全 文 ：基金项目:国家 “重大新药创制 ”科技重大专项(2009ZX09103440);国家自然科学基金(81073034);河南省重大公益性科研招标项目
(081100910800)
作者简介:郑晓珂 ,女 ,博士 ,教授　　研究方向:中药活性成分及作用机制研究　　＊通讯作者:冯卫生 ,男 ,博士 ,教授　　研究方向:中草药
活性成分研究及新药开发　　Tel:(0371)65680011　　E-mail:fwsh@hactcm.edu.cn
卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮对人脐静脉内皮细胞增殖及 VEGF蛋白表
达的影响
郑晓珂 ,宁桃丽 ,王小兰 ,刘彩霞 ,刘媛媛 ,冯卫生＊(河南中医学院 ,郑州 450008)
摘要:目的　观察卷柏总黄酮 、穗花杉双黄酮对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖及血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影
响。方法　采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮对 HUVEC细胞增殖的影响;流式细胞仪
检测细胞周期;Westernblot检测 VEGF蛋白的表达。结果　不同质量浓度的卷柏总黄酮(1、5、10、15、20μg· mL-1)和穗花杉
双黄酮(0.3, 1, 2, 4, 5 μg· mL-1)可以剂量依赖地促进 HUVEC细胞增殖 , 其中卷柏总黄酮 10 μg· mL-1 、穗花杉双黄酮
1 μg· mL-1在 36 h时显著促进细胞增殖 ,提高 S期细胞比例 , VEGF蛋白表达明显升高。结论　细胞实验结果提示卷柏中黄
酮类物质可能具有促血管新生的作用。
关键词:内皮细胞;内皮细胞生长因子;细胞增殖;卷柏;总黄酮;穗花杉双黄酮
中图分类号:R965　　　文献标志码:A　　　文章编号:1001-2494(2011)13-0998-05
EfectsofTotalFlavonoidsandAmntoflavoneIsolatedfromSelaginelatamariscinaonHumanUmbilical
VeinEndothelialCelsProliferationandVEGFExpression
ZHENGXiao-ke, NINGTao-li, WANGXiao-lan, LIUCai-xia, LIUYuan-yuan, FENGWei-sheng＊(HenanUniversityof
TraditionalChineseMedicine, Zhengzhou450008, China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　ToobservetheeffectsoftotalflavonoidsandamntoflavoneisolatedfromSelaginellatamariscinaonthe
celproliferationandcycleandtheexpressionofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)inhumanumbilicalveinendothelialcells
(HUVEC).METHODS　HUVECwasculturedastargetcelinvitro.MTTmethodwasusedfortheanalysisoftheefectonthepro-
liferationofHUVECbydifferentconcentrationsoftotalflavonoidsandamntoflavoneisolatedfromSelaginelatamariscina;flowcytometer
wasusedtodeterminethecelcycle, andWesternblotwaswtilizedtoinvestigatetheexpressionofVEGFprotein.RESULTS　After
24 htreatmenttotalflavonoids(1, 5, 10, 15, 20 μg· mL-1)andamntoflavone(0.3, 1, 2, 4, 5 μg· mL-1)isolatedfromSelaginela
tamariscina.PromotedtheproliferationofHUVECwithremarkabledosage-efectrelationship, andthetotalflavonoidsandamntoflavone
hadthebestproliferationefectattheconcentrationsof10 and1 μg· mL-1 , respectivey.Furtherstudiesshowedthattotalflavonoids
(10μg· mL-1)andamntoflavone(1 μg· mL-1)couldbothsignificantlyenhancethesynthesisofDNAandincreaseVEGFprotein
expressionofHUVECin36 h.CONCLUSION　Experimentalresultsdemonstratethatthetotalflavonoidsandamntoflavoneisolated
fromSelaginellatamariscinamayhavetheeffectofinducingangiogenesis.
KEYWORDS:endothelialcels;vascularendothelialgrowthfactor;celproliferation;Selaginelatamariscinas;totalflavonoids;amnt-
oflavone
　　血管内皮细胞损伤和功能失调是动脉粥样硬化
和动脉硬化闭塞症发生的始动环节[ 1] ,也是血栓形
成的关键因素 ,与冠状动脉再狭窄的发生密切相
关 [ 2] ,动脉硬化或血栓形成等原因导致器官 、组织
陷于缺血状态 ,其促进侧枝血管的形成被视为生理
血管新生 ,中医药关于活血化瘀等药物的研究为中
药促血管新生的研究提供了重要线索[ 3] 。卷柏
[ Selaginelatamariscina(Beauv.Spring)]为多年生
草本植物 ,为蕨类卷柏科(Selaginelaceae)卷柏(Sel-
aginela)植物卷柏的全草 ,其主要功效为活血通经。
现代药理及临床研究表明 ,卷柏中黄酮类物质具有
降血脂 、降血糖 、抗氧化 、抗辐射及心血管保护等作
用[ 3-5] 。本实验室前期对其化学成分进行了系统研
究 ,已从中得到大量酚酸类 、黄酮类 、双黄酮类 、木脂
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素类等成分 [ 6-11] ,研究结果表明 ,卷柏总黄酮含有 8
种黄酮类化合物 [ 12-13] ,进一步分离确认卷柏总黄酮
中主含成分为穗花杉双黄酮 ,另外还含有少量的扁
柏双黄酮 、新柳杉双黄酮 、罗汉松双黄酮 、槲皮素 、芹
菜素等 [ 14] 。通过卷柏提取物体外降脂 、降糖研究发
现 ,其具有改善血管内皮功能的作用并对 HUVEC
细胞具有促增殖作用 [ 15-17] ,鉴于此 , 本实验以体外
培养 HUVEC为模型 ,探讨卷柏总黄酮及其代表性
单体化合物穗花杉双黄酮对 HUVEC增殖及 VEGF
蛋白表达的影响 ,为动脉粥样硬化引起的心肌和肢
体缺血的促血管新生治疗提供理论依据。
1　实验材料
1.1　药物
卷柏原药材(本草国药堂责任有限公司),经河
南中医学院药用植物教研室董诚明教授鉴定为蕨类
卷柏科(Selaginelaceae)卷柏属(Selaginela)植物卷
柏的全草。卷柏总黄酮 (本实验室制备 ,专利申请
号:200810050048.8),穗花杉双黄酮(本实验自制 ,
纯度大于 98%)。
1.2　细胞株
人脐静脉内皮细胞株 HUVEC(河南中医学院
第一附属医院李强老师赠送)。
1.3　试剂及仪器
四甲基偶氮唑盐 (MTT)、碘化丙啶 (PI)及
RnaseA(Sigma公司);小牛血清(Gibco公司);兔抗
VEGF一抗(北京博奥森生物科技公司);抗 β-actin
兔单克隆抗体 ,辣根酶标记山羊抗兔 IgG, DAB显色
试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司);蛋白质
定量试剂盒 (普利莱基因技术有限公司);Shimad-
zuLC-10AT型高效液相色谱仪(日本岛津);ELIEⅡ
细胞培养箱(美国 Revco公司);ECLIPSETS100倒
置显微镜 (Nikon公司 );Model680酶标仪 (美国
BIO-RAD);EPICS-XL流式细胞仪(BeckmanCoulter
公司)。
2　实验方法
2.1　药物配制
卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮用适宜溶媒 (DM-
SO)溶解 ,用无血清 RPMI1640培养基调至终质量
浓度为 1 mg· mL-1 , 0.22μm孔径滤膜过滤除菌 , 4
℃冰箱内保存备用 ,使用时无血清 RPMI1640培养
基稀释至所需浓度。
2.2　细胞培养
将细胞培养在含体积分数为 10%小牛血清的
RPMI1640培养基中(含青霉素 100 u· mL-1 ,链霉
素 100 u· mL-1),置于 37 ℃、5% CO2饱和湿度培
养箱中培养 ,均取对数生长期细胞用于实验 。
2.3　MTT法检测细胞增殖反应
收集对数生长期细胞 ,按 1×104· mL-1接种于
96孔培养板中 ,每孔含细胞悬液 200 μL, 置于 37
℃、5% CO2饱和湿度培养箱中孵育 ,细胞贴壁后弃
上清液 ,将其分为 3个组 ,对照组(等体积的无血清
RPMI1640培养基)、卷柏总黄酮组(终质量浓度分
别为 1、5、10、15、20 μg· mL-1)、穗花杉双黄酮组
(终质量浓度分别为 0.3、1、2、4、5 μg· mL-1),每组
6个复孔(实验重复 3次)培养 12、24、36、48 h后 ,
每孔加入 20μLMTT(5mg· mL-1)继续孵育 4h弃
去培养液 ,每孔加入 DMSO150 μL,使用酶标仪于
490 nm测定吸光度(A)值 ,可间接反映活细胞数量 ,
用以检测细胞活性。细胞增值率(%)=(给药组 A
值 -对照组 A值)/对照组 A值 ×100%。其中根据
卷柏总黄酮中穗花杉双黄酮含量 ,将卷柏总黄酮的
浓度折算到穗花杉双黄酮的浓度 。
2.4　流式细胞术检测细胞周期
收集 经 药 物 处 理 36 h的 细 胞 , 制 成
1×106·mL-1单细胞悬液 , PBS洗涤后离心沉淀细
胞 ,体积分数 70%乙醇 4 ℃固定过夜 , 800×g离心
5min,弃上清 ,留下约 50 μL的细胞悬液 ,加入 100
μLRNase溶液 , 37 ℃水浴孵育 30 min,然后加入
800 μLPBS、50 μLPI染色液 ,避光染色 30 min,进
行 FCS检测 。
2.5　Westernblot检测 VEGF蛋白表达
收集经药物处理细胞 36 h的细胞 ,加入细胞裂
解液 (25 mmol· L-1 Tris-HClpH7.5、 150 mmol·
L-1氯化钠 、10%甘油 、10 mmol· L-1磷酸甘油钠 、2
mmol· L-1EDTA和 0.5%TritonX-100,使用前加入
1mmol· L-1蛋白酶抑制剂 PMSF), 冰浴裂解 30
min,于 4 ℃ 10 000 ×g离心 15 min,取上清液。蛋
白浓度测定按总蛋白测定试剂盒(BCA法)说明书
操作 ,经 SDS-PAGE电泳分离后电转移至 PVDF膜 ,
用封闭液温室封闭 2 h,常规一抗和二抗孵育后 ,
DAB显影检测蛋白表达 ,奥赛德红外成像系统(Li-
CorBioscience, LincoLN, NE, USA)捕获图像 。
2.6　统计分析方法
采用 SPSS13.0统计软件分析 , 数据用平均
数 ±标准差( x±s)表示 ,用药组与对照组间比较采
用单因素方差分析 。
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3　结　果
3.1　卷柏总黄酮组分分析
参考文献 [ 18]对卷柏总黄酮中各组分进行分析 ,
色谱柱:AgilentZorboxSB-C(4.6 mm×250 mm, 5
μm);流动相:甲醇 -0.2%磷酸梯度洗脱;流速:0.8
mL·min-1;检测波长:337 nm;柱温:30℃;进样量:
10 μL。
结果表明 ,卷柏总黄酮主要成分为穗花杉双黄
酮 ,其含量占总黄酮含量的 24.8%,本实验通过比
较卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮对 HUVEC细胞增
殖 、细胞周期及 VEGF蛋白表达的影响 ,初步探讨其
发挥降血脂 、抗氧化与改善血管内皮功能的作用物
质基础 。
3.2　卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮对 HUVEC细胞
增殖的影响
不同浓度卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮与 HU-
VEC细胞共同作用 24 h后 ,可以剂量依赖地促进
HUVEC细胞增殖 , 其中以卷柏总黄酮 10 μg·
mL-1 、穗花杉双黄酮 1 μg· mL-1促增殖作用最好
(P<0.01),结果见图 1。
根据上述实验结果选用卷柏总黄酮 10 μg·
mL-1 、穗花杉双黄酮 1 μg· mL-1分别处理 HUVEC
细胞 12、24、36、48h, MTT检测结果显示以 36 h促
增殖作用最好 ,增殖率分别达到 25.74%, 15.88%,
结果见图 2。
3.3　卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮对 HUVEC细胞
周期的影响
为了深入研究卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮影响
细胞增殖的作用机制 ,分别用 10 μg· mL-1卷柏总
黄酮和 1μg·mL-1穗花杉双黄酮处理 HUVEC细胞
36 h,与对照组比 , G0 /G1期细胞减少 , S期明显增加
　　
图 1　不同浓度的卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮对 HUVEC细
胞增殖的影响 .n=6, x±s
与对照组比较 , 1)P<0.01
Fig.1　Efectsofthetotalflavonoidsandamntoflavoneisolated
fromSelaginelatamariscinasoncelproliferationrateofHU-
VEC.n=6, x±s
1)P<0.01, vscontrolgroup
(P<0.01, P<0.05)。提示卷柏总黄酮和穗花杉双
黄酮可能是通过增加 S期细胞百分比 ,使 DNA复制
处于较旺盛状态而发挥增殖作用 ,结果见表 1、图 3。
3.4　卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮对 HUVEC细胞
中 VEGF蛋白表达的影响
采用 Westernblot方法检测 10 μg· mL-1卷柏
总黄酮和 1 μg· mL-1穗花杉双黄酮作用细胞 36 h
后 , VEGF蛋白的表达。结果显示 ,药物作用后细胞
VEGF蛋白表达显著增加 ,与对照组相比差异显著
(P<0.01),见图 4。
4　讨　论
动脉粥样硬化是一种严重危害人类生命健康的
疾病 ,目前临床上尚未出现肯定的促血管新生药物。
近年来 ,从天然植物中寻找新药已成为新药研究的
　　
图 2　不同作用时间的卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮对 HU-
VEC细胞增殖的影响 .n=6, x±s
与对照组比较 , 1)P<0.01
Fig.2　Effectsofthetotalflavonoidsandamntoflavoneisolated
fromSelaginelatamariscinasatdifferenttimepointsoncelpro-
liferationrateofHUVEC.n=6, x±s
1)P<0.01, vscontrolgroup
表 1　卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮对 HUVEC细胞周期的影
响 .n=3, x±s
Tab.1　Effectsofthetotalflavonoidsandamntoflavoneisolated
fromSelaginelatamariscinaoncellcycleofHUVEC.n=3, x±s
Groups Dose/μg· mL-1
Celcycle
/% 36 h
Control - G0 /G1 51.60±1.67
S 29.33±2.57
G2 /M 14.57±0.93
Totalflavonoids 10 G0 /G1 47.43±1.031)
S 38.17±3.071)
G
2
/M 14.50±2.17
Amntoflavone 1 G0 /G1 52.50±4.08
S 34.53±1.46
G2 /M 14.03±1.88
注:与对照组比较 , 1)P<0.01
Note:1)P<0.01, vscontrolgroup
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重点。本实验室前在对去势大鼠脂代谢研究中发现
卷柏正丁醇提取物对腹主动脉内皮具有一定保护作
用 [ 17] 。本实验 MTT结果表明 ,不同浓度卷柏总黄
酮和穗花杉双黄酮与 HUVEC细胞共同作用 24 h
后 ,可以剂量依赖地促进 HUVEC细胞增殖 ,其中以
卷柏总黄酮 10μg· mL-1、穗花杉双黄酮 1μg·mL-1
促增殖作用最好(P<0.01);卷柏总黄酮 10 μg·
mL-1 、穗花杉双黄酮 1 μg·mL-1处理 HUVEC细胞
12、24、36、48 h后 ,以 36 h促增殖作用最好 ,增殖率
分别达到 25.74%, 15.88%。
在细胞周期中 ,由 G1期进入 S期的过程被认为
是最重要的 ,这一过程受到 G1期检查点的调控 ,一
旦细胞通过该调控点 ,为下一步顺利通过 S期或 M
期奠定了良好的基础[ 19] 。细胞周期结果显示 ,卷柏
总黄酮和穗花杉双黄酮可以促使细胞通过细胞增殖
的限制点 ,使 S期细胞比例增加 ,最终达到促细胞增
殖作用。
药物促血管新生的机制可能是通过促进血管生
长因子的分泌与释放 ,其中最具代表性的是 VEGF,
它是血管早期形成的关键因子 ,是内皮细胞具有高
度选择作用的促有丝分裂原 ,能促进内皮细胞增生 、
迁移 ,从而达到促血管新生的作用 [ 20-21] 。通过卷柏
总黄酮和穗花杉双黄酮处理细胞 36 h后 ,发现二者
均可促进 HUVEC细胞内 VEGF蛋白的表达 ,这与
内皮细胞的增殖反应一致 ,体外实验提示卷柏总黄
酮和穗花杉双黄酮具有促进内皮细胞增殖 ,发挥修
复血管内皮细胞损伤的潜在能力 。
穗花杉双黄酮为卷柏总黄酮的主要成分 ,但其
单独使用时对细胞增殖作用不及卷柏总黄酮 ,提示
卷柏总黄酮的促增殖作用可能是由其他几种含量较
低的黄酮类化合物协同穗花杉双黄酮共同起效 ,这
也体现了中药多成分发挥药效的作用特点。但卷柏
总黄酮部位各成分的最佳含量比 ,及其在促细胞增
殖 、VEGF蛋白表达作用的基础上 ,体内对其是否具
有促内皮细胞侵入 、迁移和管状结构形成的作用尚
需进一步的研究。
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(收稿日期:2010-12-20)
中国国际临床肿瘤药学大会会议通知
肿瘤疾病严重威胁着全人类的健康 ,世界各国政府及医疗科研机构均高度重视肿瘤治疗的研究。药物治疗作为肿瘤治
疗的重要手段之一 , 其安全性和有效性对于提高患者治愈率 、改善患者生存质量至关重要。为促进临床肿瘤药学的发展 , 中
国药学会与首都医科大学肿瘤医学院将于 2011年 10月 29 ～ 30日在北京国际会议中心举办首届中国国际临床肿瘤药学大
会 , 主题为 “肿瘤临床与用药安全” 。大会旨在为国内外肿瘤科技工作者搭建一个共同抗癌的互动平台 , 规范肿瘤治疗方法和
提高用药安全 , 推动我国肿瘤防治事业的发展 , 提高人民健康水平。
会议期间将同时召开 “第六届亚洲药物流行病学大会(ACPE)暨 2011中国药学会药物流行病学专业委员会学术年会 ”。
ACPE是由中国药学会和国际药物流行病学会共同主办 , 主题为 “药物流行病学与风险管理:从科学研究到临床实践———机遇
与挑战” 。参加肿瘤大会的代表可同时参加 ACPE。
会议期间 , 大会设有展览展示区 , 供最新医药技术 、产品及药房设备等进行展示。 具体事宜请与中国药学会国际交流部
进行联系。
联系方式:首都医科大学肿瘤医学院(北京市海淀区羊坊店首都医科大学附属北京世纪坛医院教育处 , 邮编 100038);电
话:010-63926350、63926335;传真:010-63926338;E-mail:zlxxbgs@126.com;联系人:孙政春 、张雯雯 、李文斌。 中国药学会国际
交流部(北京市朝阳区建外 SOHO 9 号楼 1802室 , 邮编 100022);电话:010-58699280转 815, 010-58699271;传真:010-
58699272;E-mail:acpe@cpa.org.cn;联系人:孙建学 ,张子烨 , 刘春光。
会议授予继续教育Ⅰ类学分 6分。
大会统一使用 ACPE注册系统 ,具体请访问网站 htp://www.acpe-beijing.org。
其他信息请见中国药学会网站:www.cpa.org.cn。
[本刊讯 ]
·1002· ChinPharmJ, 2011July, Vol.46No.13　　　　　　　　　　　　　 中国药学杂志 2011年 7月第 46卷第 13期