全 文 ：反相高效液相色谱法同时测定发酵液中的阿魏酸 、香草酸和香草醛
李永红　郑志强　孙志浩＊
(江南大学生物工程学院生物催化研究室 , 工业生物技术教育部重点实验室 , 无锡 214036)
2002-12-20收稿;2003-06-10接受
1　引　　言
香草醛(Vanillin , Vin)是食品 、饮料等工业应用最广泛的香料之一 ,还可作为保鲜剂及医药等工业的原材料。香草醛
目前主要由化学方法制备 ,但化学合成制得的香草醛不属于天然香料。天然香草醛可以从香子兰的花荚中提取 ,得到的
香草醛量少且价高。根据美国和欧盟的规定 ,合成香草醛在食品添加剂中的使用会引起法律方面的争议 , 由此促进了用
生物技术方法生产香草醛的研究。生物转化法生产香草醛多采用阿魏酸(Ferulicacid , FA)作为前体物质 , 转化过程中会
产生香草酸(Vanillic acid , VA)等中间产物。曾报道过薄层色谱法(TLC)能同时测定阿魏酸 、香草酸和香草醛 , 该方法是
对发醇过程进行快速监测的行之有效的方法 , 但其缺点是定量欠准确 ,层析时板与板之间重现性较差 。因此 , 研究了能
同时测定发酵或生物转化液中阿魏酸 、香草酸和香草醛的 RP-HPLC 方法 , 该方法的重现性好 ,准确 、可靠。国外已有文
献报道在生物转化中采用 HPLC 方法测定香吞草醛 , 但未见同时测定阿魏酸 、香草酸和香单醛的报道。
2　实验部分
2.1　仪器与试剂　HP-1100 型高效液相色谱仪;微量进样器 , 微膜过滤器。阿魏酸(Sigma公司),香草酸(Sigma 公司),
硅胶 G(中国青岛海洋化工集团公司);甲醇(色谱纯)、香草醛及其它试剂均为分析纯。
2.2　色谱条件 　色谱柱:Lichrospher 100 RP-18 柱(250 mm×4 mm i.d., 5μm), 流动相为:A=0.01%冰醋酸水溶液 ,
B=甲醇;时间程序:开始时 20%B , 保持 4 min , 到 24 min 时增加至 40%, 到 27 min 时增加至 100%并保持 2 min , 到 30
min 时又降至 20%,并以这种比例使柱子平衡至少 5 min;流速为 1 mL/ min。检测波长:280 nm 检测;进样量:25 μL;柱
温:室温。
2.3　样品处理　将发酵液或生物转化液先用滤纸过滤 ,再加入适量的无水乙醇 , 离心以除去蛋白质等大分子杂质 ,在除
去杂质的样品中加入 20%的甲醇后 , 再将其 pH 值调至 5 ,用 0.22 μm 微滤膜过滤后即可进样。
3　结果与讨论
3.1　色谱分离效果　采用上述条件 , 3 种待测物分离效果良好 , 其保留时间分别为:FA 20 min , VA 12 min , Vin 16
min。
3.2　样品处理方法研究　对不同的样品处理方法进行了研究 , 结果表明:在除去杂质的样品中加入 20%的甲醇 ,再将
其 pH 值调至 5 ,用 0.22 μm 微滤膜过滤后即可直接进样。经这样处理后 ,三者的回收率在所 100.4%～ 114%;在样品中
加入 30%的甲醇 ,不调 pH 值 ,微滤膜过滤后直接进样效果次之。
3.3　标准曲线 、线性范围和检测限　精密称取阿魏酸 、香草酸 、香草醛标样各 0.5 g ,用甲醇定容至 50 m L , 得到 10 g/ L
的标准贮备液 ,再由贮备液配制一系列不同浓度的 3种标样的混合溶液 , 用 HPLC 进行测定。阿魏酸 、香草酸和香草醛
的线性范围分别为:0.01 ～ 1.6 g/ L , 0.001 ～ 2 g/ L , 0.0001 ～ 1.6 g/ L;标准曲线分别为 y=76761 x+904 , R 2=0.9979;
y=41038 x+1191 , R 2=0.999;y=94020 x+6920 , R 2=0.998。
最低检测浓度分别为:VA:0.244 mg/ L;FA:0.0667 mg/ L;Vin:1.04 mg/ L 。
3.4　精密度及准确度 　浓度为 0.5 g/ L 的样品 12 次检测 , 结果:VA、Vin 和 FA 的 RSD 分别为 1.84%、1.43%和
11.35%。
在发酵液中加入一系列不同浓度的混合标样 , 按上述方法处理后进行 HPLC 分析 , 香草酸的平均回收率为 114%,
平均标准偏差为 2.23%;香草醛的平均回收率为 100.4%, 平均标准偏差为 2.81%;阿魏酸的平均回收率为 101.2%, 平
均标准偏差为 1.61%。
3.5　样品测定　任意选取 3 个样品 , 按上述实验方法处理后进样测定 , 结果 3 个样品中的 FA 含量分别为:0.43 g/ L
(RSD=1.05%, n=5)、0 g/ L、 0.22 g/ L(RSD=1.12%, n=5);VA 含量分别为:0.35 g/ L(RSD=2.05%, n=5)、0.51 g/ L(RSD
=1.97%, n=5)、1.53 g/ L(RSD=2.24%, n=5);Vin含量分别为:0、0.38 g/ L(RSD=1.51%, n=5)、0.04 g/ L(RSD=1.45%,
n =5)。结果说明:利用本方法可以同时测定发酵中的底物 、产物和中间体 ,结果准确可靠,可方便地检测发酵进程。
第 32 卷
2004年 3 月　　　　　　　　　　　
分析化学(FENXI HUAXUE)　来稿摘登
Chinese Journal of Analy tical Chemistry
　　　　　　　　　　　第 3 期
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