全 文 ：* 山东大学博士研究生
藤梨根提取物抗人肺腺癌 A549细胞
生长的实验研究
孙雪飞 1* ,杜贾军 2 ,孟　龙 2 ,陈景寒 2
( 1武警山东省总队医院 ,山东济南 250014; 2山东省立医院 )
　　【摘要】　采用 M TT检测法、集落形成试验、流式细胞术检测细胞凋亡及建立裸鼠移植瘤模型进行体内实验 ,观
察藤梨根提取物对肺腺癌 A549细胞的生长抑制作用。结果显示各浓度的藤梨根提取物对肺腺癌 A549细胞均有较强
的抑制效应 ,且呈现出明显的时相性和量-效依赖性 ;藤梨根提取物作用后 G0～ G1期细胞数增加 ,细胞出现凋亡 ,并
随药物浓度增大作用增强 ;移植瘤体内试验显示藤梨根提取物高剂量组移植瘤生长缓慢 ,体积明显小于对照组及低剂
量组。 表明藤梨根提取物对人肺腺癌 A549细胞在体内外均有生长抑制作用 ,并可诱导其细胞凋亡。
【关键词】　肺肿瘤 ;藤梨根 ;肺腺癌 A549细胞株 ;裸鼠
【中图分类号】　 R734. 2　　【文献标识码】　 B　　【文章编号】　 1002-266X ( 2006) 09-0040-02
　　藤梨根为猕猴桃科猕猴桃属软枣猕猴桃的根 ,
近年研究发现 ,藤梨根提取物体外对多种肿瘤有抑
制作用。 但不同方法萃取的提取物对肿瘤的抑制效
果不同 ,有研究显示藤梨根乙酸乙酯提取物抗肿瘤
效果较佳 [1 ]。 2005年 2～ 8月 ,我们以肺腺癌 A549细
胞系作为研究对象 ,从体内外两条途径观察藤梨根
乙酸乙酯提取物对肺腺癌细胞的生长抑制作用 ,以
期为进一步临床用药提供依据。
1　材料与方法
1. 1　材料　人肺腺癌 A549细胞系由山东省医学科
学院惠赠。 BALB /C( nu /nu)裸小鼠购自北京维通利
华实验动物有限公司 , SPF级 ,鼠龄 3～ 4周 ,体重 16
～ 18 g ,雄性。 藤梨根乙酸乙酯提取物自行制备。
1. 2　实验方法
1. 2. 1　细胞增殖抑制实验　采用 M TT检测法。实
验组分别加入浓度为 25、 50、 100、 200、 400μg /ml的
藤梨根乙酸乙酯提取物 ,对照组加入等体积二甲基
亚砜 ( DM SO ) ,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸
收值 ( OD) ,计算生长抑制率 ,抑制率= ( 1- 实验孔
OD值 /对照孔 OD值 )× 100% 。以上实验重复 3次。
1. 2. 2　集落形成实验　将对数生长期人肺癌 A549
细胞接种于 24孔培养板内 ,培养 24 h后 ,吸弃上清 ,
加入含不同浓度的藤梨根乙酸乙酯提取物 ( 25、 50、
100、 200、 400μg /m l )的培养液 ,并设实验对照孔
( 0. 5% DMSO+ 细胞 ) ,在培养 24、 48 h后 ,更换培养
液后继续培养 7 d,甲醛固定 , Giemsa染色 ,镜下计数
每孔> 50个细胞以上的集落数目 ,计算集落形成抑
制率。 集落形成抑制率 (% )= 1-实验组集落数 /对
照组集落数× 100% 。
1. 2. 3　检测细胞周期及凋亡率　采用流式细胞术。
取对数生长期的 A549细胞 ,细胞浓度为 5× 105 /ml ,
接种于 24孔细胞培养板中 ,每孔 2 m l。实验组组分别
加入浓度为 25、 50、 100、 200、 400μg /m l的藤梨根乙
酸乙酯提取物 ,对照组加 PBS, CO2孵箱内继续培养
48 h ,分别收集各组细胞 (每组细胞数> 1× 106 ) ,加
70%乙醇 500μl固定 , 4℃过夜 , PBS洗涤 ,离心后细
胞沉淀中加入 PI染色液 ( 10 mg /l) 0. 5 ml,室温避光
染色 1 h后上机检测细胞周期和凋亡率。
1. 2. 4　 BALB /C( nu /nu)裸小鼠体内移植实验　将
人肺腺癌细胞按常规方法复苏扩增 ,用带 6号针头注
射器抽取癌细胞悬液接种于裸鼠前腋部皮下 ,每个
部位接种 0. 2 ml(含活细胞数 1× 106 ) ,成瘤后随机分
为两个实验组和对照组 ,每组 6只。各组裸鼠的体重
无显著差异。高剂量实验组按 1000 mg /kg、低剂量实
验组按 500 mg /kg ,每日 1次灌服藤梨根提取物 ,对照
组灌服等量蒸馏水 ,治疗 28 d。最后一次用药后 24 h
以颈椎脱位方式处死裸鼠 ,测量瘤重 ,计算各组平均
瘤重及抑瘤率 ( IR)。 IR= 〔 (对照组平均瘤重 -实验
组平均瘤重 ) /对照组平均瘤重〕× 100% 。 并对裸鼠
进行解剖 ,取肿瘤、重要脏器及淋巴结以 10%福尔马
林固定、石蜡包埋切片 , HE染色光镜下观察。
1. 3　统计学方法　应用 SPSS10. 0统计软件 ,采用 t
检验 ,以 P≤ 0. 05为差异有统计学意义。
2　结果
2. 1　藤梨根提取物对人肺腺癌 A549细胞增殖的抑
制率　对照组无细胞抑制。 实验组在药物浓度分别
40
山东医药 2006年第 46卷第 9期
为 25、 50、 100、 200、 400μg /m l时 ,癌细胞的生长抑制
率 24 h分别为 11. 20% 、 22. 35% 、 40. 17% 、 51. 25% 、
63. 12% , 48 h分别为 23. 79% 、 35. 42%、 49. 83%、
63. 59% 、 74. 93% , 72 h分别为 33. 47%、 45. 18%、
60. 23% 、 73. 45%、 87. 32% ,各浓度组、各时间组之
间相比较 , P均 < 0. 05,差异有显著性。
2. 2　藤梨根提取物对人肺腺癌 A549细胞集落形成
的抑制率　对照组无细胞抑制。在药物浓度分别为
25、 50、 100、 200、 400μg /ml时 ,对癌细胞集落的抑制
率 24 h分别为 19. 37% 、 34. 10% 、 49. 29% 、 61. 99% 、
76. 09% , 48 h分别为 35. 77% 、 53. 79%、 63. 83%、
74. 43% 、 84. 76% ,与对照组相比差异有显著性 ( P
< 0. 05) ,各浓度组、各时间组之间相比差异亦有显
著性 ( P < 0. 05)。
2. 3　藤梨根提取物对人肺腺癌 A549细胞细胞周期
和凋亡的影响　见表 1。
2. 4　藤梨根提取物对人肺腺癌裸鼠移植瘤的影响
　药物对裸鼠移植瘤体积及瘤重的影响见表 2。 高、
低剂量组的抑制率分别为 71. 40%和 40. 35% , P <
0. 05,差异有显著性。 无明显毒性反应 ,裸鼠脏器及
淋巴结解剖后连续切片观察未发现肿瘤体内转移。
表 1　藤梨根提取物对人肺腺癌 A549细胞细胞周期
和凋亡的影响 ( x± s )
组别 药物剂量
(μg /ml)
细胞周期比率 (% )
G0～ G1 S G2～ M 凋亡率 (% )
对照组
实验组 25
50
100
200
400
43. 4±1. 21　
55. 2±0. 86　
69. 5±1. 43*
78. 6±1. 52*
82. 3±1. 67*
86. 5±1. 08*
49. 6± 0. 45　
38. 3± 1. 58　
25. 1± 0. 69*
16. 6± 1. 18*
13. 7± 0. 98*
11. 2± 1. 47*
7. 3±1. 32　
6. 4±1. 76　
5. 5±1. 54*
4. 7±1. 33*
3. 9±1. 45*
2. 3±0. 92*
1. 08± 0. 42　
8. 65± 1. 15* △
15. 60± 1. 34* △
24. 76± 1. 59* △
30. 74± 1. 43* △
35. 85± 1. 67* △
　　注:与对照组相比 ,* P < 0. 05;各浓度组之间凋亡率相比 ,△ P < 0. 05
表 2　药物对裸鼠瘤体积及瘤重的影响 ( x± s )
组别　 瘤体积 ( mm3 ) 瘤重 ( mg)
对照组
实验组
　低剂量组
　高剂量组
837. 7± 31. 3
482. 6± 23. 5
237. 4± 37. 2
927. 3± 56. 4　　
553. 1± 50. 7* 　
265. 2± 35. 9* ▲
　　注:与对照组相比 , * P < 0. 01;与低剂量组相比 ,▲ P < 0. 05
3　讨论
藤梨根在临床上用于消化道肿瘤的治疗由来已
久 ,现代实验研究发现其复方制剂在体内外均有抑
制肿瘤转移 [ 2]、逆转多药耐药、对化疗药物减毒增效
的作用。 也有研究发现猕猴桃属其他种类猕猴桃的
根单体在体外对多种肿瘤细胞有抑制作用 [3, 4 ] ,关于
藤梨根单体对肺癌的作用尚未见报道 ,本研究以肺
腺癌 A549细胞为研究对象 ,结果显示藤梨根乙酸乙
酯提取物在体外对人肺腺癌 A549细胞有明显的抑
制作用 ,并呈现出时间和剂量依赖性 ,随着药物浓度
的加大 ,抑制作用逐渐增强 ,同样浓度的药物作用时
间越长 ,抑制效果越明显。在药物浓度为 25μg /m l时
即呈现出轻微的抑制作用 ,药物浓度为 400μg /ml时
抑制作用最明显 ,在此浓度下其集落形成抑制率最
高。 集落形成反映肿瘤细胞中具有增殖活性的干细
胞的增殖能力 ,而干细胞是肿瘤治疗中的主要靶细
胞 ,如对干细胞具有抑制作用 ,说明其对抑制肿瘤细
胞生长有重要意义。
G1期是 DNA合成前期 ,主要是完成与 DNA复
制、合成有关的蛋白质的合成 , S期是 DNA合成期 ,
此期细胞 DNA含量较间期增加一倍 , S期细胞数在
一定程度上可以反应细胞增殖旺盛与否 ,本研究观
察到藤梨根乙酸乙酯提取物对细胞周期产生影响 ,
可使 G0～ G1期细胞数目增多 , S期和 G2～ M期细胞
数减少 ,出现 G0～ G1期阻滞 ,提示其可抑制肿瘤细胞
的有丝分裂。 本组检测发现实验组细胞凋亡率高于
对照组 ,随着药物浓度的升高 ,凋亡率亦逐渐增加 ,
提示藤梨根乙酸乙酯提取物具有诱导人肺腺癌 A549
细胞凋亡的作用。
本研究结果显示 ,与对照组相比 ,实验组裸鼠移
植瘤生长缓慢 ,治疗结束时低、高剂量组抑瘤率分别
为 40. 35%和 71. 4%。表明藤梨根乙酸乙酯提取物可
以抑制人肺腺癌 A549在裸鼠体内的生长 ,可以减轻
裸鼠的瘤重 ,在体内同样有明显的抗肺癌作用 ,且高
剂量组治疗效果明显优于低剂量组 ,与体外试验一
致。同时未见药物有毒副反应 ,实验组与对照组裸鼠
体重比较无显著差异 ,裸鼠脏器及淋巴结解剖后连
续切片观察未发现肺癌体内转移。
本研究结果表明藤梨根乙酸乙酯提取物在体内
外对肺癌均有抑制作用 ,且呈现出时间与剂量依赖
性 ,可抑制肿瘤细胞的有丝分裂 ,并可诱导细胞凋
亡。但其具体抗癌机制有待进一步研究 ,随着研究的
逐步深入 ,藤梨根在治疗肺癌方面将具有良好的开
发前景。
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(收稿日期: , 2005-11-21)
41
山东医药 2006年第 46卷第 9期