全 文 ：263.
[ 5] 钟振国 , 张凤芬 ,甄汉深 , 等.美味猕猴桃根提取物抗肿
瘤作用的实验研究 .中医药学刊 , 2004, 22(9):1705-
1707.
[ 6] 徐叔云 , 卞如镰 ,陈修 .药理实验方法学 .北京:人民卫
生出版社 , 2002:1786.
[ 7] 韩锐 .抗癌药物研究与实验技术 .北京:北京医科大
学 、中国协和医科大学联合出版社 , 1997:271-272.
(2006-11-23收稿)
基金项目:广东省科技计划项目(编号:2005B33001039)作者简介:苏向阳(1967-),女 ,副主任医师 ,医学硕士 ,硕士生导师。＊通讯作者:曲彩红 ,主管药师, E-mail:zssy9ch@126.com。
蜀羊泉凝胶大鼠皮肤长期毒性实验研究
苏向阳 1 ,曲彩红 2＊ ,张干元 3 ,赖 维 1
(中山大学附属三院 1.皮肤性病科;2.药剂科 ,广东广州 510630;3.广州旭芳药物开发有限公司 ,广东
广州 510176)
摘要 目的:观察和测定蜀羊泉凝胶长期连续经皮肤给药对实验动物大鼠的长期毒性。方法:用蜀羊泉凝胶
以高低两组剂量 ,分别经大鼠完整及破损皮肤每天给药 1次 ,连续 90 d,观察大鼠一般性状 , 检测主要血液学指标 、
生化指标以及主要脏器病理组织学的变化。结果:主要血液学指标 、生化指标 、主要脏器重量系数等均属正常范
围 ,与空白对照组比较无统计学差异;解剖主要脏器未见病理性改变。结论:蜀羊泉凝胶长期连续经皮肤给药对试
验大鼠没有毒性反应 ,说明在临床剂量下使用是安全的 ,为临床安全用药提供了实验依据。
关键词 蜀羊泉;凝胶剂;大鼠;长期毒性
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2007)10-1282-04
StudyofLong-termToxicityonApplyingSolanumlyratumonRatSkin
SUXiang-yang1 , QUCai-hong2 , ZHANGGan-yuan3 , LAIWei1
(1.DermatologyDepartment;2.PharmacyDepartment, theThirdAfiliatedHospitalofSunYat-senUniversity, Guangzhou510630,
China;3.XufangPharmaceuticalDevelopmentCompany, Guangzhou510176, China)
Abstract Objective:Toobservethelong-termtoxicityofratswhichwehadappliedSolanumlyratumThunbgelontheirskins
dailyfor90 days.Methods:WehadappliedhighandlowdosesofSolanumlyratumThunbgelonetimeeachdayonhealthyandpunc-
turedratsskinsrespectivelyfor90days.Theratscharacterswereobserved, andtheirbloodroutines, bloodbiochemistryindex, ana-
tomicandpathologicchangesoftheirmajororganswerealsodetected.Results:Ratscharactershadnochange, theresultsofalldetec-
tionswerenormal.Therewasnosignificantdiferencebetweentestgroupsandcontrolgroup.Ratsmajororganshadnochangeinanat-
omyandpathology.Conclusion:Nolong-termtoxicreactioncanbefoundinthetestofratsappliedSolanumlyratumThunbgelontheir
skinsforalongterm.Itprovesthatitissafeusingthenormaldoseofthisgelontheskininclinic.
Keywords SolanumlyratumThunb;Gel;Rat;Long-termtoxicity
蜀羊泉凝胶是药用植物蜀羊泉(Solanumlyra-
tumThunb)的提取物制剂 ,主要成分为多种甾体生
物碱及甾体皂苷。根据其药性 ,它具有可的松样抗
炎作用以及抗真菌作用 ,而无可的松样副作用 ,适用
于慢性湿疹及真菌感染性皮肤病的局部治疗 。我们
经过 3年多时间的潜心研究 ,已取得了成熟的制备
方法和创新的制剂工艺 ,完成了有效部位筛选 、制剂
工艺与质量标准 、稳定性的研究 〔1〕。为了解该制剂
在临床上长期使用可能带来的毒性 ,在此基础上我
们参照 《药物研究技术指导原则 》〔2〕对 “蜀羊泉凝
胶 ”进行了临床应用前的大鼠皮肤长期毒性实验研
究 ,现将研究结果报道如下 。
1 实验材料
1.1 实验动物 健康大鼠 ,普通级 ,体重 190 ～ 230
g,雌雄各半。购自武汉生物制品研究所 [许可证:
SCXK(鄂)2003-0003] ,合格证编号:0036605。
1.2 受试药物 蜀羊泉凝胶 ,为棕褐色液体 ,规
格:100 ml:40g,批号:20050219,由广州旭芳医药开
·1282· JournalofChineseMedicinalMaterials 第 30卷第 10期 2007年 10月DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2007.10.032
发有限公司提供。
1.3 空白对照品 空白基质 ,深绿色凝胶 ,由卡波
普 、甘油 、薄荷油及三乙醇胺等组成 ,由广州旭芳医
药开发有限公司提供。
1.4 仪器 CELL-DYN3700全自动五分类血球分
析仪;HITACHI7060全自动生化分析仪 。
2 实验方法
2.1 动物分组与剂量设计 参照 《药物研究技术
指导原则 》的要求 ,取上述规格大鼠 110只 ,按体重
随机分成 5组 ,分别为完整皮肤高剂量组 、完整皮肤
低剂量组 、破损皮肤高剂量组 、破损皮肤低剂量组及
空白对照组 ,每组均为 22只 ,雌雄各半 。高剂量组
涂蜀羊泉凝胶 1.0ml/只 · d,低剂量组涂蜀羊泉凝
胶 0.5ml/只· d,空白对照组涂空白基质 0.5ml/只
·d。涂药部位为大鼠背部脊柱两侧 ,面积约 40
cm2 ,于给药前将毛剃掉。破损皮肤组大鼠则用针
头在剃毛后皮肤上划井字 ,深浅以渗血为度 。
2.2 实验步骤 按实验要求在大鼠背部剃毛区涂
药 ,涂药后用胶布加以固定 ,每天 1次 ,连续给药 90
d(每周停药 1 d),每 7 d称体重 1次。给药末期记
录大鼠的一般性状 ,并每组取 14只大鼠(雌雄各
半)用戊巴比妥钠麻醉后 ,心脏采血 ,检测血常规及
血液生化指标 ,随后做系统尸检及病理检查;恢复期
末(停药 14 d)将余下大鼠同法处理 。
2.3 实验环境及条件 实验大鼠每只分笼饲养 ,
基础饲料为实验鼠全价颗粒饲料(湖北省实验动物
研究中心全价营养颗粒饲料加工厂),饮用水为已
洁净消毒的水 ,笼底垫料为锯末 ,使用前已经洁净消
毒 ,每 2d更换 1次 。实验室温度为 21 ～ 24℃,湿度
为 55% ～ 70%,光照 12h的明暗周期 。
2.4 观察指标
2.4.1 一般观察:给药期和恢复期内逐日观察受
试大鼠的外观 、行为体征 、活动 、精神状态 、进食 、体
重变化(每 7d称体重 1次 ,计算给药前后体重的增
减率)、粪便及尿液等情况。如有中毒反应 ,则重点
观察 ,发现死亡或濒死者及时尸检 。
2.4.2 血液学指标:心脏采血收集血液 ,用仪器检
测红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板 (PLT)绝
对值 、白细胞分类(包括嗜中性粒细胞 、淋巴细胞 、
单核细胞 、嗜酸性粒细胞)、血红蛋白(HGB)、红细
胞压积(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、红细胞平
均血红蛋白 (MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度
(MCHC)、血小板平均体积(MPV)、血小板容积比
(PCT)等主要血液学指标 。
2.4.3 血液生化指标:在作血液学指标的同时 ,收
集血液 ,分离血清 ,用仪器检测谷丙转氨酶(ALT)、
谷草转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总
胆红素 (TBIL)、碱性磷酸酶 (ALP)、谷酰转肽酶
(GGT)、葡萄糖 (GLU)、尿素氮 (BUN)、肌酐
(CREA)、总胆固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)、磷酸
肌酸激酶(CK)、钙(Ca+)、钾(K+)、钠(Na+)、氯离
子(Cl-)等主要血液生化指标。
2.4.4 系统尸检及病理检查:大鼠放血处死后 ,立
即对主要脏器做视观剖检 ,观察主要脏器及腺体有
否肉眼可见肿大 、缩小 、色泽 、硬度等病变。并取出
心 、肝 、脾 、肺 、肾 、脑 、肾上腺 、胸腺 、子宫 、卵巢 、睾
丸 、附睾分别称重 ,以器官重量 (mg)与该动物体重
(g)计算脏器系数。完整皮肤高剂量组 、破损皮肤
高剂量组及空白对照组动物的心 、肝 、脾 、肺 、肾 、脑 、
肾上腺 、胸腺 、甲状腺 、子宫 、卵巢 、睾丸 、附睾 、直肠 、
十二指肠 、胃及皮肤作病理切片检查 。
2.5 统计学处理 采用 SPSS11.0软件 ,差异比较
用 t检验 ,显著性水平 α<0.05。
3 结果
3.1 一般性状观察 给药期及恢复期各组大鼠外
观 、行为 、活动 、精神状态均无明显异常;饮食 、粪便
正常 ,体重增加。见表 1。
表 1 给药前后体重变化( x±SD, n=22)
组别 剂量(ml) 0d(g) 90d(g) 增减率
＊
(%)
高剂量完整皮肤组 1.0 221.1±6.4 349.5±7.9 +58.1
高剂量破损皮肤组 1.0 209.8±5.7 335.4±7.5 +59.9
低剂量完整皮肤组 0.5 218.3±6.2 348.5±8.6 +59.6
低剂量破损皮肤组 0.5 222.7±6.3 350.4±5.7 +57.3
空白对照组 0.5 199.6±4.6 331.9±5.8 +66.3
＊表示与给药前比较 , +示增加
3.2 主要血液学指标 给药组大鼠在给药期或恢
复期 ,其红细胞(RBC)等外周血象值与对照组比较
无统计学差异(P>0.05)。本品对正常大鼠外周血
象无明显影响 ,恢复期未见延迟性损害。见表 2。
3.3 血液生化指标 给药期及恢复期各组大鼠血
液生化指标与对照组比较均无统计学差异 (P>
0.05)。本品对正常大鼠肝 、肾功能 ,蛋白质 、糖 、脂
肪代谢均无明显影响 。见表 3。
3.4 系统解剖主要脏器系统及病理组织学检查
给药期及恢复期各组大鼠的主要脏器心 、肝 、脾 、肺 、
肾 、脑 、胃 、肠 、肾上腺 、甲状腺 、睾丸 、子宫等肉眼观
察其位置 、形态 、色泽 、硬度等均无明显异常情况 。
各组大鼠脏器系数与对照组比较基本一致 (P>
0.05)。病理组织学检查:各组重要脏器病理检查
均无异常。见表 4。
·1283·JournalofChineseMedicinalMaterials 第 30卷第 10期 2007年 10月
表 2 血液学指标测定( x±SD, n=22)
剂量组 试验末重(g) Hb(g/100ml) RBC(万 /100ml) WBC(个 /mm3)
白细胞分类(%)
嗜中性白细胞 淋巴细胞 单核细胞 嗜酸性白细胞
血小板(万 /mm3)
高剂量完整皮肤组 349.5±7.9 13.02±0.86 730.14±112.3 5127.36±206.4 14.67±6.4 74.39±5.7 1.8 1.7 12.67±1.45
高剂量破损皮肤组 335.4±7.5 12.97±1.06 729.37±121.6 5089.42±167.3 16.28±5.9 73.67±6.8 2.1 1.8 12.23±1.83
低剂量完整皮肤组 348.5±8.6 14.03±0.75 738.62±107.4 5346.71±172.7 14.36±7.2 75.26±5.4 1.9 2.2 12.18±2.16
低剂量破损皮肤组 350.4±5.4 13.14±0.83 740.39±118.7 5374.68±196.3 15.53±6.9 77.25±6.9 1.6 2.1 12.03±1.52
空白对照组 331.9±5.8 12.94±0.97 727.83±117.2 5745.38±134.6 17.07±5.8 73.84±7.8 1.7 1.9 12.11±1.67
表 3 血清转氨酶及尿素氮测定( x±SD, n=22)
剂量组 AST(赖氏单位) ALT(赖氏单位) 黄疸指数(单位) TTT(浊度) BUN(mg/d)
高剂量完整皮肤组 90.73±6.42 81.48±22.31 7.36±0.85 2.04±0.43 23.43±2.27
高剂量破损皮肤组 89.26±7.63 63.74±18.28 8.06±0.39 1.92±0.72 21.61±1.93
低剂量完整皮肤组 92.17±6.27 59.83±20.46 7.64±0.72 2.16±0.94 22.76±2.51
低剂量破损皮肤组 88.36±7.48 62.42±19.67 6.78±1.03 1.87±0.86 20.94±3.04
空白对照组 86.62±6.81 57.61±23.16 6.53±1.23 1.73±0.62 19.87±2.93
表 4 脏器重量系数测定( x±SD, n=22)
剂量组 时间(天) 动物数(只) 心 肝 脾 肺 肾
高剂量完整皮肤组 90 14 0.41±0.07 3.86±0.65 0.28±0.06 0.14±0.08 0.69±0.07
104 8 0.43±0.04 3.91±0.47 0.29±0.03 0.46±0.03 0.70±0.03
高剂量破损皮肤组 90 14 0.40±0.05 3.79±0.68 0.31±0.02 0.44±0.06 0.67±0.05
104 8 0.41±0.03 3.93±0.14 0.32±0.07 0.47±0.02 0.69±0.08
低剂量完整皮肤组 90 14 0.39±0.06 3.89±0.73 0.27±0.05 0.43±0.07 0.66±0.04
104 8 0.40±0.08 3.94±0.25 0.28±0.04 0.45±0.04 0.71±0.08
低剂量破损皮肤组 90 14 0.42±0.09 3.64±0.37 0.29±0.08 0.40±0.05 0.68±0.03
104 8 0.43±0.04 3.82±0.42 0.30±0.03 0.42±0.03 0.69±0.07
空白对照组 90 14 0.38±0.05 3.81±0.21 0.28±0.04 0.39±0.04 0.64±0.02
104 8 0.39±0.03 3.88±0.48 0.29±0.05 0.41±0.06 0.66±0.06
4 讨论
慢性湿疹是一种难治性 、慢性 、炎症性皮肤病 ,
该病局部治疗仍以外用糖皮质激素为主 。由于病程
长 ,反复发作 ,皮疹常泛发 ,长期使用糖皮质激素所
致的不良反应备受人们的关注 。经研究证实 ,蜀羊
泉凝胶的主要活性成分是鞣酸 、甾类生物碱糖苷和
甾类皂苷 ,甾类化合物具有消炎 、抗变态反应 、免疫
抑制作用和抗胆碱能作用(可的松样拟交感神经作
用);局部具有收敛(局部止痒作用)、抗微生物(真
菌)作用 ,能有效地治疗慢性湿疹 ,且副作用少 ,突
出的优点是无局部应用糖皮质激素所致的不良反
应。
为能安全地在临床上使用 ,本研究观察和测定
了蜀羊泉凝胶长期连续经皮肤给药对实验动物大鼠
的长期毒性 。用蜀羊泉凝胶以高(1.0 ml/只)、低
(0.5ml/只)两组剂量 ,分别给予大鼠完整皮肤及破
损皮肤 ,每天 1次 ,连续 90d(每周停药 1 d)。在给
药期及恢复期(停药 2周)内大白鼠的一般状况良
好 ,体重增加 ,主要血液学指标 、生化学指标 、尿液分
析指标等均属正常范围 ,与空白对照组比较无统计
学差异;解剖主要脏器未见肉眼可见的病理性改变 ,
病理报告未见病理性的异常病变 ,表明蜀羊泉凝胶
长期连续经皮肤给药对试验大鼠没有毒性反应 。蜀
羊泉凝胶的临床制剂浓度为 2.4 g/100ml,疗程为 1
个月 ,依据长期毒性的试验时间应为临床疗程的 2
～ 3倍的原则 〔3〕 ,最长为 3个月 ,确定本次长期毒性
的连续给药时间为 90d。本研究表明 ,蜀羊泉凝胶
在临床剂量下使用是安全的 ,而且可由此初步推断
适当延长治疗时间或适当加大给药量亦不会影响其
安全性 。
·1284· JournalofChineseMedicinalMaterials 第 30卷第 10期 2007年 10月
参 考 文 献
[ 1] 曲彩红 , 席云 ,苏向阳 , 等.蜀羊泉凝胶剂的制备及质量
控制 .中药材 , 2005, 28(7):605.
[ 2] 国家食品药品监督管理局 .药物研究技术指导原则 .
北京:中国医药科技出版社 , 2005:73.
[ 3] 中华人民共和国卫生部药政管理局 .中药新药研究指
南.1994:205.
(2007-05-28收稿)
白花蛇舌草对肝癌细胞 SMMC-7721基因表达的影响
王顺启 1, 2 ,陈 力2 ,倪 虹 2 ,谢明勇 1＊
(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室 ,江西南昌 330047;2.南开大学生命科学学院 ,天津 300071)
摘要 目的:检测白花蛇舌草对肝癌细胞 SMMC-7721细胞生长及肝癌相关基因表达的影响。 方法:利用 MTT
比色法检测白花蛇舌草对肝癌细胞 SMMC-7721细胞增殖方面的影响;利用以肝癌 cDNA抑制性消减文库构建的肝
癌相关基因微阵列 ,检测白花蛇舌草作用肝癌细胞 SMMC-7721 36 h后基因的表达变化。结果:白花蛇舌草作用肝
癌细胞 SMMC-7721后 36h,观察到有 1个基因的表达上调 , 14个基因表达下调。 结论:证实白花蛇舌草对肝癌细
胞的作用是通过影响多基因的表达改变实现的。本研究发现的差异表达基因为进一步研究白花蛇舌草抗肝癌的
分子机制提供了线索 ,并为中草药筛选提供了一种可能的依据方法。
关键词 白花蛇舌草;肝癌细胞 SMMC-7721;MTT比色法;微阵列;基因表达
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2007)10-1285-05
基金项目:中国博士后科学基金(资助号:20060390967);江西省教育厅科学技术研究项目(资助号:2007047);长江学者和创新团队发展计划(批准号:IRT0540)＊通讯作者:谢明勇 , Tel:0791-3969009, E-mail:myxie@ncu.edu.cn。
白花蛇舌草(HedyotisdifusaWild,又名 Olden-
diadifusaWildRoxb.)系茜草科(Rubiaceae)植物 ,
主产于我国长江以南福建 、广东 、广西 、江西 、浙江等
省〔1、2〕 ,为民间常用中草药 ,具有清热解毒 、利尿消
肿 、活血止痛等功效 。内服对于恶性肿瘤 、喉炎 、扁
桃体炎 、支气管炎 、肠胃溃疡 、肝炎 、阑尾炎 、泌尿系
统感染 、结肠炎等有治疗作用 ,外用可治疗毒蛇咬
伤 、疮痈肿毒等症 〔3 ～ 7〕。
现代药理学研究证明 ,白花蛇舌草具有增强免
疫 、抗化学诱变 、抗肿瘤 、抗菌 、保肝利胆 、镇静等作
用。在临床上可用于治疗各种癌症 ,尤其是胃癌 、直
肠癌 、恶性淋巴瘤 、肺癌 、乳腺癌 、子宫颈癌 、卵巢癌 、
膀胱癌 、大肠癌等多种消化系统癌症和淋巴系统肿
瘤〔3 ～ 9〕。
本研究利用 MTT比色法检测白花蛇舌草对肝
癌细胞 SMMC-7721细胞增殖方面的影响;利用前期
构建的肝癌相关基因微阵列 ,对白花蛇舌草作用于
肝癌细胞 SMMC-7721后基因表达变化进行了检测。
1 材料与方法
1.1 药材 白花蛇舌草 OldendiadifusaWild
Roxb.由吉林省通化振国药业有限公司提供 。
1.2 细胞及其培养 肝癌细胞系 SMMC-7721由
天津市第三中心医院朱争艳医师惠赠 。小鼠成纤维
细胞 NIH-3T3由南开大学分子生物学研究所陈家
童老师惠赠 。细胞培养用 DMEM培养基(购自美国
Gibco公司),含 10%胎牛血清 (购自天津 TBD公
司), 100 mg/L链霉素 (购自美国 HyClone公司),
1.0×105 U/L青霉素(购自美国 HyClone公司);于
37℃、5%CO2、湿润空气中进行细胞培养 。
细胞以 5 ～ 6×105个 /ml密度接种于 75cm2的
细胞培养瓶(购自挪威 NUNC公司),每瓶 27 ml细
胞悬液 ,预培养 12 h后 ,对照组细胞每瓶加入 3.0
ml灭菌双蒸水 ,加药组细胞每瓶加入 3.0ml不同的
药物。再培养 36 h后 ,提取各组细胞的 RNA。
1.3 噻唑氮蓝 (MTT)比色法 参考文献 〔10〕的
MTT方法略有改动。细胞密度为 2 ～ 3×104个 /ml;
96孔板内设置加药组 、对照组 、调零组 ,每组 3孔 。
实验开始时 ,加药组与相应对照组细胞同时加入 96
孔板 ,调零组加入相应体积的培养液 。
加药组:每孔 100μl细胞悬液 ,预培养 12h后 ,
加入 11.1 μl不同的药物。对照组:每孔 100 μl细
胞悬液 ,预培养 12 h后 ,加入 11.1 μl灭菌双蒸水 。
·1285·JournalofChineseMedicinalMaterials 第 30卷第 10期 2007年 10月