全 文 ：第３４卷第３期
２０１２年９月
湖北大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｕｂｅｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）
Ｖｏｌ．３４　Ｎｏ．３　
Ｓｅｐ．，２０１２　
收稿日期：２０１２－０５－２１
基金项目：湖北省自然科学基金（２０１０ＣＤＢ０７３０１）资助
作者简介：喻林（１９８７－），男，硕士生；陈勇，通信作者，教授，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｙ１０１６１０＠ｙａｈｏｏ．ｃｎ
文章编号：１０００－２３７５（２０１２）０３－０２８６－０６
桑肠杆菌ＶＬ４－３转化阿魏酸生产香兰素
喻林１，魏敏２，陈义坤２，罗诚浩２，宋旭艳２，王洁１，陈勇１
（１．湖北大学中药生物技术省重点实验室，湖北 武汉４３００６２；
２．湖北中烟工业有限责任公司技术中心，湖北 武汉４３００４０）
摘要　对能转化阿魏酸生成香兰素的一株桑肠杆菌ＶＬ４－３的发酵培养基、发酵培养条件、种子培养基和
种子培养条件进行优化．确定了液体发酵的最佳培养基：麸皮１０ｇ／Ｌ，豆粕１ｇ／Ｌ，氯化钠０．５ｇ／Ｌ，硫酸亚铁
０．５ｇ／Ｌ，ｐＨ＝８；最佳发酵培养条件：接种量１０％，摇瓶装液量１０％，阿魏酸最大加入量１０ｇ／Ｌ，３７℃，
１００ｒ／ｍｉｎ，避光培养１２ｄ；最佳种子培养基：牛肉膏蛋白胨培养基；最佳种子培养条件：２５℃，１００ｒ／ｍｉｎ，２４ｈ．
在上述优化发酵条件下，发酵液中香兰素最大浓度为２　２６２．４３ｍｇ／Ｌ，最大转化率为２８．８７％．
　　关键词　阿魏酸；香兰素；桑肠杆菌；微生物转化
　　中图分类号　Ｑ９３９．９９　　文献标志码　Ａ　　
香兰素（Ｖａｎｉｌｉｎ）又名香草醛，化学名为３－甲氧基－４－羟基苯甲醛．是一种以奶油香草为特征的风味
物质，广泛用于冰淇淋、巧克力、乳制甜点、奶油糖果、焙烤食品、豆奶、可乐饮料和烟酒等食品制造中［１］．
香兰素年用量很大，多数为化学合成［２］，其中以愈创木酚和木质素为原料合成的香兰素为主［３］．天然香
兰素主要是从香荚兰豆荚中提取，由于香荚兰植物的种植受地域和气候环境的限制，产量极少，远远不
能满足市场的需求［４］．但是大多数化学合成的香兰素在纯度、香气、安全性等方面都亚于天然提取的香
兰素，并且化学工艺产生的废弃物对环境存在很大危害．近年来，美国和欧洲的法律认可采用生物活细
胞或其中的组成部分所生产的物质为天然产物［５］．因此，利用微生物转化法生产天然香兰素成为目前的
研究热点［６］．本实验室从香荚兰茎中筛选得到的一株桑肠杆菌ＶＬ４－３，并首次发现其能转化阿魏酸生产
香兰素，对其发酵转化阿魏酸生产香兰素的发酵工艺进行了研究．
１　材料与方法
１．１　菌种与培养基　桑肠杆菌 ＶＬ４－３：从香荚兰植物的茎中筛选得到，并经过生理生化分析、
１６ＳｒＤＮＡ扩增和序列分析鉴定为桑肠杆菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｍｏｒｉ）．斜面培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养
基）：马铃薯浸液２００ｍＬ／Ｌ，葡萄糖２０ｇ／Ｌ，琼脂１３ｇ／Ｌ．原始种子培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉
膏５ｇ／Ｌ，蛋白胨１０ｇ／Ｌ，氯化钠５ｇ／Ｌ．发酵原始培养基（高氏一号培养基）：可溶性淀粉２０ｇ／Ｌ，ＫＮＯ３
１ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ　０．５ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ　０．５ｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ　０．０１ｇ／Ｌ．麦芽糖蛋白胨
培养基：麦芽糖５０ｇ／Ｌ，蛋白胨１０ｇ／Ｌ，氯化钠５ｇ／Ｌ．
１．２　试剂与仪器　试剂：甲醇（色谱纯）；冰乙酸（分析纯）；香兰素（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ公司，９９．９９％）；阿魏
酸（陕西森弗生物技术有限公司，９８％）及其储备液（称取一定量的阿魏酸，在热水中加热至完全溶解，用
１ｍｏｌ／Ｌ的氢氧化钠调ｐＨ到７．０，定容到３０ｇ／Ｌ，然后用过滤法灭菌，４℃避光保存）．香兰素（Ｓｉｇｍａ－
Ａｌｄｒｉｃｈ公司，９９．９９％）．仪器：Ａｇｌｉｅｎｔ　１１００高效液相色谱仪，柜式恒温摇床（武汉中科科仪技术发展有
限公司，ＨＱＬ　３００Ｂ），无菌操作台（苏净集团安泰公司，ＳＷ－ＣＪ－１ＦＤ）．
１．３　培养方法　 初始种子液培养方法：用接种环挑取一环Ｌ４－３到装有２００ｍＬ液体种子培养基的
第３期 喻林等：桑肠杆菌ＶＬ４－３转化阿魏酸生产香兰素 ２８７　
５００ｍＬ三角瓶中，３０℃，１５０ｒ／ｍｉｎ培养２４ｈ．
初始发酵方法：将Ｌ４－３菌种以１０％（Ｖ／Ｖ）的接种量接入到发酵培养基中，３０℃，１５０ｒ／ｍｉｎ培养
２４ｈ，加入２．７ｇ／Ｌ的阿魏酸，３０℃，１５０ｒ／ｍｉｎ培养１２ｄ．
１．４　样品含量测定方法　 取一定量的发酵液，按１∶４的比例加入甲醇，震荡３０ｍｉｎ，１１　０００ｒ／ｍｉｎ离
心５ｍｉｎ取上清，０．２２μｍ滤膜过滤（过滤时弃掉首先滤出的３ｍＬ）．经上述处理的发酵液用高效液相
色谱检测香兰素含量，色谱条件为：Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｅｃｌｉｐｓｅ　ＸＤＢ－Ｃ８色谱柱 （５μｍ，４．６ｍｍ＊１５０ｍｍ），甲醇／
０．５％冰乙酸（３０／７０，Ｖ／Ｖ）流动相，流速１ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长２８０ｎｍ，进样量１０μＬ，检测时间４０ｍｉｎ．
用５０％甲醇溶液配制１ｇ／Ｌ的标准样品溶液，稀释成一系列不同浓度，每次进样１０μＬ，以峰面积对标
准样品浓度作图，绘制标准曲线．香兰素浓度和摩尔转化率计算方法为：Ｃ香兰素＝（Ａ香兰素峰面积－２３．９４８）／
４０．９８９；摩尔转化率／％＝（ｎ香兰素／ｎ阿魏酸）×１００．
２　结果及分析
２．１　发酵培养基对香兰素产量的影响
２．１．１　碳源对香兰素产量的影响　以高氏一号培养基为基础培养基，固定氮源和无机盐，分别以淀粉、
葡萄糖、蔗糖、Ｄ－果糖、麦芽糖、麦芽浸粉、麸皮和谷壳作为碳源，浓度均为２０ｇ／Ｌ，考察不同碳源对香兰
素产量的影响．由图１可知，不同碳源对香兰素产量影响由高到低依次是谷壳、麸皮、蔗糖、淀粉、麦芽浸
粉、麦芽糖、葡萄糖和果糖．实验结果表明缓效碳源（麸皮和谷壳）比速效碳源更易于桑肠杆菌ＶＬ４－３将
阿魏酸转化为香兰素，这可能是由于缓效碳源中含有微生物生长所必需的生长因子（硫胺素、核黄素、尼
克酸等）、多糖（戊聚糖）等［７－８］，故选择麸皮作为桑肠杆菌ＶＬ４－３产香兰素的最佳碳源．
２．１．２　氮源对香兰素产量的影响　以高氏一号培养基为基础培养基，固定碳源和无机盐，分别以酵母
粉、黄豆饼粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、动物蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵和豆粕作为氮源，浓度均为
１ｇ／Ｌ，考察不同氮源对香兰素产量的影响．由图２可知，不同氮源对香兰素产量的影响由高到低依次是
豆粕、黄豆饼粉、牛肉膏、动物蛋白胨、酵母粉、大豆蛋白胨、硝酸钾、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵．实验结果表
明以豆粕、硝酸铵、牛肉膏、酵母粉和硝酸钾为氮源时香兰素产量较高，但考虑到生产成本和产物香兰素
的天然性，选择豆粕作为桑肠杆菌ＶＬ４－３产香兰素的最佳氮源．
图１　不同碳源对香兰素产量的影响 图２　不同氮源对香兰素产量的影响
图３　不同无机盐离子对香兰素产量的影响
２．１．３　无机盐离子对香兰素产量的影响　以高氏一号
培养基为基础，固定碳源和氮源，分别以 Ｎａ２ＨＰＯ４、
ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＣａＣｌ２ 作为无机盐，
浓度均为０．５ｇ／Ｌ，考察不同无机盐对香兰素的影响．由图
３可知，磷酸氢盐不利于菌种转化阿魏酸生成香兰素，而硫
酸盐利于香兰素的产生，其中以ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ为无机盐时
香兰素的产量最高，故选择ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ作为桑肠杆菌
ＶＬ４－３转化阿魏酸生产香兰素的最佳无机盐．
２．１．４　最佳碳源氮源和无机盐相对含量的确定－正交试验　选取Ｌ９（３４）正交表，对影响香兰素产量
２８８　 湖北大学学报（自然科学版） 第３４卷
的碳源（麸皮）、氮源（豆粕）和无机盐（硫酸亚铁）的添加量进一步做正交试验，其因素和水平见表１，分
表１　正交设计因素和水平表
水平 麸皮／（ｇ／Ｌ） 豆粕／（ｇ／Ｌ） 硫酸亚铁／（ｇ／Ｌ）
１　 １０　 １　 ０．５
２　 ２０　 ３　 １．０
３　 ５　 ２　 １．５
析结果见表２．由表２的方差分析可见，３个因素对香
兰素产量的影响顺序为硫酸亚铁＞麸皮＞豆粕，即
硫酸亚铁的用量对香兰素产量影响最大，豆粕用量
对香兰素产量影响最小．根据表２的结果可知最佳组
合为麸皮１０ｇ／Ｌ，豆粕１ｇ／Ｌ，硫酸亚铁０．５ｇ／Ｌ．
表２　正交设计实验表及结果
序号 麸皮 豆粕 误差列 硫酸亚铁 质量浓度／（ｍｇ／Ｌ）
１　 １　 １　 １　 １　 １８．７１
２　 １　 ２　 ２　 ２　 ３．２２
３　 １　 ３　 ３　 ３　 １３．２３
４　 ２　 １　 ２　 ３　 ５．０２
５　 ２　 ２　 ３　 １　 １６．２５
６　 ２　 ３　 １　 ２　 ５．２５
７　 ３　 １　 ３　 ２　 ６．８２
８　 ３　 ２　 １　 ３　 ７．９０
９　 ３　 ３　 ２　 １　 １１．０７
因素
效应值
Ｋ１　 １１．７２　 １０．１８　 １０．６２　 １５．３４
Ｋ２　 ８．８４　 ９．１２　 ６．４３　 ５．１０
Ｋ３　 ８．５９　 ９．８５　 １２．１０　 ８．７１
因素
效应
Ｋ１′ ２．００　 ０．４６　 ０．９０　 ５．６２
Ｋ２′ －０．８８ －０．５９ －３．２８ －４．６２
Ｋ３′ －１．１２２　 ０．１３２　 ２．３８２ －１．００５
极差 Ｒ　 ３．１２４　 １．０６０　 ５．６６６　 １０．２３４
因素的方差 Ｄ（Ｆｉ） １８．１１　 １．７６　 ５１．８２　 １６１．９１
Ｆ比（２，２） ０．３５　 ０．０３　 ３．１３
显著性 不显著 不显著 不显著
影响顺序 ２　 ３　 １
最优水平 １　 １　 １
Ｆ０．０５（２，２）＝１９；Ｆ０．０１（２，２）＝９９；Ｆ０．００１（２，２）＝９９９
质
量
浓
度
的
总
平
均
值
９．７２ｍｇ／Ｌ
２．２　发酵培养条件对香兰素产量的影响
２．２．１　发酵培养基初始ｐＨ值对香兰素产量的影响　使用优化后的培养基，考察培养基的不同初始
ｐＨ值对香兰素产量的影响．由图４可以看出，初始培养基ｐＨ在３～５时香兰素的产量较低，初始培养
基ｐＨ在６～１０时香兰素的产量相对较高，说明初始培养基在中性及偏碱性条件下更有利于桑肠杆菌
ＶＬ４－３将阿魏酸转化为香兰素，且当ｐＨ值为８时香兰素的浓度最高，故选用ｐＨ　８作为发酵培养基的
最佳ｐＨ值．
图４　发酵培养基初始ｐＨ值对香兰素产量的影响 图５　发酵温度对香兰素产量的影响
２．２．２　发酵温度对香兰素产量的影响　使用优化的培养基（ｐＨ＝８．０），考察不同发酵温度对香兰素产
量的影响．由图５可以看出，当温度在３０～３７℃之间时，香兰素的产量逐渐升高；当温度在３７～４０℃
时，香兰素的产量显著降低．且当温度在３７℃时，发酵液中的香兰素浓度最高，故以３７℃作为菌种转化
第３期 喻林等：桑肠杆菌ＶＬ４－３转化阿魏酸生产香兰素 ２８９　
阿魏酸生产香兰素的最佳发酵温度．
２．２．３　接种量、阿魏酸添加量和阿魏酸添加时间对香兰素产量的影响　在上述优化的培养条件下，选
取Ｌ９（３４）正交表，考察菌种接种量、底物添加量和底物添加时间对香兰素产量的影响．试验因素和水平
表３　正交设计因素和水平表
水平 接种量／％ 阿魏酸加入时间／ｈ 阿魏酸加入量／（ｇ／Ｌ）
１　 １０　 ７２　 ２．７
２　 ２０　 ４８　 ５．０
３　 ２　 ２４　 ８．５
设计见表３，试验结果方差分析见表４．
结果表明，３个因素对香兰素产量的影
响顺序为阿魏酸加入量＞阿魏酸加入时
间＞菌种接种量，三因素最佳组合为菌
种 接 种 量 为 １０％，底 物 添 加 量 为
８．５ｇ／Ｌ，底物添加时间为２４ｈ．
表４　正交设计实验表和结果分析
序号 接种量 底物加入时间 误差列 底物加入量 质量浓度／（ｍｇ／Ｌ）
１　 １　 １　 １　 １　 ３０．７９
２　 １　 ２　 ２　 ２　 ６６．８２
３　 １　 ３　 ３　 ３　 １８０．１０
４　 ２　 １　 ２　 ３　 １２８．２１
５　 ２　 ２　 ３　 １　 ３０．４５
６　 ２　 ３　 １　 ２　 ７２．３９
７　 ３　 １　 ３　 ２　 ６９．０２
８　 ３　 ２　 １　 ３　 １５５．２３
９　 ３　 ３　 ２　 １　 ４７．８５
因素
效应值
Ｋ１　 ９２．５６　 ７６．０１　 ８６．１３　 ３６．３６
Ｋ２　 ７７．０１　 ８４．１７　 ８０．９５　 ６９．４１
Ｋ３　 ９０．７０　 １００．１１　 ９３．１９　 １５４．５１
因素
效应
Ｋ１′ ５．８０ －１０．７５ －０．６２ －５０．３９
Ｋ２′ －９．７４ －２．５９ －５．８０ －１７．３５
Ｋ３′ ３．９４　 １３．３５　 ６．４２　 ６７．７５
极差 Ｒ　 １５．５５　 ２４．１０　 １１８．１５
因素的方差 Ｄ（Ｆｉ） ４３２．７３　 ９０１．９６　 ２２６．２１　 ２２　２９３．９０
Ｆ比（２，２） １．９１　 ３．９８　 ９８．５５
显著性 不显著 不显著　 显著
影响顺序 ３　 ２　　 １
最优水平 １　 ３　　 ３
Ｆ０．０５（２，２）＝１９；Ｆ０．０１（２，２）＝９９；Ｆ０．００１（２，２）＝９９９
质
量
浓
度
的
总
平
均
值
８６．７６ｍｇ／Ｌ
２．２．４　摇瓶装液量和转速对香兰素产量的影响　转速和摇瓶装液量是影响溶氧及氧化还原反应的两
个重要因素．在上述优化的实验条件和固定转速（１００ｒ／ｍｉｎ）情况下，考察了装液量对香兰素产量的影
响．由图６可以看出，当装液量大于容器容积１０％时，发酵液中香兰素的浓度均明显降低，故实验选用
１０％的装液量（５００ｍＬ三角瓶中加入５０ｍＬ发酵培养基）．在上述优化的实验条件下和固定装液量（容
器容积的１０％）情况下，考察摇床转速对香兰素产量的影响．由图７可以看出，随着转速的增加，香兰素
的产量降低，当发酵转速为１００ｒ／ｍｉｎ时，发酵液中香兰素的浓度最高，故实验选用１００ｒ／ｍｉｎ为发酵
转速．
２．２．５　发酵过程光照／避光对香兰素产量的影响　由于香兰素和阿魏酸在光照条件下易分解，因此我
们考察光照发酵和避光发酵对香兰素产量的影响．由图８可以看出，在避光发酵条件下香兰素的产量更
高，因此桑肠杆菌ＶＬ４－３转化阿魏酸生产香兰素更适合在避光条件下进行．
２．３　种子培养基和培养条件的优化
２．３．１　种子液的培养温度对香兰素产量的影响　以上述优化的发酵培养基与发酵培养条件下，考察种
子培养温度对香兰素产量的影响，结果见图９．随着种子液的培养温度增加，香兰素产量逐渐降低，故实
验选用２５℃作为种子培养的最佳温度．
２９０　 湖北大学学报（自然科学版） 第３４卷
图６　摇瓶装液量对香兰素产量的影响 图７　发酵转速对香兰素产量的影响
图８　光照条件对香兰素产量的影响 图９　种子培养温度对香兰素产量的影响
２．３．２　种子培养基对香兰素产量的影响　考察高氏一号培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽糖蛋白胨
培养基作为种子培养基对香兰素产量的影响，结果见图１０．由于高氏一号培养基的营养贫乏，种子液中
的菌种繁殖较慢，导致接种到发酵培养基中的菌种量少，因而得到的香兰素浓度较低．牛肉膏蛋白胨培
养基和麦芽糖蛋白胨培养基中营养充足，但后者相对前者发酵液中香兰素浓度更高，因此选择麦芽糖蛋
白胨培养基作为该菌种转化阿魏酸生产香兰素的种子培养基．
２．３．３　种子液的转速对香兰素产量的影响　种子液培养转速能影响菌种的数量，因此考察种子液培养
转速分别为１００、１５０、２００ｒ／ｍｉｎ时对香兰素产量的影响，结果见图１１．在１００ｒ／ｍｉｎ时香兰素的产量最
高，１５０ｒ／ｍｉｎ时香兰素的产量最低，故选择１００ｒ／ｍｉｎ作为种子培养基的培养转速．
图１０　种子培养基对香兰素产量的影响 图１１　种子液培养转速对香兰素产量的影响
图１２　底物加入量对香兰素产量的影响
２．４　底物最大加入量　由于阿魏酸对菌种有一定的
毒性，因此菌种对阿魏酸的耐受程度直接影响发酵液
中香兰素的浓度．在接种２４ｈ后，我们分别考察底物
加入量对香兰素产量的影响．图１２是不同底物添加
量培养１２ｄ时香兰素的含量测定结果．当阿魏酸加
入量在５．００～１０．００ｇ／Ｌ之间，香兰素产量升高，当
阿魏酸加入量在１０．００～１３．３３ｇ／Ｌ之间时，香兰素
的产量呈递减趋势．因此选用１０ｇ／Ｌ的阿魏酸作为
该菌种的最大耐受量．
第３期 喻林等：桑肠杆菌ＶＬ４－３转化阿魏酸生产香兰素 ２９１　
２．５　优化结果的验证　经优化得到ＶＬ４－３转化阿魏酸生成香兰素的最佳发酵条件如下．
液体发酵的最佳培养基：麸皮１０ｇ／Ｌ，豆粕１ｇ／Ｌ，氯化钠０．５ｇ／Ｌ，硫酸亚铁０．５ｇ／Ｌ，ｐＨ＝８；最佳
发酵培养条件：接种量１０％，摇瓶装液量１０％，阿魏酸最大加入量１０ｇ／Ｌ，３７℃，１００ｒ／ｍｉｎ，避光培养
１２ｄ；最佳种子培养基：牛肉膏蛋白胨培养基；最佳种子培养条件：２５℃，１００ｒ／ｍｉｎ，２４ｈ．
用以上的优化条件，进行了３次重复发酵实验，得到香兰素的浓度为２　２６２．４３ｍｇ／Ｌ，转化率达到
２８．８７％．比优化前香兰素浓度（２９．６ｍｇ／Ｌ）提高了７６．４３倍，转化率提高了１１．４倍．
３　结论
通过单因素实验和正交试验优化后，桑肠杆菌ＶＬ４－３将阿魏酸转化为香兰素的发酵培养基组成为
麸皮１０ｇ／Ｌ，豆粕１ｇ／Ｌ，氯化钠０．５ｇ／Ｌ，硫酸亚铁０．５ｇ／Ｌ，ｐＨ＝８．０；种子液培养基组成为麦芽糖
５０ｇ／Ｌ，蛋白胨１０ｇ／Ｌ，氯化钠５ｇ／Ｌ．种子液的培养条件为２５℃、１００ｒ／ｍｉｎ转速培养２４ｈ．在容器装
液量为１０％的发酵培养基中接种１０％的 ＶＬ４－３种子液，培养２４ｈ，加入１０ｇ／Ｌ的阿魏酸，３７℃、
１００ｒ／ｍｉｎ转速避光培养１２ｄ，发酵液中香兰素的浓度达到２　２６２．４３ｍｇ／Ｌ，转化率达到２８．８７％．
４　参考文献
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ｎａｔｕｒａｌ　ｖａｎｉｌｉｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，１９９９，７９：４８７－４９０．
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Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｅｒｕｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｏ　ｖａｎｉｌｉｎ
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ｔｒａｎｓｆｏｒｍ　ｆｅｒｕｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｏ　ｖａｎｉｌｉｎ．Ａｎｄ　ｔｈｅｎ，ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｌｉｑｕｉｄ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｗａｓ　１０ｇ／Ｌ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ　ｂｒａｎ，１ｇ／Ｌ　ｏｆ　ｓｏｙｂｅａｎ　ｍｅａｌ，０．５ｇ／Ｌ　ｏｆ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ，０．５ｇ／Ｌ
ｏｆ　ｆｅｒｒｏｕｓ　ｓｕｌｆａｔｅ，ｐＨ ＝８；ｏｐｔｉｍｕｍｅｄ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗａｓ　１０％ ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｏｃｕｌｕｍ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，１０％ｏｆ　ｌｉｑｕｉｄ　ｓｈａｋｅ　ｂｏｔｔｌｅ，１０ｇ／Ｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｘｉｍｕｍ　ａｍｏｕｎｔ　ｆｏｒ　ａｄｄｉｎｇ　ｆｅｒｕｌｉｃ　ａｃｉｄ　ａｔ
３７℃，ｓｐｅｅｄ　ｆｏｒ　１００ｒ／ｍｉｎ，ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ　ｄａｒｋｌｙ　ｆｏｒ　１２ｄａｙｓ；ａｎｄ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｓｅｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗａｓ　ｂｅｅｆ　ｅｘｔｒａｃｔ
ｐｅｐｔｏｎｅ　ｍｅｄｉｕｍ；ｔｈｅ　ｓｅｅｄ　ｗａｓ　ｂｅｓｔ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ａｔ　２５℃，ｓｐｅｅｄ　ｆｏｒ　１００ｒ／ｍｉｎ　ｆｏｒ　２４ｈｏｕｒｓ．Ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ
ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｍａｘｉｍｕｍ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ｖａｎｉｌｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｕｐ　ｔｏ　２　２６２．４３ ｍｇ／Ｌ　ｉｎ　ｔｈｅ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｒｏｔｈ，ｔｈｅ　ｍａｘｉｍｕｍ　ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　２８．８７％．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ｆｅｒｕｌｉｃ　ａｃｉｄ；ｖａｎｉｌｉｎ；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｍｏｒｉ；ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
（责任编辑 游俊）