． 2 细胞系与细胞培养 肺癌 A549 细胞系培
养在含 10%小牛血清、青霉素、链霉素各 100 U /mL
的 RPMI 1640 培养液中，37 ℃、5%CO2 饱和湿度条
件下培养，0． 25%胰蛋白酶消化传代。
1． 2． 3 BALB /C(nu /nu)裸小鼠体内移植瘤建立
35只 BALB /C(nu /nu)裸小鼠，SPF 级，鼠龄 3 ～ 4
周，体质量 16 ～ 18 g，雄性，饲养于超净生物层流架
内，环境定期紫外线消毒，保持恒温(25 ± 2)℃、恒湿
(45% ～50%) ，笼具、饮水均经高压蒸汽灭菌，实验操
作均在无菌罩内进行。将肺癌A549细胞按常规方法
复苏扩增，消化后无血清培养液，1 000 r /min，离心
10 min，离心半径 15 cm，血清 RPMI-1640 洗涤 2 次，
每次 3 min，计数并调整细胞浓度，台盼蓝染色活细
胞计数 ＞ 99%。用带 6 号针头注射器抽取癌细胞悬
液接种于裸鼠右前腋部皮下，每个部位接种 0． 2 mL
(含活细胞数 1 × 106 个) ，接种后每天观察有无肿瘤
形成及注射点有无破溃红肿，经过 3 ～ 7 d潜伏期，可
见接种部位皮下出现瘤结节，并逐渐长大，呈圆形或
椭圆形突出于体表，以肿瘤直径0． 5 cm为成瘤。
1． 2． 4 实验分组及干预方法 用随机数字法将 32
只成瘤裸鼠分为高、低剂量治疗组和对照组，分别为
10、11、11 只。治疗组用灌胃法每日喂服 1 次藤梨
根乙酸乙酯提取物，高、低剂量组分别按 150、
75 mg /kg给药，藤梨根乙酸乙酯提取物用 0． 2 mL
生理盐水溶解后灌胃;对照组灌服等量溶剂，共治疗
28 d。最后一次给药后 24 h 以脱颈方式处死裸鼠，
消毒后，无菌手术切除标本，称移植瘤质量后，立即
取材用于后续检测。实验中观察裸鼠精神、进食、排
便及体质量情况。
1． 2． 5 移植瘤生长曲线绘制和治疗后抑瘤率的测
定 移植瘤生长曲线根据各组裸鼠移植瘤体积变化
绘制;移植瘤体积测定参照卫生部药政局《新药(西
药)临床前研究指导原则汇编》中的“抗肿瘤药物药
效学指导原则”规程进行测量。隔日用游标卡尺测
量瘤体最长径(a)与最短径(b) ，移植瘤的体积按公
40 山 东 大 学 学 报 (医 学 版) 50 卷 2 期
式:V(mm3)= πab2 /6，计算并绘制移植瘤生长曲
线。根据治疗结束后移植瘤瘤质量计算各组平均瘤
质量及抑瘤率(inhibition ratio，IR)。
IR =〔(对照组平均瘤质量 －治疗组平均瘤质
量)/对照组平均瘤质量〕× 100%。
1． 2． 6 原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法
(TUNEL)检测移植瘤的细胞凋亡 移植瘤石蜡切
片常规脱腊，操作步骤按照试剂盒说明书进行，苏木
素复染细胞核。将已知的阳性切片作阳性对照，以
不含末端脱氧核糖核酸转移酶的标记液处理的切片
作阴性对照。细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性细
胞，随机选 10 个视野，每个视野观察 100 个细胞，计
数阳性细胞数，计算凋亡指数(apoptotic index，
AI;%)=阳性细胞计数 /观察细胞总数 × 100%。
1． 2． 7 移植瘤组织 Survivin 蛋白表达和细胞增殖
指数检测 每例标本切片 2 张，切片 60 ℃烘烤 1 h
后常规脱蜡。采用链霉菌素 －生物素(SP)免疫组
化技术检测移植瘤 Survivin 蛋白表达，全部操作过
程严格按照 SP试剂盒说明书完成。组织抗原修复
采用微波抗原修复法;Survivin 单抗工作浓度均为
1∶ 100。采用已知阳性对照片作阳性对照;以 PBS 代
替一抗作阴性对照。Survivin 蛋白阳性结果判定为
细胞质内出现棕黄色颗粒;将其置于 Olympus 显微
镜下 400 倍高倍视野下观察，对所测部位进行准确
定位后，由摄像系统提取数值化细胞图像输入捷达
801 系列形态学分析系统，每例选取 4 个视野进行
阳性率测定。
1． 2． 8 RT-PCR法检测移植瘤组织 Survivin mRNA
表达 裸鼠处死后，取 50 mg 肿瘤组织，匀浆 2 000
r /min，离心 15 min，离心半径 15 cm，PBS 洗涤 2 次，
每次 3 min，取移植瘤细胞 1 × 106 个，提取总 RNA，
紫外分光光度计检验纯度并定量。设 β-actin 为内
参照，对样品模板用量标准化，Survivin、β-actin 引
物序列由上海生物工程技术服务有限公司合成，
Survivin 引物上游序列为 5-CAAAGAAAGTC-
CGCTGTGCC-3;下游序列为 5-TCCCTCACCCT-
GCTAAG TCC-3，Survivin mRNA 扩增片段大小为
326 bp。β-actin 引物上游序列为 5-ATGGARTC-
CTGTGGCATCCA-3;下游序列为 5-CGCTCAG-
GAGGAG CAATGAT-3，β-actin 序列扩增产物大
小为 224 bp。采用一步法 RT-PCR 检测 Survivin
mRNA 的表达，50 ℃ 30 min 完成反转录，94 ℃预
变性 2 min后进入 PCR循环，94 ℃变性 30 s，60 ℃
复性 30 s，72 ℃延伸 1． 5 min，共 30 个循环。PCR
产物 8 μL 在 1． 5%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙啶
染色，经凝胶图像分析仪分析结果，以 Survivin 和
β-actin的比值作为 Survivin mRNA 的相对含量。
1． 3 统计学处理 数据处理采用 SPSS 10． 0 for
windows软件包，组间差异选用 t 检验，以 P ＜ 0． 05
为差异有统计学意义。
2 结 果
2． 1 藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌裸鼠移植瘤生
长的抑制作用及抑制率 治疗开始后隔日测量裸鼠
移植瘤最长、最短径，计算各组移植瘤平均体积，来
反映各组移植瘤生长情况。对照组移植瘤生长方式
符合指数生长方式，后期生长较快，个别裸鼠移植瘤
出现破溃，生长曲线拟合方程为 y = 6e0． 285 5x;而各
治疗组裸鼠移植瘤生长较对照组明显减慢，高剂量
组尤其明显，见图 1。治疗结束时对照组移植瘤体
积及平均瘤质量，见表 1。各组移植瘤平均体积和
平均质量相互比较差异均有统计学意义(P ＜
0． 01)。计算高、低剂量的藤梨根乙酸乙酯提取物
对肺癌裸鼠移植瘤生长抑制率分别为 69． 00%和
45． 09%。
图 1 各组裸鼠移植瘤的生长曲线
Fig． 1 The transplantation tumor growth curve in each group
表 1 各组裸鼠移植瘤体积、瘤质量及抑制率(珋x ± s)
组别 n 瘤体积(V /mm3) 瘤重(m /mg) 抑制率(%)
对照组 11 2 965． 34 ± 131． 3 2 647． 33 ± 156． 4 —
实验组
低剂量 11 1 578． 92 ± 123． 5* 1 453． 71 ± 50． 7* 45． 09
高剂量 10 876． 48 ± 87． 2＊▲ 820． 66 ± 35． 9＊▲ 69． 00
*P ＜ 0． 01 vs 对照组，▲P ＜ 0． 01 vs 低剂量组。
2． 2 藤梨根乙酸乙酯提取物对移植瘤细胞凋亡的
影响 TUNEL 法检测瘤细胞凋亡以细胞核中出现
棕黄色颗粒为阳性细胞，见图 2、3。图像分析结果
显示，对照组移植瘤细胞内的凋亡指数为 2． 00 ±
0． 82，而低剂量组为 20． 46 ± 3． 47、高剂量组为
43． 73 ± 5． 32，各组间两两比较差异均有统计学意义
(P ＜ 0． 01)。
孙雪飞，等．藤梨根提取物对肺癌 A549 细胞裸鼠移植瘤的抑制作用 41
图 2 对照组裸鼠移植瘤组织(TUNEL，× 200)
Fig． 2 Transplantation tumor in the control group
(TUNEL，× 200)
图 3 高剂量组裸鼠移植瘤组织(TUNEL，× 200)
Fig． 3 Transplantation tumor in the high-dose group
(TUNEL，× 200)
2． 3 藤梨根乙酸乙酯提取物对移植瘤细胞Survivin
蛋白和 mRNA 表达的影响 SP 法检测Survivin蛋
白阳性表达主要位于癌细胞的细胞质内，呈棕黄色
颗粒，见图 4、5。Survivin mRNA 阳性扩增产物显示
在 326 bp处均出现特异性的 Survivin 条带，见图 6。
图像分析结果显示，各治疗组移植瘤细胞内的
Survivin蛋白和 mRNA 表达明显低于对照组，高剂
量组更明显，各组间两两比较差异均有统计学意义
(P ＜ 0． 01) ，见表 2。
表 2 移植瘤组织 Survivin mRNA 和蛋白表达(珋x ± s)
组别 n Survivin mRNA Survivin 蛋白(%)
对照组 11 0． 716 ± 0． 069 44． 57 ± 3． 43
低剂量组 11 0． 516 ± 0． 087* 33． 77 ± 4． 37*
高剂量组 10 0． 282 ± 0． 071＊▲ 17． 46 ± 3． 81＊▲
*P ＜ 0． 01 vs 对照组;▲P ＜ 0． 01 vs 低剂量组。
图 4 对照组裸鼠移植瘤组织 Survivin表达(SP，× 200)
Fig． 4 Expression of Survivin in transplantation tumor in the
control group (SP，× 200)
图 5 高剂量组裸鼠移植瘤组织 Survivin表达(SP，× 200)
Fig． 5 Expression of Survivin in transplantation tumor in the
high-dose group (SP，× 200)
图 6 藤梨根乙酸乙酯提取物对移植瘤细胞 Survivin mRNA
表达的影响
M:Marker;1 ～ 3:高剂量组;4 ～ 6:低剂量组;7 ～ 8:对
照组。
Fig． 6 Expression of Survivin mRNA in transplantation tumor
cells in each group
M:DNA marker;1-3:High-dose group;4-6:Low-dose
group;7-8:Control group．
3 讨 论
中药抗肿瘤已有悠久的历史，其低毒、安全、有
效已是人们普遍接受的事实，而从民间药或传统经
验用药中发掘新的抗肿瘤药物比原来的盲目、普遍
过筛疗效要高，且一旦进入临床应用其毒副作用也
小。用藤梨根组方治疗肿瘤在我国由来已久，浙江
温州地区民间就流传用壁虎(米炒焦研粉)、藤梨根
煮红枣治疗胃癌、肺癌，效果较好。近年研究结果也
表明，藤梨根复方制剂在体内外均有抑制肿瘤转
移［5］、逆转多药耐药［6］、对化放疗减毒增效［7-8］的作
用。但上述研究是采用藤梨根复方制剂进行，关于
藤梨根单体及其有效成分抗肿瘤研究尚少见报道，
且其抗肿瘤机制尚不明确。本研究结果显示，藤梨
根乙酸乙酯提取物在体内可以明显抑制人肺癌裸鼠
移植瘤的生长，促进癌细胞凋亡，存在剂量依赖性，
表明藤梨根乙酸乙酯提取物具有明显的抗肺癌作
用，而其作用机制与抑制肺癌细胞增殖、诱导细胞凋
亡有关。肿瘤的治疗及治疗效果、耐药的产生与细胞
凋亡密切相关，而特异性诱导肿瘤细胞凋亡，已成为
42 山 东 大 学 学 报 (医 学 版) 50 卷 2 期
肿瘤治疗研究的靶点之一。Survivin 是目前发现的
最强的凋亡抑制因子，其高表达能抑制多种因素，如:
p53、天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(caspases)等诱
导的细胞凋亡。Survivin 可直接与 Caspase-3 和
Caspase-7 结合，阻断细胞凋亡过程。Survivin 也可
抑制由细胞色素 C 或 Caspase-8 诱导的 Caspase 活
化，也能阻止 Caspase-3 和 Caspase-7 的自发活
化［9-10］。再次，Survivin 还可与细胞周期调控因子
cdk4 结合，使 P21 从 cdk4 复合体中释放出来，P21
再与线粒体 Caspase-3 结合，抑制其活性，从而抑制
Fas介导的细胞凋亡［11-13］。最近研究发现，热休克
蛋白 Hsp90 可与 Survivin 结合，从而提高肿瘤细胞
抗凋亡的阈值，促进肿瘤细胞增殖［14］。本研究结果
显示，低剂量组、高剂量组肺癌移植瘤组织中的
Survivin mRNA 和蛋白表达比对照组均明显下降，
高剂量组更为明显。表明藤梨根提取物是通过降低
肺癌组织 Survivin mRNA 和蛋白的表达来实现其凋
亡诱导作用。
参考文献:
［1］Zhong Z H G，Zhang F F，Zhen H S H，et al． Experi-
mental study on the antitumor effects of extracts from
roots of Acitinidia delicilsa in carcinoma cell lines［J］．
Study Journal of Traditional Chinese Medicine，2004，22
(9) :1705-1707．
［2］Zhong Z H G，Zhang W Y，Zhang F F，et al． Experi-
mental Study on the Antitumor Effects of Extracts from
Roots of Actinidia indochinensis in Carcinoma Cell Lines
［J］． Journal of Chinese Medicinal Materials，2005，28
(3) :215-218．
［3］Zhang F F，Zhong Z H G，Zhang W Y，et al． Effects of
n-Butanol lysate of alcohol extracts from roots of Actinidia
rufa on the anticancer in vitro［J］． Study Journal of Tradi-
tional Chinese Medicine，2005，23(2) :261-263．
［4］孙雪飞，尹秋伟，裴艳涛，等．藤梨根提取物抑制肺癌
A549 细胞增殖作用机制研究［J］．山东医药，2009，49
(9) :12-15．
［5］Pan Y H，Pan Q． Experimental Research of Fufangsangen
Decoction on Pulmonary Carcinoma Transfer of T739
Mice［J］． Zhejiang Journal of Integrated Traditional Chi-
nese and Western Medicine，2005，15(2) :76-78．
［6］冯正权，郭勇，朱宁希，等．复方三根制剂逆转多药耐
药的实验研究［J］．中国肿瘤，2003，12(6) :370-371．
［7］Wang H Z H，Wang H B，Gao H，et al． Clinical Obser-
vation on Treatment of 34 Advanced Gastric Carcinoma
Patients by Chemotherapy of DCF Regimen Combined
with Fuzheng Hewei Decoction［J］． Chinese Journal of
Integrated Traditional and Western Medicine，2007，27
(10) :927-929．
［8］Xiao B K，Huang R Q，Luo C H H，et al． The study to
anti-radiation function of Radix Actinidiae extract［J］．
Chin J Radiol Med Prot，2006，26(4) :408．
［9］Shin S，Sung B J，Cho Y S，et al． An anti-apoptotic pro-
tein human survivin is a direct inhibitor of Caspase-3 and
Caspase-7［J］． Biochemistry，2001，40(4) :1117-1123．
［10］Malcles M H，Wang H W，Koumi A，et al． Characteri-
sation of the anti-apoptotic function of survivin-DeltaEx3
during TNFalpha-mediated cell death［J］． Br J Cancer，
2007，96(11) :1659-66．
［11］Fulda S，Debatin K M． Resveratrol-mediated sensitisation
to TRAIL-induced apoptosis depends on death receptor
and mitochondrial signalling［J］． Eur J Cancer，2005，
41(5) :786-798．
［12］ Suzuki A，Ito T，Kawano H，et al． Survivin initiates
procaspase 3 /p21 complex formation as a result of inter-
action with Cdk4 to resist Fas -mediated cell death［J］．
Oncogene，2000，19(10) :1346-1353．
［13］ Ito T，Shirak K，Sugimoto K，et al． Survivin promotes
cell proliferation in human hepatocelluar carcinoma［J］．
Hepatology，2000，31(5) :1080-1085．
［14］Altieri D C． Coupling apoptosis resistance to the cellular
stress response:The IAP-Hsp90 connection in cancer
［J］． Cell Cycle，2004，3(3) :255-256．
(编辑:张翠英)