全 文 ：土模皮 乙酸体外诱导 He La 细胞凋亡
龚显峰 ’ , 2 , 王敏伟“ , 吴振 ’ , 田代真一 3 , 小野寺敏 3 ,池岛乔 ’ ` (l . 沈阳药科大学中日医药研究所 ,辽 宁 沈阳 1 10 16 ; 2 . 沈阳药
科大学 C U 〕中心 ,辽宁 沈阳 1田16 ; 3 . 昭和药科大学病态科学教研室 , 东京 194 一8 54 3)
摘要 : 目的 研究土桂皮 乙酸 (声eu do lan 。 。 ic d )B 诱导 eH肠 细胞凋 亡的作用 ,探讨其抗癌作用机制 。 方法 采用邃哇蓝 ( M r l
法 ) 、 形态学观察 、 DNA 凝胶电泳及 W es et m bl ot 检测法 。 结果 土桂皮 乙酸可剂量 一时间依赖性的诱导 H e巨 细胞调 亡 , 5 脚。
L
一 ’土桂皮 乙酸处理 24 h 的细胞 , H~ hs t 3 25 8 荧光染色后有明显的凋亡小体出现 ; 处理 36 h 的细胞 ,有明显 的 DNA la ( Id e : 出
现 。 cB l一 2 蛋白表达量 一时间依赖性地减少 , cB l一 xI 蛋 白表达无 明显 变化 , 而 B ax 和 户 3 蛋白表达量一时间依赖性地增加 。 结论
土桂皮乙酸时 H el 二 细胞的杀伤作用主要通过诱导细胞凋亡 , 降低 & l一2 蛋 白的表达 和增加 B ax , 卢3 蛋 白表达为其诱发 eH u
细胞凋亡的机制之一 L
关键词 : 土桂皮 乙酸 ; eH肠 细胞 ;凋亡
中图分类号 月弓肠3 文献标识码 : A 文章编号 : 10 1 一 2494 ( 2 《X) 5 )08 一 05 89 一 03
A op P如 15 of H e L a eC U 枷dI u e de by p犯 u d o l a ir e a c i d B in v动勺
田N G 兀 an 一fe n g l , 2 , W AN G M i n 一we iZ , W L nez n l , T ASH m o s h i n 一 i e h i3 , o N o D E以 ast o s h i 3 , IK卜习IM A 肠 kas h i l `
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s io ns of Bax 出 l d p 53 we er inc er 明Zd t ime 一 d e班兑n d e n d y . C O N C L US IO N r r lle e yt o ot x ie e fe C t of p se u do l而 e ac id B o n eH 肠 e el s was
二 in y d u e ot a l洲〕tP os i s . M i欧ho n idr al o n eoae nes an d p 5 3 ha hg t be i n v ol v ed in ht e a l洲〕otP it e l洽 th w a y s of 卿 u dol 面 e ac id B 一 etr a t曰 1 H e肠
e e l s
.
KE Y WO R刃居 :附u d o l抓 e ac i d B : H e压 e e l s ; a lx甲 ot s i s
土模皮乙酸 ( p s e u d o l丽C ac i d B )是从松科植物金
钱松 ( seP 汕坛瓜 kae 刀琴毋ir oG 记 . )的根皮 (土模皮 )中
分离出的有效成分 , 其结构见图 1。 近年来的研究
表明 , 土 模皮 乙 酸 对 朋 , HC T 一 8 , 5A 49 , L 12 10 , P -
3 5 5 [ `〕 ,心6 2 [2了, 瓦 B r [ 3 ]等细胞 的增殖 有抑制作用 。
本实验应用 M T r 法 、 荧光染色法 、 DN A 电泳 、 蛋白质
电泳观察土模皮乙酸体外抗 H e肠 细胞增殖作用 ,为
探讨土模皮乙酸的抗癌作用提供实验依据。
效的抗前列腺炎药 。
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(收稿日期 : 2X( 拜一05 拐 )
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作者简介 :龚显峰 ,男 , 博士
vi p s l n a
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( 024 ) 2 39 8印7 3 ` 通讯作者 : 池岛乔 , 男 , 教授 ,博士生导师 T己】: ( (〕24 ) 23 别冲拓 3 E 一 n俪1 : IK日i l l U t@
中国药学杂志 2以巧 年 4 月第 40 卷第 8 期 日比刀 月汕咖 J , 2仪万助成 , 脚 .叨 oN . 8 5 8 9
t (洲洲 , H
h
,最后加人 5 m ol · I 一 ’ N a c l ZO 拼L , 异内醇 120 2之I ,
一 20 ℃过夜 25 以 x ) x g 离心 20 m il , 收集沉淀 . 以
ir
* EDT A 缓冲液 ( p H 7
.
5) 溶解 二 提 出的 I)N A 用
2 % 琼脂糖凝胶在 lo v 下电泳 l 一1 , 以 0 . 5 : : g · , 1 11 一 ’
嗅化乙锭染色 巧 m i l l , 以蒸馏水洗 30 m i l l , 紫外灯 卜
于白只只
2
.
5 W
e s t e n l B l(
, t 分析蛋 白质的表达
收集 s x !护 个以 L细 胞 , l 以 x〕 x g 离 心 10
, n i n
,
p B s 洗 2 次 , 10 。, L 细胞裂解液 ( 50 mo l
·
l
一 ’
H E I, Es
,
l % 知 t ( ) n 一 xo , 10 rnmo l
·
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J 一 1 N a F
,
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·
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一 ’ E群 A , Z n。 ) l · l 一 ’ 正钒酸钠 , -
n 。 , 10 1
·
L
一 ’ PM s卜’ , 10 m g · m L 一 ’ 拌p 、 ta t i; , A ) 于冰 1一 裂
解 l h , 2 5 以 x ) x g 离心 5 ; n i: 1 , 收集 仁清 。 加人 20 : , I J
s x 上样缓冲液 ( 2 5 0 n o o一 L 一 `知 、 · H e一 ( p H 6 . 8 ) ,
10 % SD S
,
50 % 甘 油 , 0 . 5% 嗅酚 蓝 , 5 % 二琉 基乙
醇 ) , 沸水中煮 3 而 n ,使蛋白变性 旬个点样孔加样
15 砂 J 样品液 , 12 % S D S一聚丙烯酞胺凝胶分离蛋 白
质 。 凝胶上的蛋白带转移到硝酸纤维素膜上 , 5% 脱
脂奶粉封闭膜上的蛋白结合位点 , 加人抗 B ax , B ( · l一 2
和 户3 的抗体 (一抗 )及辣根酶标记的二抗 , 显色
3 结 果
3
.
1 土攫皮乙酸对 H e肠 细胞的生长抑制作用
不同浓度土模皮乙酸 ( 0 . 16 一 10 拼m( )l · L 一 ’ )不
同时间作用于细胞后 , 对 H el 。 细胞的细胞毒作用呈
明显的时间和剂量依赖性 , 见图 2。
瞬/锌凑景索、辞履早
图 1 土谨皮 乙酸的化学结构
iF g 1 C h e m ie 』 、 tur (、 t u伴 ( )f p s e u o lo la r l、 · a o i ( I B
1 材 料
细胞 : H e l五 细胞株 (美国 Am o ir e a , 1 巧p e Cu l tu 。
C o ll e
o t io n
,
ACT C )
药品与试#lj : 土谨皮乙酸 (中国药品生物制品检
定所 , 批号 : 0 85 0 一 9叭〕l ) 即M l 16取〕培 养基 ( H y -
c
ol
l e 公 司 ) , 胎牛血清 (北京 儿亨圣马生物试 剂公
司 ) , 甲基嚓哗蓝 M l ’ r ( A n ler s ( ( ) 公司 ) , H , e h s t 3 32 5 8
( iS gm
a 公司 ) Bax 多克隆抗兔抗体 、 P53 单克隆抗
鼠抗体 、 (B通一 2单克隆抗 鼠抗体 、 cB l一 x l单克隆抗鼠抗
体 、辣根过氧化酶标记的羊抗兔 、 羊抗 鼠二抗 ( San at
C ur
z B i o t e e h n o lo舒 公司 )
2 方 法
2
.
1 细胞培养
细胞单层接种在含 or % 胎牛血清 , 2 ~ ol
·
I
J 一 ’
谷氨酞胺的 -RP M I一 16粼〕培养液中 ,在饱和湿度 ,温度
为 37 ℃ , c姚浓度为 5% 的培养箱中培养 。
2
.
2 细胞生长抑制
H e肠细胞 , 5 x l护个 · m L 一 ’ , 接种于 % 孔培养
板 ,每孔 10 1,1 。 培养 12 h ,分别加人浓度为 0 . 16 -
10 1
, m o l
·
I厂 ’ 土模皮乙酸 , 培养 12 , 2 4 , 36 , 4 8 h 后 ,
M竹 法测定细胞生长抑制率 、
.2 3 细胞形态学变化观察
在密度为 1护个 · mL 一 ’ 的 H e助 细胞 中加人土模
皮乙酸 5卿卜 L 一 ’ , 培养 24 h ,收集细胞用 BP s 洗 1次 , l姗 x g 离心 5 m in , 以 10 拌L 3 . 7 % 多聚甲醛重悬细胞 ,固定 30 m in l 以x〕 x g 离心 5 而 n ,弃 _ _仁清 ,
以 PB s 洗 1 次 ,加入 10 子L BP S 重悬细胞 ,取 or 拼L
细胞悬液 ,加人 2 拼1 Hoe e h s t 33 25 5 ( 1 mo
l
·
L
一 ’ ) 使
其终浓度为 167 拜I n o l · L 一 ’ , 37 ℃染色 10 而 n , 荧光显
微镜下观察 。
2
.
4 DNA 提取和 D NA 片段化分析
收集 1 / 1护个以上细胞 , 1姗 x g 离心 10 而 n ,
以 PB S 洗 2 次 , 10 拼L 细胞裂解液 ( or ~ 1
·
L
一 `
irT
s 一H C I p H 7
.
4
,
10
fmon
l
·
L
一 1 E D I
,
A p H 5
.
0
,
0
.
5%
介otn x 一 10 ) 4℃裂解 10 而 n , 2 5 。以〕 x g 离心 20 而 n ,
收集上清 , 加人 20 gm · mL 一 ’ NR ase A Z 拼L , 37 ℃温育
l h
,再加入 20 嘿 · fnL 一 ’ p or et in as 。 K Z 拼L , 37℃温育 l
·
59 0
·
hC in )P
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图 2 土懂皮乙酸对 H e 肠 细胞的生长抑制作用 . n = 3 , x 士 、
A 一 浓度与抑制率关系 ; B 一 时间与抑制率关系 ; ’ 〕尸 < 0 . 01 , 2 )尸 < 0 . 田 1 ’ 。空 f {
组 比较
R g 2 Inh ib ito 尽 e fe ` t of 附ud ol an e ac id B o n H e h e e l
grO 州 11
.
n 二
3
,无 士 s
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n加 r一on vs shn i ib ti on art e : H一 t~ v s 1 1 11111) , t一o n art 。 ; l 〕尸 < o刀一, 2 ) 尸 < ( ) o -
V s c
on 肋 l 朗 皿lp
3
.
2 土懂皮 乙酸诱导细胞死 亡 的形态学变化
荧光显微镜下观察正常细胞全部蓝染 , 细胞壁
完整 ,见图 3 A ,土模皮乙酸 5 拜mo l · L 一 ’ 作用细胞 24
h 后 ,细胞内有颗粒形成 , 即凋亡小体 , 见图 3 B ,箭头
所示 ,是细胞发生凋亡的典型形态 。
中国药学杂志 2〕 : js 年 4 月第 40 卷第 8 期
B e l
一
2
B c卜 x l
图 3土模皮 乙酸诱导 e H l, 细胞凋亡的形态学变化
A一 对照 ; B 一 土模皮乙酸 (5 z” 1旧 1. I J一 I )作用 24 h。 箭头所指为固缩的细胞核
R g 3 M。甲卜司咱 e习 e h二 lse of H e压 e e l ls hy fl u o~ e , e n ` ( or -
义 o ep
A一 c O l lnt ;l) B一 能 ls w限 咖同 州 ht 附 u南俪 (’ 以记 H sl ~ .l 一 1 f()r 24 h A~云d 弓对 t. c u川 Iel 洲 , 11 把卜1
3
.
3 细胞凋亡的 DN A 片段化分析
细胞凋亡时核内的内切核酸酶活化 , 活化了的
内切核酸酶将 D NA 链在核小体连接区切成缺 口 ,形
成若干 18 0 一 20 坤 或其倍数的寡核昔酸片段 , 在
琼脂糖凝胶电泳上呈 “ 阶梯状 ” 图谱 。 这被作为判断
有无凋亡发生的客观指标之一 。 不同剂量的土模皮
乙酸作用 36 h 后 , 可诱导 H e肠 细胞 发生 明显 的
DNA 片段化 ,即诱导细胞发生凋亡 ,见图 4 。
图 4 土懂皮乙酸诱导 H e巨细胞的核酸片段化
M 一 M . 击e r ; 1 一 5 一 土模皮乙酸 0 , 2 . 5 , 5 , ro , 2D ,~ 卜 L 一 I处理 36 h
R g 4 DN A fr a g 刀 e ant
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户1 . 卜 I 一 1 for 36 h
3
.
4 土谨皮乙酸对蛋白表达的影响
在 5 2丈1l lo l . L 一 ’土模皮乙酸作用不同时间后 ,户3
蛋白的表达随时间的延长而增加 , 见图 5 。 cB l一 x L的
表达无明显变化 , cB l 一 2 的表达下降 ,而 Bax 的表达
逐渐增加 ,见图 6 。
0 1 2 2 4 3 6 4 8 了 h
p ,小 - ~ - - - … n一一 I图 5 土攫皮 乙酸对 卢3 蛋 白表达的影响R g 5 E fe e t of 卿 u d o l面。 ac id B on 户 3 pmt e ln e x p此 s ion4 讨 论细胞凋亡是受特定基因调控的主动性细胞自我消亡的过程 ,具有独特的形态和生化特征 ,包括质膜的改变 , 如细胞膜不对称性和细胞附着消失 ,胞浆和
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一
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,
[— 曲吧竺二岁一 -— _理竺竺 }图 6 土懂皮 乙酸对 & 1一2 , cB l一 x L 和 Ba x 蛋 白表达的影响
F i g 6 E fe
c t of 附 ul lo iar ` · a e id B on cB l一2 , B e l一 x L an d Bax 帅 -
t e l n e x P r e豁 I o n
细胞核固缩 ,核内 DN A 裂解 ! 4 〕。
p 53 是典型的抑癌基因 ,在稳定染色体 DNA 上充
当基因组卫士作用 ,在细胞的 lG 期监视细胞基因组的
完整性 。 近年来人们发现 沪3 蛋白与细胞凋亡有密切
关系囚 。 当 DNA 受损而无法修复时 ,间 蛋白通过上
调 户l 使细胞周期停止于 lG 期 , 同时诱导凋亡 。 leI 肠
细胞经土模皮乙酸处理 ,其 户3 蛋白表达呈时间依赖
性 ,作用 肠 h 后显著增加 ,说明哪 蛋白在土模皮乙酸诱导的细胞凋亡中参与了细胞凋亡的调控 。 文献川报
道 , il Br 细胞经土模皮乙酸处王卿舀,其 夕l 的表达增加 ,
可能是 5P 3蛋白促进 夕l 蛋白的表达 ,从而使细胞阻滞
在 G l 期 ,抑制肿瘤细胞的增长 。
cB l家族是 目前备受关注的与细胞凋亡关系密
切的基因之一 , 它包括 cB l一2 , B ax , cB l一 xL 等〔6 ] 。 其中
Bd
一
2 及 B d 一 xl 主要抑制细胞凋亡 ,而 Bax 则促进凋
亡〔7 } 。 cB l一 2 家族成员中可发生相互作用即彼此之
间的同源或异源聚合共同调节细胞凋亡 。 其中 cB l -
2/ Bax 的比例可决定细胞的命运 ,其比例增高 , 细胞
不易发生凋亡 , 而比例降低则导致细胞凋亡 。 H e加
细胞经土模皮乙酸处理后 , B ax 蛋白表达增加 , cB l一2
表达减少 , B d 一 2 / Bax 的比例降低 , 细胞发生凋亡 。
综上所述 , 土模皮乙酸可通过上调 户3 蛋白的
表达和降低 cB l一 2 / B ax 的比例诱导 H e U 细胞凋亡 。
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