全 文 ：白 , 是跨膜水运的重要通道 , 这为研究糖尿病肾病水代谢的异常
提供了新的角度。目前研究表明 , 尿液浓缩稀释功能由肾脏集合
管主细胞的 AQP-2来完成 , 而 AQP-2的表达主要受加压素
(anti-diuretichormonevasopressin, AVP)的调节。 AVP与肾脏集
合管主细胞基底膜上的 AVPV2受体结合后 , 使细胞内 cAMP浓
度升高 , 激活 PKA,将 AQP-2蛋白磷酸化 ,使之从囊泡穿梭到管
腔膜 , 从而提高集合管对水的通透性 [ 3] , 同时该信号通路激活
CREB元件 ,刺激 AQP-2的合成 ,表现为 AQP-2 mRNA和蛋白
水平的提高 , 从而实现 AVP的抗利尿作用。既往研究表明在 DM
大鼠中血 AVP水平升高 [ 4] ,这可能与水钠潴留有关。从理论上
讲 , DM大鼠血浆渗透压升高 , 刺激 VP分泌增加 , 促进肾小管对
水的重吸收 , 以降低血浆渗透压 , 同时提高尿渗透浓度 , 尿量减
少。而实际上对于 DM大鼠来说 ,这种负反馈机制在早期处于代
偿状态 , VP代偿性升高 , 在晚期则处于失代偿状态 , 尽管有回吸
收水分的倾向 , 但尿量仍然增加。 VP对 AQP-2的调节包括短
期调节和长期调节 , 本研究中 DM大鼠 AQP-2的 mRNA表达增
加 , 促使 AQP-2合成增加 , 导致水通透性增加 , 尿量增加 , 应属
于长期调节。
祖国医学所认识的消渴病日久出现的 “水肿” “胀满” “尿
浊” “关格”与现代医学的糖尿病肾病的临床症状相似。 丹参之
脂溶性成分包括丹参酮 、水溶性成分丹参素 、原儿茶醛 、丹参酚酸
B,研究证实丹参增加肾血流 、有利尿和抗炎作用 , 可降低血
BuN、Scr,调节肾组织局部微循环 ,改善肾功能。临床观察证实 ,
丹参在改善早期 DN患者的水肿 、血液流变学等症状 、降低 FPG、
BuN、UAER、Scr上都有很好的疗效 [ 5 , 6] 。孙兴旺等 [ 7]研究发现 ,
丹参酮可抑制肾成纤维细胞增殖 ,降低细胞内胶原合成率。
本研究结果表明丹参能显著降低糖尿病肾病大鼠 24 h尿蛋
白排泄率。病理提示对照组 、观察组较模型组损伤明显减轻 , 说
明单纯用降糖药物对改善 DN的血流动力学效果不佳 , 而丹参可
全面调理 DN状态时的血液流变学情况 , 延缓肾小球硬化的发
生 , 从而对糖尿病肾病起到保护的作用。同时我们又发现用丹参
治疗能显著降低糖尿病大鼠肾组织中的 AQP-2蛋白表达和基
因表达 ,因此我们推测丹参对糖尿病大鼠肾脏的保护作用可能与
降低 AQP-2的表达有关。但是糖尿病时丹参与 AQP-2在高
血糖时的相互作用的确切表达机制有待进一步深入研究。
参考文献:
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质成纤维细胞体外增殖及 cyclinE蛋白表达的影响 [ J] .第二军医
大学学报 , 2007, 29(7):585.
收稿日期:2009-03-30;　修订日期:2009-07-03
基金项目:教育部 “春晖计划 ”科研合作项目(No.Z2006-1-83015)
作者简介:吴建芳(1985-),女(汉族),山东潍坊人 ,现为新疆石河子大学生命科学学院在读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事植物化学研究工作.
＊通讯作者简介:薛　梅(1964-),女(汉族),江苏扬州人 ,现任石河子大学化学化工学院教授 ,学士学位 ,主要从事天然产物化学和有机合成等研究工
作.
天山堇菜中总黄酮和多糖的微波提取与含量测定
吴建芳 1 ,李炳奇 2 ,薛　梅2＊ ,韦文珍 2
(1.石河子大学生命科学学院 ,新疆 石河子　832003;　2.石河子大学化学化工学院 ,新疆 石河子　832003)
摘要:目的 从天山堇菜中提取总黄酮和多糖 , 并测定其含量。方法 运用微波技术提取天山堇菜总黄酮和多糖 , 用比色
法测定总黄酮和多糖含量。结果 测得天山堇菜中总黄酮含量为 1.465%, 平均回收率为 98.05%, RSD为 1.74%(n=
5);多糖含量为 8.478%,平均回收率为 99.86%, RSD为 1.58%(n=5)。结论 运用微波技术从天山堇菜中提取总黄酮
和多糖 , 反应速度快 ,效率高。
关键词:微波技术;　天山堇菜;　总黄酮;　多糖;　提取
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)05-1105-02
MicrowaveExtractionandDeterminationofTotalFlavonoidsandPolysaccharidesinVio-
latianshanicaMaxim
WUJian-fang1 , LIBing-qi2 , XUEMei2＊ , WEIWen-zhen2
(1.ColegeofLifeSciences, ShiheziUnviersity, Shihezi832003, China;2.ChemistryandChemicalEnginer-
ingColege, ShiheziUniversity, Shihezi832003, China)
Abstract:ObjectiveToextractanddeterminethetotalflavonoidsandpolysaccharidesinViolatianshanicaMaxim.Methods-
TotalflavonoidsandpolysaccharidesinViolatianshanicaMaximwereextractedbymicrowavetechniqueanddeterminedbycolori-
metry.ResultsTotalflavonoidsinViolatianshanicaMaximwas0.440%, therecoveryratewas98.05%, andRSDwas1.74%
(n=5);polysaccharidesinViolatianshanicaMaximwas8.478%, therecoveryratewas99.86%, RSDwas1.58% (n=5).
·1105·
LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.5 时珍国医国药 2010年第 21卷第 5期
ConclusionMicrowavetechniquewasappliedtoextracttotalflavonoidsandpolysaccharidesinViolatianshanicaMaximforthe
firsttime.Thereactionspeedisfastandtheresultissatisfactory.
Keywords:Microwavetechnique;　ViolatianshanicaMaxim;　Totalflavonoids;　Polysaccharide;　Extraction;　Determi-
nation
　　天山堇菜 , 维药名为比那夫西(HerbaViolaeTianshanicae)是
堇菜 Violaceae植物天山堇菜 ViolatianshanicaMaxim的干燥全
草。其气微 , 味微苦辛 、性凉 , 清热解毒 ,具有调理 、软化 、发汗的
作用 [ 1] 。天山堇菜主要分布于新疆南疆各山区 , 前苏联亦有分
布。其药用部位是全草 , 全草经预实验检出含挥发油 、黄酮类 、生
物碱 、氨基酸 、液质皂苷 、鞣质等 [ 2] , 天山堇菜作为维吾尔族药在
新疆民间被广泛应用 , 但有关其化学成分多糖和黄酮的研究 ,至
今未见报道。微波法原理是利用磁控管所产生的 24.5 亿次 /s
超高频率的快速震动 , 使材料内分子间相互碰撞 、挤压 , 利于有
效成分的浸出。与传统的中药煎煮法相比 ,微波加热法可以得到
更高的产物提取率 , 而且整个过程大大缩短提取时间 ,杂质含量
显著减少 [ 3] 。我们运用微波技术联合提取天山堇菜中总黄酮和
多糖 , 以芦丁为对照品测定天山堇菜中总黄酮含量 , 加入铝离子
试剂 , 同时控制适宜 pH值 , 使黄酮化合物与铝盐形成配合物在
可见光区能获得稳定的特征吸收峰;运用微波技术水提醇沉法制
得天山堇菜粗多糖 , 并采用酚 -硫酸比色法对其多糖进行含量测
定 , 以期为天山堇菜总黄酮和多糖的研究和开发利用奠定基础。
1　材料与设备
对照品芦丁 , 购自中国药品生物制品检定所;其余试剂均为
分析纯;天山堇菜 , 购自新疆和田市维吾尔医院。 722型分光光
度计 , 日本岛津;MCL-3型连续微波反应器 , 四川大学无线电
系。
2　方法与结果
2.1　样品溶液制备 取天山堇菜约 2 g, 精密称定 , 用滤纸包好 ,
分置于索氏提取器中 , 用石油醚(60 ～ 90℃)水浴回流脱脂 2次
(2 h/次), 弃去石油醚提取液。天山堇菜挥干石油醚后 , 置 1 000
ml烧瓶中 , 将此烧瓶放入 MCL-3型连续微波反应器中 ,用 80%
乙醇回流提取两次 , 调整功率 560, 500, 400, 350 W, 每次反应时
间 20min,提尽黄酮。另用少量 80%乙醇多次洗涤天山堇菜 ,并
入提取液中 , 定量转移入 100 ml容量瓶中 , 加 80%乙醇至刻度 ,
摇匀 , 即得测总黄酮之天山堇菜样品液。
将提尽黄酮后的天山堇菜置 100ml烧瓶中 , 放入 MCL-3型
连续微波反应器中 , 用 80%乙醇回流提取 20 min, 调整功率 560,
500, 400, 350W, 以除去单糖及一些苷类 ,弃提取液。天山堇菜挥
干乙醇后 , 再放入 MCL-3型连续微波反应器中 , 继续以水回流
提取 2次(20 min/次),调整功率 560, 500, 400, 350W, 减压抽滤 ,
各次滤液合并。水浴浓缩后 , 用蒸馏水定容至 250 ml, 即为测多
糖的天山堇菜样品液 。
2.2　总黄酮含量的测定
2.2.1　标准曲线制备 精密称取芦丁对照品 10 mg,置 25 ml量
瓶中 , 加 80%乙醇溶解 , 定容 , 精密吸取 0.0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8,
1.0 ml, 分置于 10 ml量瓶中 , 加 5%亚硝酸钠 0.3 ml,放置 6min,
再加 10%硝酸铝 0.3 ml,放置 6 min, 加 4%氢氧化钠 4 ml, 加水
至刻度 , 摇匀。进行全波长扫描在 510 nm处均有最大吸收。以
510nm处测得的吸收度 A对浓度 C回归 , 得回归方程:A=
11.225C+0.002 7, r=0.999 13,在 8 ～ 40 μg/ml的范围内 , 浓度
与吸收度有良好的线性关系。
2.2.2　样品测定 分别将测总黄酮的各样品液定量稀释后 , 再
精密吸取各稀释液适量于 10 ml量瓶中 ,照标准曲线制定项下方
法操作 , 测定吸收度 ,由回归方程求出稀释液中总黄酮浓度 ,然后
计算百分含量。结果见表 1。
2.2.3　精密度实验 分别量取黄酮样品液适量按 “ 2.2.1”项下
的操作 , 对同一样品液连续测定 5次。结果 RSD=1.02%(n=
5),表明本实验精密性良好。
2.2.4　重复性实验 精密称取同批天山堇菜样品共 5份 , 按
“ 2.1”项下方法操作 , 制备黄酮样品济液 5份 , 进行含量测定。
RSD=1.42(n=5), 结果表明本方法重复性良好。
2.2.5　稳定性实验 按 “ 2.2.2”项下方法操作 , 测定同一供试
液在不同时间的吸收度。结果表明 ,吸收度值在 9 h内基本保持
不变。
2.2.6　回收率实验 取已知总黄酮含量的供试品溶液 1.0 ml
于 100ml容量瓶中 ,再加入 0.2mg/ml的芦丁对照品溶液 0.5 ml
依法测定 ,结果平均回收率为 98.05%, RSD=1.74%(n=5)。
2.3　多糖含量测定
2.3.1　标准葡萄糖溶液的配制 精密称取干燥恒重的葡萄糖
25.2 mg, 加适量水溶解 , 转移至 250 ml容量瓶中 , 加水至刻度 ,
摇匀 , 配成浓度为 100.08 μg/ml标准葡萄糖溶液备用。
2.3.2　5%苯酚试剂的配制 取苯酚 100 g,加铝片 0.1 g和碳酸
氢钠 0.05g, 蒸馏。收集 182℃馏分 , 称取 7.5 g, 加水 150 ml溶
解 , 置棕色瓶内放冰箱备用。
2.3.3　标准曲线制备 精密量取 100.08μg/ml标准葡萄糖溶液
0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 ml置于干燥试管中 , 分别加水使
成 1.0 ml,再分别加入 5%苯酚溶液 1.6 ml摇匀 , 然后加浓硫酸
7.0 ml,充分摇匀 , 室温放置 25 min,在 540 nm处测定其最大吸
收度 , 同时做一空白 , 结果浓度在 10.05 ～ 75.5 μg/ml范围内呈
线形关系 , 实验数据做回归处理得回归方程:A=0.069 1C+
0.000 3, r=0.999 05。
2.3.4　换算因素测定 称取天山堇菜 30 g, 置于烧瓶中 , 将此烧
瓶放入 MCL-3型连续微波反应器中 ,依次用 250 ml石油醚(60
～ 90℃)、乙醚和 80%乙醇回流提取两次 , 调整功率 560, 500,
400, 350 W,反应时间 20 min。减压抽滤 , 残渣挥干溶剂后 , 再放
入 MCL-3型连续微波反应器中 , 调整功率 560, 500, 400, 350W,
继续以水回流提取两次 , 20 min/次 , 减压过滤 , 合并滤液。将滤
液减压浓缩至一半体积 , 加入 0.1%活性炭 , 脱色两次 , 过滤 , 滤
液加 5倍量 95%乙醇 , 放置过夜 , 抽滤后的沉淀以 100 ml水溶
解 , 重复醇沉 1次。过滤 ,残渣用乙醚 、无水乙醇反复洗涤 , 干燥 ,
即得多糖。精确称取 60℃干燥恒重的多糖 20 mg, 水溶解后定容
到 100 ml容量瓶中 , 摇匀 ,作为多糖储备液。精确量取多糖储备
液 0.2 ml,加水至 1ml, 按测定标准曲线同样的方法测其吸收度。
按下式计算换算因素:f=W/CD。
式中:W为多糖重量(μg), C为多糖液中葡萄糖的浓度(μg/
ml), D为多糖的稀释因素 ,测得 f=2.24。
2.3.5　样品含量测定 精确吸取样品液 1 ml, 按标准曲线制备
项下方法测定其吸收度值 ,按下式计算多糖含量 , 多糖含量(%)
=CDf/W×100% (C为样品溶液的葡萄糖的质量 , D为样品溶液
的稀释倍数 , f为换算因素)。结果见表 1。
表 1　天山堇菜中总黄酮和多糖含量
测定
次数
总黄酮(%)
含量 x±s RSD
多糖(%)
含量 x±s RSD
1 1.447 8.216
2 1.460 1.465±0.020 1.39 8.694 8.478±0.242 2.86
3 1.487 8.538
2.3.6　 精密度实验 分别量取多糖样品液 1 ml按 “ 2.2.1”项下
的操作 ,对同一样品液连续测定 5次。结果表明 , 采用苯酚 -硫
酸法测定样品 , RSD=0.98%(n=5)精密性良好。
2.3.7　重复性实验 精密称取同批天山堇菜样品共 5份 , 按
“ 2.1”项下方法操作 , 制备多糖样品济液 5份 , 进行含量测定。
RSD=1.42(n=5), 结果表明本方法重复性良好。
·1106·
时珍国医国药 2010年第 21卷第 5期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.5
2.3.8　稳定性实验 用硫酸 -苯酚法测定同一样品液在不同时
间的吸收度 , 吸收度值至少在 36 h内不变。
2.3.9　回收率测定 精密称取天山堇菜适量 , 加入精制天山堇
菜多糖适量 , 按 “ 2.1”和 “ 2.3.5”操作 , 测得多糖平均回收率为
99.86%, RSD=1.58%(n=5)。
3 　讨论
黄酮类化合物是植物次生代谢产物 ,广泛地存在于自然植物
中 , 表现出多种多样的药理活性 , 能防治心脑血管系统的疾病和
呼吸系统的疾病 , 具有抗炎抑菌 、降血糖 、抗氧化 、抗辐射 、抗癌 、
抗肿瘤以及增强免疫能力等药理作用 [ 4] 。多糖是生物体内普遍
存在的一类生物大分子 ,具有许多重要的生物活性 , 如参与细胞
骨架的构成 , 作为多种内源性生物活性分子的组成成分等 [ 5] 。
我们运用微波技术首次提取了天山堇菜中的黄酮和多糖 ,并对其
进行含量测定。结果显示 , 天山堇菜中黄酮含量为 1.465%, 含
量较少;多糖含量较高为 8.478%, 具有较高的开发利用价值。
本课题对天山堇菜的多糖和黄酮进行含量测定 ,为其活性成分的
研究和资源开发利用提供依据。天山堇菜多糖和黄酮的结构组
成和药理活性有待进一步研究。
参考文献:
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收稿日期:2009-09-01;　修订日期:2009-12-26
基金项目:河南省科技厅科技攻关课题(No.072102330029)
作者简介:毛毅敏(1961-),男(汉族),河南洛阳人 ,现任河南科技大学附
属第一医院教授 ,主任医师 ,硕士学位 , 主要从事呼吸系统常见病和急危
重症的临床及研究工作.
茎叶人参皂苷对大鼠急性肺损伤肺组织
TNF-α含量及 IL-8表达的干预作用
毛毅敏1 ,孙瑜霞 1 ,王学廷 2 ,单世民1
(1.河南科技大学附属第一医院 ,河南 洛阳　471003;　2.河南科技大学医学院 ,河南 洛阳　417003)
摘要:目的 研究茎叶人参皂苷对内毒素(LPS)诱导大鼠急性肺损伤(ALI)肺组织肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)含量及白
细胞介素 -8(IL-8)表达的干预作用。方法 采用内毒素诱导急性肺损伤大鼠模型 ,随机分为正常对照组(NS组),模型
组(ALI组),皂苷组(GS组)。观察茎叶人参皂苷对内毒素诱导大鼠急性肺损伤肺组织 TNF-α含量及 IL-8表达的影
响。结果 ①与 NS组比较 , ALI组肺组织 TNF-α显著增高(P<0.01);与 ALI组比较 , GS组肺组织中 TNF-α显著低于
ALI组(P<0.01)。 ②与 NS组比较 , ALI组 IL-8的表达增高(P<0.05);与 ALI组比较 , GS组表达减低 , 差异有统计学
意义(P<0.05)。结论 茎叶人参皂苷可降低肺组织中 TNF-α的含量 ,抑制急性肺损伤大鼠肺组织 IL-8的表达。
关键词:急性呼吸窘迫综合征;　急性肺损伤;　茎叶人参皂苷;　内毒素;　肿瘤坏死因子 -α;　白细胞介素 -8
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)05-1107-02
　　急性肺损伤 ALI/ARDS实际上是一种炎症反应 , 炎症因子增
高伴有抗炎因子表达的下降是其发病机制的关键。肿瘤坏死因
子(TNF-α)作为主要的前炎性因子 , 是炎性反应中释放最早和
最重要的内源性介质 。白细胞介素 -8(IL-8)属于炎症介质 , 是
一种具有活化 、趋化作用的细胞因子 , 研究表明白细胞介素 -8
是 ALI/ARDS发病机制的一个重要环节。本研究旨在通过内毒
素诱导急性肺损伤模型的复制 ,通过检测肺组织 TNF-α及肺 IL
-8水平 ,探讨茎叶人参皂苷是否能通过影响细胞因子的水平进
而有效地减轻 ALI时的炎症反应。
1　材料
清洁级健康 SpragueDawley(SD)大鼠 45只 , 体质量(300 ±
40)g, 由河南省实验动物中心提供 [实验动物生产许可证号:
SCXK(豫)2008-0017, 实验动物使用许可证号:SYXK(豫)2008
-0105] 。内毒素脂多糖(lipopolysaccharide, LPS, E.coliO55B5)
由美国 Sigma公司提供;茎叶人参皂苷粉剂(stemsandleavesGin-
senoside)由辽宁大自然生物科技公司提供;白细胞介素 -8(in-
terleukin-8)兔抗鼠单抗由上海麦莎生物科技公司;TNF-α放
射免疫药盒由上海赛百胜生物工程公司提供。
2　方法
2.1　分组及模型建立 清洁级 SD雄性大鼠 45只 ,体质量(300±
40)g,以随机数字法分 3组:正常对照组(NS组), 模型组(ALI
组),皂苷组(GS组), 每组 15只;大鼠禁食 6 h, 自由饮水 , 称重
后 , 暴露尾静脉 , 各组注药均由尾静脉注入。 NS组和 ALI组注入
生理盐水 1ml, GS组注入茎叶人参皂苷溶液(生理盐水稀释)100
mg· kg-1· ml-1 , 45 min后 , NS组大鼠尾静脉注入 1 ml生理盐
水 , ALI组 、GS组均将 LPS5mg/kg溶解于 1ml生理盐水由尾静
脉注入 。
2.2　观察指标 5 h后 , 观察各组大鼠的一般状况;腹主动脉取血
(1∶500U肝素抗凝)行血气分析 , 腹主动脉放血处死大鼠;取大
鼠左下肺组织计算肺系数;取左上肺进行 TNF-α测定;取右肺
组织肉眼观察和病理 HE染色 200×光镜下观察;免疫组化 SABC
法检测各组肺组织白细胞介素 -8, 病理图像分析系统测定肺组
织中 IL-8的平均灰度值。
2.3　统计学 计量资料数据以 x±s表示。采用单因素方差分析
(one-wayANOVA)进行组间比较 , 以最小显著差异法(LSD法)
进行不同组别之间的两两比较。采用 SPSS13.0统计软件进行数
据处理 。
3　结果
3.1　肺损伤指标 ALI组 PaO2明显低于 NS组(P﹤ 0.01), 肺系
数明显高于 NS组(P﹤ 0.01);GS组 PaO2较 ALI组有所增加(P
﹤ 0.01),而肺系数也较 ALI组减低(P﹤ 0.01)。结果表 1。
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.5 时珍国医国药 2010年第 21卷第 5期