全 文 ：收稿日期:2002-12-10
作者简介:李永红(1970-),女 ,河南延津人 ,郑州大学讲师 ,江南
大学博士研究生 ,从事生物制药方面的研究.
＊通讯联系人
文章编号:1671-1629(2003)01-0035-03
TLC方法同时监测生物转化过程中的
阿魏酸 、香草酸和香草醛
李永红 , 郑志强 , 孙志浩＊
(江南大学 生物工程学院生物化工系 ,教育部工业生物技术重点实验室 ,江苏 无锡 214036)
摘要:采用薄层扫描法(TLC),以正己烷-氯仿-无水乙醚-冰醋酸(体积分数比为 4∶3∶2∶0.1)为
展开剂 ,碘蒸气为显色剂可以同时测定发酵液中阿魏酸 、香草酸和香草醛的含量.用 2 ,4-二硝
基苯肼显色可以专一性地测定香草醛.用碘蒸气显色时阿魏酸 、香草酸和香草醛的线性范围均
为1 ～ 10μg ,标准曲线分别为 y =353.3x -183.2 , R2 =0.995 4;y =308.0 x-42.0 , R2 =0.997
9;y =655.11x-49.0 , R2=0.995 4.平均回收率分别为 101.3%,101.8%,103.0%, RSD 分别为
2.39%,2.39%, 2.24%.用 2 ,4-二硝基苯肼显色时香草醛的灵敏度更高 ,线性范围为 1 ～ 5μg ,
标准曲线分别为 y =6 843.6x-4 776 , R2=0.992 2.两种显色方法测得的香草醛结果一致.
关键词:阿魏酸;香草酸;香草醛;TLC
中图分类号:TQ920.1　　　　文献标识码:B
　　香草醛(Vanillin ,Vin)是食品 、饮料等工业中
应用最广泛的香料之一 ,还可作为保鲜剂及医药
等工业的原材料.香草醛目前主要由化学方法合
成制备.天然香草醛从香子兰的花荚中提取 ,但这
样得到的香草醛价格昂贵.根据美国和欧盟的规
定 ,合成香草醛在农产品和食品添加剂中的使用
会引起法律方面的争议[ 1] ,再加上消费者的喜好 ,
更促进了生物技术方法生产香草醛的研究.生物
转化法生产香草醛多采用阿魏酸(Ferulic acid ,
FA)作为前体物质 , 中间会产生香草酸(Vanillic
acid ,VA)等中间产物.因此 ,为了进行菌种选育和
代谢途径研究很有必要创建一种能迅速地同时测
定阿魏酸 、香草酸和香草醛的方法 ,薄层扫描法正
好具备快速 、方便的特点 ,可用于代谢途径的监
测.
1　仪器与试剂
1.1　仪器
CS9301(PC)S 型双波长飞点扫描仪(日本岛
津);微量点样器(由微量进样器改制).
1.2　试剂
阿魏酸(Sigma公司),香草酸(Sigma公司),硅
胶G(中国青岛海洋化工集团公司),香草醛及其
它试剂 ,均为分析纯.
2　方法与结果
2.1　薄层条件及分离处理
2.1.1　薄层条件
薄层板的制备:在硅胶G60中加适量质量分数
为0.5%CMC-Na 溶液混合 、研匀后铺于 20 cm×
20 cm玻璃板上 ,室温下干燥 ,105℃活化30min后
置于干燥器中备用.
展开剂:正己烷-氯仿-无水乙醚-冰醋酸(体积
分数比为 4∶3∶2∶0.1).
显色剂:碘蒸气结合 2 ,4-二硝基苯肼.
扫描条件:228 nm 单波长反射矩齿扫描 ,狭
缝 0.4 mm×0.4 mm ,SX=3 ,灵敏度中等.
2.1.2　分离结果
在上述条件下 3 种物质的分离效果良好 ,阿
魏酸 、香草酸 、香草醛斑点的 R f 值分别为:0.28 ,
0.36 ,0.45.
2.2　标准曲线的制备
第24卷第 1期　　　 　　 　　　　　　郑州工程学院学报　　　　　　　 　　　 　Vol.24 ,No.1
2003年 3月　　　　　 　　　Journal of Zhengzhou Institute of Technology　　　　　　　　　Mar.2003
DOI :10.16433/j.cnki.issn1673-2383.2003.01.010
精密称取阿魏酸 、香草酸 、香草醛标样各 0.5
g ,用甲醇定容至 50 mL 得到 10 g/L 的标准贮备
液 ,再由贮备液配制 0.05 、0.1 、0.2 、0.4 、0.6 、0.8 、
1 、2 、3 g/L等一系列不同浓度的 3种标样的混合
溶液 ,取上述标样适量(使点样量在 0.05 ～ 10 μg
之间)点于同一块薄板上 ,按上述条件展开 ,展开
后快速挥去溶剂 ,然后置于盛有碘的容器中显色 、
扫描测定 3种物质 ,等完全褪色后再用 2 , 4-二硝
基苯肼显色 ,测定香草醛.用碘显色时三种物质的
线性范围均为 1 ～ 10 μg ,阿魏酸 、香草酸 、香草醛
的标准曲线分别为 y=353.3x -183.2 , R2=0.995
4;y =308.0x -42.0 , R2 =0.997 9;y =655.11x -
49.0 , R2=0.995 4.用 2 , 4-二硝基苯肼显色时香
草醛的线性范围为 1 ～ 5 μg ,标准曲线为 y =6
921.3x-5 727.4 , R2=0.995 2.
2.3　精密度试验
在同一块薄层板上点 5个 4μg(2 g/L 标样 2
μL)的标样斑点 ,依本法展开 、碘蒸气显色 、扫描.
并对同一个点在不同时间扫描 5次.峰面积结果
见表 1.
表 1　精密度试验结果
不同点 FA VA Vin 相同点 FA VA Vin
1 1 199 2 463 1 175 1 1 188 1 212 2 459
2 1 163 2 372 1 177 2 1 196 1 228 2 468
3 1 241 2 446 1 192 3 1 192 1 208 2 461
4 1 232 2 538 1 201 4 1 178 1 211 2 457
5 1 249 2 497 1 197 5 1 184 1 226 2 471
RSD/ % 0.99 2.92 2.51 RSD/ % 0.59 0.76 0.24
2.4　稳定性试验
点2 g/L标样 2μL于薄层板上 ,依本法展开 ,
显色后每 30 min扫描 1次.结果表明:在 100 min
之内阿魏酸 、香草酸很稳定 ,香草醛不太稳定;在
220 min后都较稳定.因此对于阿魏酸 、香草酸可
显色后即测 ,或显色后标出斑点位置 ,220 min后
再同时测定 3种物质.2 , 4-二硝基苯肼显色后颜
色很稳定.
2.5　检测限
在同一块薄层板上点 0.05 、0.1 、0.2 、0.4 、
0.6 、0.8 、1 g/L 样品各 1 μL ,依本法展开 ,分别用
碘蒸气和 2 , 4-二硝基苯肼显色 、扫描.结果见表
2.
2.6　加样回收试验
取6份发酵液 ,按表 3加入混标后按上述方
法进行点样 、展开 、碘蒸气显色 、扫描.结果见表
3.
表 2　3种样品的检测限
样品 FA碘蒸气显色
VA
碘蒸气显色
Vin
碘蒸气显色
Vin
2 , 4-二硝基
苯肼显色
目测 0.2 0.2 0.4 0.1
仪器检测 0.1 0.1 0.1 0.1
表 3　加样回收试验结果
序号 加入量/μg
FA VA Vin
测得量
/μg
回收率
/ %
测得量
/ g
回收率
/ %
测得量
/μg
回收率
/ %
1 2 1.99 99.5 2.09 104.4 2.09 104.5
2 3 3.12 104.1 2.95 98.3 3.13 104.4
3 3 3.03 101.0 3.11 103.5 3.15 104.9
4 3 3.06 101.9 3.00 100.0 2.96 98.8
5 3.5 3.63 103.5 3.63 103.7 3.63 103.7
6 3.8 3.71 97.7 3.83 100.9 3.86 101.7
平均回
收率/% 101.3 101.8 103.0
RSD/ % 2.39 2.39 2.24
2.7　样品测定
取适量发酵液 ,过滤除去菌体后用等体积的
乙酸乙酯萃取 ,取有机相点样 ,然后进行展开 、碘
蒸气显色 、扫描.测定结果见表 4.
表 4　样品测定结果
样品 FA 含量/(g·L-1)
RSD
/ %
VA含量
/(g·L -1)
RSD
/ %
Vin含量
/(g·L-1)
RSD
/ %
1 0.84 1.89 0.15 2.05 0.10 2.33
2 0.10 1.96 0.50 1.97 0.10 2.11
3 0 2.12 0.06 2.24 0.49 2.45
3　讨论
本文中使用的展开剂与文献报道的展开剂如
乙酸乙酯[ 2] 、氯仿-甲醇[ 2]及不同比例的正己烷-
氯仿-乙醚-冰醋酸[ 3]相比 ,本文中使用的展开体
剂系效果较好.
Pauly 试剂[ 4]结合 2 ,4-二硝基苯肼[ 2 , 5]可使 3
种物质显色 ,但 Pauly 试剂性能不稳定 ,即有时能
显色有时不能显色 ,需经常配新的 ,不方便;2 , 4-
二硝基苯肼显色后背景颜色较深;而碘蒸气[ 6]可
使 3种物质同时显色 ,显色快且边缘清晰 、背景颜
色浅 ,但褪色较快.碘蒸气对香草酸和阿魏酸的灵
敏度高 ,而 2 ,4-二硝基苯肼对香草醛的灵敏度高.
因此可根据具体需要选择适当的显色剂 ,当需要
同时测 3种物质时还是用碘蒸气比较方便.也可
再用 2 ,4-二硝基苯肼显色以印证碘蒸气显色测定
结果的准确性.文中数据以碘蒸气显色测定结果
为主 ,2 ,4-二硝基苯肼显色测定结果与碘显色结
36　　　　　　　　　　　　　　　　　郑州工程学院学报　　　　　　　　　　　　 　第 24卷
果一致 ,未详细列出.
阿魏酸 、香草酸及香草醛在 200 ～ 330 nm 之
间均有吸收 ,在 230 nm 及 300 nm 附近有吸收峰 ,
但在 250 nm 以后的吸收值随颜色的淡化而迅速
减小 ,很不稳定 ,而 228 nm 处的吸收值是由苯环
的吸收引起的 ,比较稳定 ,故选为测定波长.
由于板厚度的影响 ,板与板之间的差别较大 ,
但通过在每块板上点标样校正可克服这一缺点 ,
不影响测定.
参考文献:
[ 1] 　Lesage Meessen , Laurence , Delattre , et al.As-
pergillus niger which prodeces vanillic acid from
ferulic acid [ P] .United States Patent:6 162
637 ,2000-12-19.
[ 2] 　Gulten Otuk.Degradation of ferulic acid by E.
coli[ J] .J Ferment Technol ,1985 ,63(6):501 ～
506.
[ 3] 　虞金宝 ,宋友昕 ,程怡.薄层扫描法测定胡黄
连中香草酸的含量 [ J] .中国中药杂志 ,
1999 ,24(2):102 ～ 103.
[ 4] 　Huang Zhixlan ,Larry Dostal , John P N Rosazza.
Microbial transformations of ferulic acid by Sac-
charomyces cerevisiae and Pseudomonas fluo-
rescens[ J] .Appl Environ Microbiol , 1993 , 59:
2244 ～ 2250.
[ 5] 　Li T , John P N Rosazza.Biocatalytic synthesis of
vanillin[ J] .Appl Environ Microbiol , 2000 , 66:
684 ～ 687.
[ 6] 　Nazareth S ,Mavinkurve S.Degradation of ferulic
acid via 4-vinylguaiacol by Fusarium solani
(Mart.)Sacc[ J] .Can J Microbiol , 1986 , 321:
494 ～ 497.
DETERMINATION OF FERULIC ACID ,VANILLIC ACID AND
VANILLIN SIMULTANEOUSLY BY TLC IN BIOTRANSFORM PROCESS
LI Yong-hong , ZHENG Zhi-qiang , SUN Zhi-hao
(School of Biotechnology , South Yangtze University , TheKey Laboratory of
Industrial Biotechnology ,Ministry of Education ,Wuxi 214036 , China)
Abstract:The contents of ferulic acid , vanillic acid and vanillin in fermentation liquid can be determined simultane-
ously by TLC ,with n-hexane-chloroform-dehydrated ether-glacial acetic acid(4∶3∶2∶0.1)as devekoper and iodine
vapor as color-developing agent.Vanillin can be determined with 2 ,4-nitrophenyhydrazine as color-developing agent
specially.The linear range of feruli acid , vanillic acid and vanillin are all between 1 ～ 10μg , their standard curve are
y =353.3 x -183.2 , R2=0.995 4;y =308.0 x -42.0 , R 2=0.997 9;y =655.11 x-49.0 , R2 =0.995 4 re-
spectively.The average recovery are 101.3%,101.8% and 103.0% respectively , RSD are 2.39% and 2.24%.
The method of using 2 ,4-nitrophenyhydrazine is more sensitive.The linear range is 1 ～ 5μg , and the standard curve
is y =6 843.6 x-477 6 ,R 2=0.992 2.The determination result of vanillin is same by these two methods.
Key words:ferulic acid;vanillic acid;vanillin;TLC
37第 1期　　　　李永红等:TLC方法同时监测生物转化过程中的阿魏酸 、香草酸和香草醛