全 文 ：朱红秘孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)代谢
阿魏酸产生香兰素的研究
张莉力,迟玉杰*,孙 波
(东北农业大学食品学院,黑龙江 哈尔滨 150030)
摘 要:香兰素是食品工业中应用最广泛的香料之一。试验对发酵产生香兰素的朱红秘孔菌 Pycnoporus
cinnabarinus的种子培养基和发酵培养基进行优化,选出可以促进菌体细胞快速生长的果糖、酵母粉作为种子培养
基的碳源、氮源, 经过 3 d的培养,使朱红秘孔菌的生物量提高到 0.726 g·L-1。优化发酵培养基,选择出最有利
于香兰素生成的碳源、氮源及无机盐,优化后香兰素在发酵液中的浓度达到0.403 g·L-1,摩尔转化率为28.8%。
关键词:阿魏酸;香兰素;朱红秘孔菌;微生物转化
中图分类号:TS201.3;TS202.3文献标识码:A
收稿日期:2005-04-25
基金项目:黑龙江省杰出青年基金提名资助项目(JCT05-02) ;
东北农业大学博士基金项目
作者简介:张莉力(1977-),女,辽宁人,硕士,研究方向为食
品化学。
*通讯作者
香兰素(Vanillin)—3-甲氧基 -4-羟基苯甲醛
(3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde) ,是食品工业
中应用最广泛的香料之一。随着消费者对食品安
全的重视,对天然香兰素的需求量越来越大。但
是,由于从植物中提取的天然香兰素的生产受自
然条件的限制,其产量远不能满足市场的需求[1]。
在美洲和欧洲的立法上,认可采用生物活细胞或
其中的组成部分(例如酶)所生产的物质为天然产
物[2],由此,利用微生物发酵法生产的香兰素即属
于天然香兰素[3]。近年来,采用生物技术法生产天
然香兰素逐渐成为人们研究的热点。
1994年Falconnier等人利用朱红秘孔菌以阿魏
酸为前体物质进行发酵生产香兰素的研究,香兰
素的产量很低,只达到64mg·L-1[4]。为了提高香兰
素的产量,1999年 Oddou等人采用了高密度培养
基,选择出使朱红秘孔菌生物量最高的最佳碳源
葡萄糖和磷脂混合物作为碳源,获得的生物量是
以麦芽糖为碳源的 4倍,培养 15 d可得香兰素
700 mg·L-1[5],但是磷脂的价格昂贵,还需要进一
步选择更经济、有利的碳源取代它。本研究以
Oddou的高密度培养基为参照,作为种子培养基,
对其碳源、氮源进行了重新筛选,选出可以促进朱
红秘孔菌细胞快速生长的碳源、氮源。同时也对发
酵培养基进行了优化,选育出适于香兰素生成的碳
源、氮源和无机盐,提高了朱红秘孔菌对阿魏酸的
转化率。
1 材料与方法
1.1菌种
朱红秘孔菌(Pycnoporuscinnabarinus)从Mycon-
teque de LUniversite Catholique de Louvain-La Neuve
公司购买。
1.2培养基
斜面培养基:取糖度为 10Be°的麦芽汁,调
pH为6.0,加入2%的琼脂粉,115℃灭菌15min。
种子培养基:即高密度培养基,果糖50g·L-1,
酵母粉5g·L-1,酒石酸铵1.842g·L-1,磷酸二氢钾
0.2 g·L-1,氯化钙 0.0132 g·L-1,硫酸镁 0.5 g·L-1,
pH7.0。
发酵培养基:麦芽糖20g·L-1,酵母粉0.5 g·L-1,
酒石酸铵 1.842g·L-1,磷酸二氢钾 0.2 g·L-1,氯化
钙0.0132g·L-1,硫酸镁0.5g·L-1,pH7.0。
1.3培养方法
斜面培养:将朱红秘孔菌接入麦芽汁培养基斜
面上,30℃下培养6~8d,置冰箱保藏。
种子培养:挑取数环斜面上的朱红秘孔菌孢
第37卷 第5期 东 北 农 业 大 学 学 报 37(5):637~641
2006年10月 Journal ofNortheast Agricultural University Oct. 2006
文章编号 1005-9369(2006)05-0637-05
子,接入到 100mL的种子培养基中,在 30℃,
150r·min-1的振荡培养箱内培养3d。
发酵培养:将种子培养基中的朱红秘孔菌接
入由 0.5g·L-1阿魏酸溶液配制的发酵培养基中,
每隔 24h向培养基中添加自行提取的 5g·L-1的
阿魏酸浓缩液 10mL,连续添加 4次,于 30℃、
110r·min-1的振荡培养箱内培养,HPLC法检测香
兰素。
1.4 阿魏酸的添加方法
将碱解麦麸获得的阿魏酸溶液通过减压蒸馏装
置浓缩至 5g·L-1左右,然后将阿魏酸浓缩液在
115℃下灭菌15min,备用。
朱红秘孔菌在高密度培养基中培养3d后,将
其接入用 0.5g·L-1的阿魏酸溶液配制的基础培养
基中,每隔24h向培养基中添加 5g·L-1的阿魏酸
浓缩液 10mL,连续添加 4次,共计添加阿魏酸
250mg。
1.5 生物量的测定
将斜面上的朱红秘孔菌接入种子培养基培养
3d,取培养液 100mL,用滤纸过滤。滤纸和菌丝
体100℃烘干恒重,减去滤纸的质量,即为菌丝体
的干重,结果以g·L-1计。
1.6 香兰素摩尔转化率的计算
1.7 阿魏酸、香兰素的HPLC检测
色谱柱:SinoChromODS-BPC18(4.6mm×250
mm 5μm);流动相:甲醇 ∶0.5冰醋酸=30∶70
(V/V);流 速:1.0mL;检测器:Waters2487紫外
检测器;检测波长:320nm;进样量:15μL;外
标法定量。
2 结果与讨论
2.1 种子培养基碳源的选择
碳源是组成培养基的主要成分之一,也是构成
细胞干重的主要成分,其含量一般占细胞干重物质
的 50%左右。碳源不仅是组成细胞成分的碳架,
转化成代谢产物,还为细胞提供能源。
微生物对不同碳源利用的速度不同,能够被
微生物快速利用的碳源称之为速效碳源,反之为
迟效碳源。所以,为了使菌体细胞快速积累,缩
短种子培养周期,对种子培养基碳源的优化尤为
重要。
种子培养基是供孢子发芽、生长和菌体繁殖
的。所以种子培养基应该提供速效碳源,促进菌体
的快速生长。本试验分别对麦芽糖、葡萄糖、乳
糖、果糖、蔗糖和淀粉6种碳源进行筛选,选择出
能够促进菌体生长、被菌体快速利用的碳源,缩短
菌体积累生物量的时间。将上述6种碳源以和种子
培养基中麦芽糖含量相等的量加入到无麦芽糖的种
子培养基中,按 1.3发酵培养方法进行培养,3d
后测定菌体的生物量,结果如图1。
由图1可以看出,以葡萄糖和果糖作为碳源的
种子培养基中朱红秘孔菌的生物量较高,说明葡萄
糖和果糖易于被菌体快速吸收,有利于菌体的快速
生长。以果糖作为种子培养基的碳源获得的朱红秘
孔菌的生物量最高,所以选择果糖作为高密度培养
基的碳源。
从图1中也可以看出,适当的提高种子培养基
的密度即提高碳源和氮源的含量,使培养基相对丰
富、完全,有利于促进朱红秘孔菌的生长。
果糖含量对朱红秘孔菌生长的影响见图2。果
糖浓度在50,55,60g·L-1时朱红秘孔菌的生物量
都很高。因为果糖浓度在50g·L-1以上时朱红秘孔
菌的生物量十分相近,考虑到成本因素,最终种子
培养基的碳源含量确定为50g·L-1。
香兰素的摩尔转化率(%)=
培养基中香兰素
的物质的量
加入到培养基中阿
魏酸的物质的量
×100%
A:初始种子培养基 Thebasalseedculture;
B:麦芽糖 Maltose; E:果糖 Fructose;
C:葡萄糖 Glucose; F:蔗糖 Sucrose;
D:乳糖 Lactose; G:淀粉 Source;
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
A B C D E F G
生
物
量
(
g·
L-
1 )
B
io
m
as
s
图1 高密度培养基碳源的筛选
Fig.1 Theselectionofcarbonsourceofseedculture
碳源 Carbonsource
·638· 东 北 农 业 大 学 学 报 第37卷
2.2 种子培养基氮源的筛选结果
氮源是指能够为细胞提供氮素化合物的营养物
质。氮也是构成菌体细胞及酶体系成分的重要元
素,主要用于构成菌体物质和含氮化合物。不同微
生物菌株对氮源的利用率和效率也不同,即氮源对
微生物的生长和产酶都有较大的影响。
本试验在种子培养基中分别以牛肉膏、蛋白胨
和酵母粉作为氮源培养朱红秘孔菌,培养3d后朱
红秘孔菌的生物量如图3所示。
由图3可知,3种氮源对种子的生长影响差异不
大,三者均可作为理想氮源使用,说明该菌对氮源的
选择范围较宽。3种氮源比较而言,以酵母粉作为氮
源的生长效果最好,可将其作为种子培养基的氮源。
酵母粉含量对朱红秘孔菌生长的影响结果见图 4。
从图4中可以看出,在酵母粉含量达到5g·L-1
时菌丝体的生物量最高,酵母粉的含量在 5g·L-1
以上时,菌丝体的生物量开始呈下降趋势。这可能
是由于酵母粉浓度太高,反而降低了细胞对氮源的
吸收速率,使菌体生长受到了抑制,因此种子培养
基氮源含量以5g·L-1为宜。
2.3 发酵培养基的优化
对于发酵培养基既要有利于菌体的生长繁殖,
防止菌体过早衰老,又要有利于产物的大量合成,
所以必须从各方面加以考虑和调整。要求这类培养
基的组成丰富、完全,又要避免营养过剩。本研究
对发酵阶段所需的最佳碳源、氮源及无机盐进行了
试验,确定了发酵适宜的培养基配方。
2.3.1 发酵培养基碳源的筛选
对发酵培养基的碳源进行筛选,选出有利于香
兰素发酵的碳源。分别以麦芽糖、果糖、葡萄糖和
蔗糖作为发酵培养基的碳源,发酵生产香兰素时,
其发酵液中香兰素浓度的变化曲线如图5。
图2 果糖浓度对朱红秘孔菌P.cinnabarinus
NE-01生长的影响
Fig.2 TheefectonthegrowthofP.cinnabarinus
NE-01withfructosecontents
图3 高密度培养基氮源的选择
Fig.3 Theselectionofnitrogensourceof
high-densityculture
氮源 Nitrogensource
培养时间(d) Culturetime
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
香
兰
素
浓
度
(
g·
L-
1 )
V
an
il
li
n
co
nt
en
ts
0 5 10 15
◆
◆
◆
◆
◆
◆ ◆ ◆◆
◆
◆
▲
▲
▲
▲
▲ ▲
▲
▲ ▲ ▲▲
◆
▲
麦芽糖
Maltose
果糖
Fructose
葡萄糖
Glucose
蔗糖
Sucrose
图5 基础培养基碳源的筛选结果
Fig.5 Theselectionofcarbonsourceofbasalculture
张莉力等:朱红秘孔(Pycnoporuscinnabarinus)菌代谢阿魏酸产生香兰素的研究 ·639·第5期
*
***
**
*
*
***
由图 5可知,以麦芽糖作为发酵培养基的碳
源,发酵培养到第9天时,香兰素的浓度达到最高
值0.394g·L-1,产生香兰素的周期较长,而以果糖
和蔗糖为碳源时分别在发酵的第6天和第7天香兰
素的浓度就达到了最高值,产生香兰素的周期较
短,香兰素的积累量较低。以上4种碳源相比,以
麦芽糖作为发酵培养基的碳源,转化香兰素的发酵
周期长,香兰素产量高,所以选择麦芽糖作为发酵
培养基的碳源,这也验证了麦芽糖可以很好地诱导
阿魏酸代谢产生香兰素的论点[6]。
2.3.2 麦芽糖浓度的优化结果
选择麦芽糖浓度在 10,15,20,25,30g·L-1
5个水平上,在转化的第 7天检测香兰素的浓度,
结果如图6。
从图6中可以看出当麦芽糖含量在20g·L-1以
上时,香兰素的浓度都较高,以 20g·L-1为最高,
因此选择最佳麦芽糖含量为20g·L-1。
2.3.3 发酵培养基氮源的筛选
用初始发酵培养基中酒石酸铵和酵母粉含氮物
质的量相等的量,添加酒石酸铵、酵母粉、牛肉
膏、蛋白胨发酵生产香兰素,转化过程中发酵液中
香兰素浓度的变化曲线如图7。
由图7中可以看出,以酵母粉和酒石酸铵混合
作为氮源及单独以酵母粉作为氮源,转化周期较
长,积累的香兰素浓度较高,在发酵培养的第 9
天,香兰素的浓度达到最高0.394g·L-1;单独以酵
母粉作为发酵培养基的氮源,同样是在发酵的第9
天香兰素的浓度达到最高值0.391g·L-1,虽然香兰
素在培养基中的最高浓度比以酵母粉和酒石酸铵作
为氮源时要略微低一些,但是香兰素的下降较平
缓,并且酒石酸铵价格较高,所以选择酵母粉作为
发酵培养基的氮源,这里酵母粉在充当朱红秘孔菌
氮源的同时又作为其生长因子。
2.3.4 酵母粉浓度的优化结果
选择酵母粉 5个水平为 3,4,5,6,7g·L-1
进行底物转化试验,在转化的第7天检测香兰素的
浓度,结果如图8。
从图8中可以看出,随着酵母粉浓度的升高香
兰素的浓度随着降低。酵母粉的浓度为3g·L-1时,
获得的香兰素的浓度最高,所以选择酵母粉的浓度
为3g·L-1。
0 5 10 15
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
香
兰
素
浓
度
(
g·
L-
1 )
V
an
il
li
n
co
nt
en
ts
■
■ ■ ■ ■
■
■ ■ ■
■
■
▲
▲
▲
▲
▲
▲ ▲ ▲ ◆ ▲
▲ ▲
◆
◆
◆
◆
◆
◆ ◆ ▲
◆
◆
图7 不同氮源对香兰素生成的影响
Fig.7 Theselectionofnitrogensourceofbasalculture
图8 酵母粉浓度对香兰素生成的影响
Fig.8 Theefectofyeastextractonthe
productionofvanilin
酵母粉浓度(g·L-1) Yeastextract
1 2 3 4 5 6 7
香
兰
素
浓
度
(
g·
L-
1 )
V
an
il
li
n
co
nt
en
ts
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
■
培养时间(d) Culturetime
酵母粉+酒石酸铵 Yeastextract+tartrateammonium
酒石酸铵 Tartrateammonium
酵母粉 Yeastextract
牛肉膏 Beefextract
蛋白胨 Peptone
▲
◆
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■
·640·
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东 北 农 业 大 学 学 报 第37卷
3 结 论
a.通过筛选,确定了种子培养基的最佳碳源为
50g·L-1果糖、氮源为5g·L-1酵母粉,经过3d的
培养,使朱红秘孔菌的生物量提高到 0.726g·L-1,
是以初始发酵培养基进行培养的3.4倍。
b.在高密度培养基中培养3d,将朱红秘孔菌接
入发酵培养基中。对发酵培养基进行优化,优化的
发酵培养基碳源为果糖 20g·L-1,氮源为酵母粉
3g·L-1,磷酸二氢钾0.2g·L-1,氯化钙0.0132g·L-1,
硫酸镁0.5g·L-1,发酵培养9d,香兰素在发酵液中
的浓度达到最高0.403g·L-1,摩尔转化率为28.8%。
[ 参 考 文 献 ]
[1]BonninE,Lessage-MeesenL,AstherM,etal.Enhancedbioconv-
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[2]Lesage-MeessenL,StentelaireC,Lomascolo,etal.Fungaltrans-
formationofferulicacidfromsugarbeetpulptonaturalvanilin[J].
JournaloftheScienceofFoodandAgriculture,1999,79:487-490.
[3] 赵桂华,何文龙.朱红秘孔菌培养性状的研究 [J].林业科学研
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[4] BarghiniP,MonteboveF,RuzziM,etal.Optimalconditionsfor
bioconversionofferulicacidintovanilicacidbyPseudomonas
fluorescensBF13cels[J].ApplMicrobiolBiotechnol,1998,49:
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[5] OddouJ,StentelaireC,Lesage-MeessenL,etal.Improvementof
ferulicacidbioconversionintovanilinbyuseofhigh-density
culturesofPycnoporuscinnabarinus[J].ApplMicrobiolBiltech-
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[6] 王明君,郑璞,孙志浩,等.微生物转化香草酸生产香草醛 [J].
食品与发酵工业,2004,30(2):43-47.
TheresearchofPycnoporuscinnabarinusmetabolizing
ferulicacidtoproducevanilin
ZHANGLili,CHIYujie,SUNBo
(FoodColege,NortheastAgriculturalUniversity,HarbinHeilongjiang150030,PRC)
Abstract:Vanilinisoneofthemostimportantflavormaterialandwidelyusedinfoodindustry.The
optimumseedcultureandfermentationcultureformetabolizingferulicacidtoproducevanilinbyPycnoporus
cinnabarinuswerestudiedinthispaper.TheresultsshowedcelsofPycnoporuscinnabarinuscouldgrowfleetly
inseedcultureunderusingfructoseascarbonsourceandyeastextractasnitrogensource.After3daysculture,
thebiomassofPycnoporuscinnabarinuscouldachieve0.726g·L-1.Resultsforthetestoftheoptimum
fermentationcultureshowedthatthecontentofvanilininfermentationculturecouldachieve0.403g·L-1under
usingtheoptimumcarbonsource,nitrogensourceandmineralsalt.Andthemolarconversionrateofvanilinwas
28.8%.
Keywords:ferulicacid;vanilin;Pycnoporuscinnabarinus;microbialtransformation
张莉力等:朱红秘孔(Pycnoporuscinnabarinus)菌代谢阿魏酸产生香兰素的研究 ·641·第5期