全 文 ：291※生物工程 食品科学 2008, Vol. 29, No. 07
墨汁鬼伞液体发酵营养因子对菌丝体生长
和胞外多糖产量影响的研究
毕华南，丁重阳，石贵阳*，章克昌
(江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122)
摘 要：本研究实现了墨汁鬼伞[Coprinus atramentarius(Bull.F .)Fr.]的液体培养，通过单因素试验研究了不同碳
源、氮源及无机盐对墨汁鬼伞菌丝体生长和胞外多糖产量的影响。在此基础上，通过响应曲面法(RSM)研究了各
营养因子的最佳水平，得到当葡萄糖、玉米粉、麸皮、KH2PO4和MgSO4·7H2O分别为13.51、17.07、7.62、
2.29和2g/L时，胞外多糖最大预测值为293.73mg/L；当上述变量为10.07、18.02、11.63、1.58和4g/L时，菌丝
体最大生长量为6.24g/L。
关键词：墨汁鬼伞；液体发酵；胞外多糖；生物量；响应曲面法
Study on Effects of Nutritional Factors for Liquid Fermentation of Coprinus atramentarius
on Mycelium Growth and Yield of Extracellular Polysaccharide
BI Hua-nan，DING Zhong-yang，SHI Gui-yang*，ZHANG Ke-chang
(School of Biotechnology, Jiangnan University, Key Laboratory of Industrial Biotechnology,
Ministry of Education, Wuxi 214122, China)
Abstract ：Coprinus atramentarius w s cult vated with submerged fermentation method. Various nutritional factors including
carbon sources, nitrogen sources and inorganic salt affecting the yield of extracellular polysaccharide (EPS) and mycelium growth
were studied by single factor test. The key influential factors were further investigated by response surface methodology. By
solving the quadratic regression model equation with appropriate statistic methods, the optimum concentrations for the sub-
merged fermentation medium are determined that glucose, corn powder, wheat bran, KH2PO4 and M SO4·7H2O are 13.51，
17.07, 7.62, 2.29 and 2 g/L, respectively, and the predicted yield of the extracellular polysaccharide is 293.73 mg/L. When the
above values are 10.07, 18.02, 11.63, 1.58 and 4 g/L respectively, the maximum biomass is 6.24 g/L.
Key words：Coprinus atramentarius；liquid fermentation；extr cellular polysaccharide；biomass；re ponse surface
methodology
中图分类号： TQ929.2 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2008)07-0291-06
收稿日期：2007-09-18
作者简介：毕华南(1982-)，男，硕士研究生，研究方向为发酵工程。E-mail：bhnchn@yahoo.com.cn
*通讯作者：石贵阳(1963-)，男，教授，研究方向为发酵工程。E-mail：gyshi@sytu.edu.cn
药食用真菌是天然药物中的一个重要组成部分，其
化学成分种类丰富，药理作用显著，已成为探索和发
掘新药的重要领域，日益受到人们的重视[1]。墨汁鬼伞
又名柳树蘑、柳树钻，是鬼伞属真菌中具有代表性的
一种[2]。墨汁鬼伞在食用时或食用后的2～3d之内饮用
酒精饮料即可引起脸部红肿[3]，心率上升，头晕、恶
心、呕吐，并出现呼吸困难等现象，其毒性成分为鬼
伞素，首先由美国人Hatfield等于1936年分离得到[4]。
虽然墨汁鬼伞作为食用菌存在一定的局限性，但是
对其进行深入研究进而探询其中可能存在的生物活性物
质仍然非常有意义。在民间，人们常用它的子实体煮
熟后烘干研成细末与醋调成糊状治疗外伤和无名肿毒；
而民间的验方中，它也用来治疗中、晚期癌症。而亦
有报导认为，墨汁鬼伞具有降糖降脂功能，入药有益
肠胃、理气化痰、解毒消肿的作用[2,5]。目前对墨汁鬼
伞研究主要在其生物学特性以及固体栽培方面[2]，但是
固体栽培存在着生物周期长，由于培养基的不均一性而
导致其生理活性的波动等缺点；从子实体中获取有效成
份也需要更为复杂的提取步骤[6]。同传统的固体栽培相
比，液体发酵周期短，易规模化特点则更凸显。目前，
2008, Vol. 29, No. 07 食品科学 ※生物工程292
表1 碳源因素水平表(g/L)
Table 1 Factors and levels of various carbon sources (g/L)
水平 A葡萄糖 B果糖 C蔗糖 D玉米粉 E可溶性淀粉
1 5 5 4.5 7.5 4
2 10 10 9 15 8
3 15 15 13.5 22.5 12
表2 氮源因素水平表(g/L)
Table 2 Factors and levels of various nitrogen sources (g/L)
A B C D E
水平
麸皮 豆饼粉 酵母粉 (NH4)2SO4 NH4H2PO4
1 5 1.5 1 0.5 1
2 10 3 2 1 2
3 15 4.5 3 1.5 3
A B C D E
水平
KH2PO4 MgSO4·7H2O CaCl2 FeSO4 NaCl
1 2 2 2 2 2
2 4 4 4 4 4
表3 无机盐因素水平表(g/L)
Table 3 Factors and levels of various inorganic matters (g/L)
国内外尚无关于墨汁鬼伞液体发酵的研究报道。
真菌多糖大都具有复杂的、多方面生物活性，对
肿瘤、心血管疾病有一定疗效[7]。随着香菇多糖、灵
芝多糖、云芝多糖等真菌多糖在临床上的广泛应用，人
们对真菌多糖的研究日益重视[7-9]。
本实验以墨汁鬼伞生物量和胞外多糖为指标，采用
液体发酵培养方法，首先通过较为广泛的单因素试验寻
求影响墨汁鬼伞液体发酵的培养基关键因子，进而通过
响应曲面法对培养基进行进一步优化，以提高墨汁鬼伞
液体发酵胞外多糖产量和生物量，以利于下一步开展墨
汁鬼伞生物活性物质研究。
1 材料与方法
1.1菌种
购自陕西省微生物研究所，由本研究室复壮保藏。
1.2培养基
斜面培养基：PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)斜面固体培养基。
种子培养基：PDA培养基不加琼脂粉，装液量为
75ml/250ml摇瓶。
发酵基础培养基(g/L)：葡萄糖10、玉米粉15、麸
皮10、KH2PO4 2、MgSO4·7H2O 3。
1.3培养方法
菌种活化：菌种接入斜面培养基，25℃恒温通风
培养7d。
种子培养：取3～4块约0.5cm2大小的活化菌种，
接入250ml三角瓶中，于28℃、150r/min摇床培养5d。
液体培养：将成熟种子按10%接种量转接入500ml
三角瓶中，于25℃、150r/min摇床培养4d。
1.4检测方法
生物量测定：以测定核酸的方法进行生物量测定
[10]；还原糖测定：采用3,5-二硝基水杨酸法[11]；胞外粗
多糖测定：采用酒精分步沉淀法提取胞外粗多糖[12]，称
干重。
1.5试验设计
1.5.1单因素优化试验
保持含碳量相同条件下分别用葡萄糖、果糖、蔗
糖、玉米粉、可溶性淀粉代替基础培养基中的葡萄糖
和玉米粉，每个因素选取三个不同水平，添加量见表
1；保持含氮量相同条件下分别用麸皮、豆饼粉、酵母
粉、(NH4)2SO4、NH4H2PO4代替基础培养基中的麸皮，
每个因素选取三个不同水平，添加量见表2；分别用
KH2PO4、MgSO4、CaCl2、FeSO4、NaCl代替基础培
养基中的KH2PO4、MgSO4·7H2O，每个因素选取两
个不同水平，添加量见表3。测定各因素不同水平下的
墨汁鬼伞生物量(biomass)和胞外粗多糖(extracellular
polysaccharide，EPS)含量。
1.5.2响应面优化试验设计
研究采取响应曲面法(RSM)，根据单因素试验结
果，通过全因子中心组合设计[13](full-factorial central com-
posite design)，以葡萄糖、玉米粉、麸皮、磷酸二
氢钾为考察因子(自变量)，其实际浓度水平分别以X1、
X2、X3和X4代表，其编码水平分别以A、B、C、D
代表，各自变量的实验水平及其编码范围见表4(其中α
=2.0)。评价指标(响应值)为墨汁鬼伞发酵液生物量和胞
外多糖含量，其预测模型通过最小二乘法拟合的二次多
项方程为：
Y=co +Σaixi +Σbijxixj (1)
式中，Y为预测响应值；Xi和Xj为自变量编码值；
C0为常数项；ai为线性系数；bij为二次项系数；n为因
子数，本实验n = 4。
本实验借助Design Expert软件(version 6.0.5，Stat-
Ease Inc.，Minneapolis，MN. USA)进行CCD设计。
2 结果与分析
变量
代码 编码水平
未编码 编码 －α －1 0 1 α
葡萄糖(g/L) X1 A 2 6 10 14 18
玉米粉(g/L) X2 B 5 10 15 20 25
麸皮(g/L) X3 C 5 7.5 10 12.515
磷酸二氢钾(g/L)X4 D 1 1.5 2.0 2.53.0
表4 中心组合试验因素水平及编码
Table 4 Levels and codes of variables chosen for full-factorial
CCD
注：自变量编码值与真实值之间的关系分别为：A= (X1－10)/4，B= (X2
－15)/5，C= (X3－10)/2.5，D= (X4－2)/0.5。
i=1
n
j≤i
n
293※生物工程 食品科学 2008, Vol. 29, No. 07
图1 不同碳源对墨汁鬼伞生物量的影响
Fig.1 Effects of various carbon sources on growth of
C. atramentarius
5
4
3
2
1
0
水平1
水平2
菌
体
量
(
g
/
L
)
K
H2P
O4
M
g
S
O
4
·
7
H2O
C
a
C
l
2
F
e
S
O
4
N
a
C
l
图2 不同碳源对墨汁鬼伞胞外多糖产量的影响
Fig.2 Effects of various carbon sources on yield of EPS in
C. atramentarius broth
250
200
150
100
50
0
葡萄糖 果糖 蔗糖 玉米粉 可溶性淀粉
水平1
水平2
水平3
胞
外
多
糖
产
量
(
m
g
/
L
)
250
200
150
100
50
0
水平1
水平2
水平3
胞
外
多
糖
产
量
(
m
g
/
L
)
麸
皮
豆
奶
粉
酵
母
粉
(
N
H
4)
2S
O4
N
H4H
2
P
O4
图4 不同氮源对墨汁鬼伞胞外多糖产量的影响
Fig.4 Effects of various nitrogen sources on yield of EPS in
C. atramentarius broth
图3 不同氮源对墨汁鬼伞生物量的影响
Fig.3 Effects of various nitrogen sources on growth of
C. atramentarius
5
4
3
2
1
0
水平1
水平2
水平3
菌
体
量
(
g
/
L
)
麸
皮
豆
奶
粉
酵
母
粉
(
N
H
4)
2S
O4
N
H4H
2
P
O4
2.1培养基选择
2.1.1碳源选择
如图1、2所示，葡萄糖和玉米粉是墨汁鬼伞液体
发酵的理想碳源。而且相对而言，单糖更适宜于墨汁
鬼伞的液体发酵培养，这与蔗糖是墨汁鬼伞固体栽培的
理想碳源存在差异。由于葡萄糖和玉米粉均可作为墨汁
鬼伞液体培养的单一碳源，综合考虑促进菌丝体生长的
因素，将二者同时用于其液体发酵培养基。
糖分泌均有较大影响。相反，Fe2+、Na+和Cl-对于墨
汁鬼伞生长存在负作用。因此，在液体发酵培养中，
有必要在培养基中添加磷、钾、钙等无机盐离子。
2.2液体发酵培养基优化
2.2.1模型建立
2.1.2氮源选择
各氮源不同水平下的墨汁鬼伞生物量和胞外粗多糖
含量，如图3、4所示，墨汁鬼伞对无机氮源利用较
差，但能很好的利用有机氮源。在有机氮源中，麸皮
和酵母粉是墨汁鬼伞液体发酵的适宜氮源，综合考虑培
养基成本和取材便捷，本实验选取麸皮为墨汁鬼伞培养
基的氮源。
2.1.3无机盐选择
各因素不同水平下的墨汁鬼伞生物量和胞外粗多糖
含量见图5、6。可以看出，KH2PO4和MgSO4·7H2O
是墨汁鬼伞液体发酵培养的主要生长因子，而且
KH2PO4添加量的不同对于墨汁鬼伞菌丝体生长和胞外多
图5 添加不同无机盐对墨汁鬼伞生物量的影响
Fig.5 Effects of various inorganic salts on growth of
C. atramentarius
5
4
3
2
1
0
水平1
水平2
菌
体
量
(
g
/
L
)
K
H2P
O4
M
g
S
O
4
·
7
H2O
C
a
C
l
2
F
e
S
O
4
N
a
C
l
2008, Vol. 29, No. 07 食品科学 ※生物工程294
图6 添加不同无机盐对墨汁鬼伞胞外多糖产量的影响
Fig.6 Effects of various inorganic salts on yield of EPS in
C. atramentarius broth
250
200
150
100
50
0
水平1
水平2
胞
外
多
糖
产
量
(
m
g
/
L
)
响应面试验设计及考察指标见表5(表中实验值为2
次重复平均值)。
利用上述设计软件，对表5实验数据进行二次多项
回归拟合，分别获得了胞外多糖预测值和生物量预测值
对葡萄糖(A)、玉米粉(B)、麸皮(C)和KH2PO4(D)的多元
回归方程(1)和方程(2) ：
Y胞外多糖产量=279.83+25.44A+21.42B+4.65C－1.93D－24.66A2
－21.63B2－20.51C2-13.93D2+19.41AB－ 2.54AC +
2.32AD－11.92BC－17.82BD－ 7.31CD (1)
Y生物量=5.98+0.48A+0.40B+0.062C+0.0069D－0.52A2－0.45B2
－0.46C2－0.29D2+0.44AB－0.24AC－0.17BC－0.39BD－
0.59CD (2)
对模型方程(1)和方程(2)方差分析结果表明，两方
程差异性显著(p＜0.0001)，而且各因子系数均有意义，
拟合优度良好。方程(1)相关系数R=0.9863，校正决定
系数R2Adj=0.9728；方程(2)的R=0.9837，R2Adj=0.9676。
2.2.2以胞外多糖产量为指标的发酵培养基优化与分析
根据模型方程(1)所作的响应曲面图及等高线图见图
7～9。通过该组动态图可评价试验因素对墨汁鬼伞胞外
多糖的两两交互作用，并确定各因素的最佳水平范围。
等高线的形状可反映出交互效应的强弱大小，椭圆
形表示两因子交互作用显著，反之则与之相反。图7显
表5 全因子中心组合设计以及C.atramentarius生物量的实测值和预测值
Table 5 CCD matrix of four variables with experimental and predicted values of biomass and EPS
组别
编码 生物量(g/L) 胞外多糖产量(mg/L)
A B C D 实测值 预测值 实测值 预测值
1 －1 －1 －1 －1 2.23 2.33 98.47 101.67
2 1 －1 －1 －1 2.79 2.96 130.72 134.16
3 －1 1 －1 －1 3.18 3.36 160.88 165.16
4 1 1 －1 －1 6.05 5.74 283.36 275.31
5 －1 －1 1 －1 4.75 4.46 222.21 214.50
6 1 －1 1 －1 4.09 4.11 191.21 196.85
7 －1 1 1 －1 5.08 4.82 237.78 230.31
8 1 1 1 －1 5.94 6.23 289.90 290.31
9 －1 －1 －1 1 4.37 4.35 168.47 183.44
10 1 －1 －1 1 4.81 4.89 225.30 225.19
11 －1 1 －1 1 4.04 3.83 188.85 175.64
12 1 1 －1 1 5.56 6.12 271.98 295.05
13 －1 －1 1 1 3.99 4.11 186.58 187.05
14 1 －1 1 1 3.58 3.67 167.56 178.66
15 －1 1 1 1 2.81 2.92 119.63 131.56
16 1 1 1 1 4.52 4.24 211.61 200.83
17 －α 0 0 0 2.77 2.94 129.64 130.31
18 α 0 0 0 5.14 4.88 240.52 232.06
19 0 －α 0 0 3.46 3.37 162.08 150.47
20 0 α 0 0 4.96 4.97 232.32 236.14
21 0 0 －α 0 4.24 4.01 198.40 188.50
22 0 0 α 0 4.12 4.26 205.00 207.11
23 0 0 0 －α 4.72 4.81 220.96 227.99
24 0 0 0 α 5.02 4.84 235.10 220.27
25 0 0 0 0 5.73 5.98 268.18 279.83
26 0 0 0 0 6.12 5.98 286.42 279.83
27 0 0 0 0 5.91 5.98 276.79 279.83
28 0 0 0 0 6.20 5.98 289.97 279.83
29 0 0 0 0 5.89 5.98 275.78 279.83
30 0 0 0 0 6.02 5.98 281.86 279.83
K
H2P
O4
M
g
S
O
4
·
7
H2O
C
a
C
l
2
F
e
S
O
4
N
a
C
l
295※生物工程 食品科学 2008, Vol. 29, No. 07
300.68
260.87
221.05
181.23
141.42
20.00
17.50
12.50
15.00
10.006.00
8.00
10.00
12.00
14.00
A：
葡萄
糖
胞
外
多
糖
产
量
(
m
g
/
L
)
B：玉米粉
图7 葡萄糖和玉米粉交互影响EPS的曲面图及等高线图
Fig.7 Response surface and contour plots of EPS versus glucose
and corn powder
300.68
260.87
221.05
181.23
141.42
20.00
17.50
12.50
15.00
10.00 B
：玉
米粉
胞
外
多
糖
产
量
(
m
g
/
L
)
D：K
H2P
O4
2.50
2.25
1.75
2.00
1.50
图8 玉米粉和KH2PO4交互影响EPS的曲面图及等高线图
Fig.8 Response surface and contour plots of EPS versus corn
powder and KH2PO4
300.68
260.87
221.05
181.23
141.42
12.50
11.25
8.75
10.00
7.50 C
：麸
皮
胞
外
多
糖
产
量
(
m
g
/
L
)
D：K
H2P
O4
2.50
2.25
1.75
2.00
1.50
图9 麸皮和KH2PO4交互影响EPS的曲面图及等高线图
Fig.9 Response surface and contour plots of EPS versus wheat
bran and KH2PO4
图10 葡萄糖和玉米粉交互影响生物量的曲面图及等高线图
Fig.10 Response surface and contour plots of biomass versus
glucose and corn powder
6.53
5.75
4.97
4.19
3.41
20.00
17.50
12.50
15.00
10.006.00
8.00
10.00
12.00
14.00
A：
葡萄
糖
生
物
量
(
g
/
L
)
B：玉米粉
示了当麸皮和KH2PO4处于最佳值，即11.63g/L和1.58g/L
时，葡萄糖和玉米粉对墨汁鬼伞EPS的交互影响效应。
可知，它们的交互作用显著。当玉米粉处于低水平时，
葡萄糖浓度改变对EPS影响很小，且处于较低水平。这
可能是由于墨汁鬼伞作为一种丝状真菌，其菌丝体在液
体发酵过程中通常需要玉米粉等固形物作为附着物，从而
有利于菌丝体的生长并形成菌球。因此，当玉米粉浓度
较低时影响了菌体生长，进而影响了胞外多糖的分泌。
图8显示了当葡萄糖和麸皮处于最佳值，即10.07g/L
和11.63g/L时，玉米粉和KH2PO4对墨汁鬼伞EPS的交
互影响效应。可知，它们的交互作用显著。当玉米粉
处于低浓度时，KH2PO4浓度变化对EPS影响不明显，
而当玉米粉处于高浓度时，EPS随着KH2PO4浓度增加
而减小。
图9显示了当葡萄糖和玉米粉处于最佳值，即10.07g/L
和18.02g/L时，麸皮和KH2PO4对墨汁鬼伞EPS的交互影响
效应。可知，它们存在交互影响作用。当麸皮处于高
水平时，EPS随着KH2PO4浓度增加而减小，这再次表
明虽然KH2PO4是墨汁鬼伞生长的重要影响因子，但高
浓度KH2PO4对胞外多糖分泌有抑制作用。
2.2.3以生物量为指标的发酵培养基优化与分析
根据模型方程(2)所作的响应曲面图及等高线图见图
10～12。通过该组动态图可评价实验因子对墨汁鬼伞生
物量的两两交互作用，并确定各因素的最佳水平范围。
图10显示了当麸皮和KH2PO4处于最佳值，即18.61g/
L和1.60g/L时，葡萄糖和玉米粉对生物量的交互影响效应。
可知，它们的交互作用显著。当玉米粉处于低水平时，葡
萄糖浓度改变对 EPS影响很小，且处于较低水平，这
可能与玉米粉浓度对EPS的影响类似。
图11显示了当葡萄糖和麸皮处于最佳值，即11.79g/L
和11.51g/L时，玉米粉和KH2PO4对生物量的交互影响
效应。可知，它们的交互作用显著。当K H2P O4处于
低水平时，玉米粉浓度的增加对墨汁鬼伞生物量的提高
作用显著。
2008, Vol. 29, No. 07 食品科学 ※生物工程296
图12显示了当葡萄糖和玉米粉处于最佳值，即
10.07g/L和18.02g/L时，麸皮和KH2PO4对生物量的交互
影响效用。可知，它们的交互影响作用显著。生物量
随着麸皮水平升高呈现先增加后降低的趋势，较高浓度
的麸皮同样对于墨汁鬼伞菌体形成十分重要，但作为一
种氮源，当麸皮浓度过高时，适宜菌丝体生长的培养
基C/N比发生改变，使得生物量不能继续提高。
6.53
5.75
4.97
4.19
3.41
2.50
2.25
1.75
2.00
1.507.50
8.75
10.00
11.25
12.50
C：
麸皮
生
物
量
(
g
/
L
)
D：K
H2P
O4
图12 麸皮和KH2PO4交互影响生物量的曲面图及等高线图
Fig.12 Response surface and contour plots of biomass versus
wheat and corn powder
6.53
5.75
4.97
4.19
3.41
2.50
2.25
1.75
2.00
1.5010.0
12.50
15.00
17.50
20.00
B：
玉米
粉
生
物
量
(
g
/
L
)
D：K
H2P
O4
图11 玉米粉和KH2PO4交互影响生物量的曲面图及等高线图
Fig.11 Response surface and contour plots of biomass versus corn
powder and KH2PO4
和玉米粉是墨汁鬼伞的适宜碳源，麸皮是其适宜氮源，
KH2PO4和MgSO4·7H2O能够提供液体发酵所必需的无
机离子。在以上重要营养因子中，葡萄糖、玉米粉、
麸皮、KH2PO4的添加量改变对生物量和EPS影响较大。
进一步通过响应曲面法对以上关键营养因子对生物
量和EPS的影响及交互作用进行研究，获得以胞外多糖
为目的产物的最优培养基组成为：葡萄糖13.51g/L、玉
米粉17.07g/L、麸皮7.62g/L、KH2PO4 2.29g/L和MgSO4·
7H2O 2g/L。在此条件下，胞外多糖产量达到最大值293.73
mg/L。以生物量为指标的墨汁鬼伞最优液体发酵培养基
为：葡萄糖10.07g/L、玉米粉18.02g/L、麸皮11.63g/L、
KH2PO4 1.58g/L和MgSO4·7H2O4g/L。此时生物量达到
最大值6.24g/L。
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3 结 论
本实验以墨汁鬼伞为研究对象，在现有固体栽培技
术研究基础上，通过深层发酵成功实现了墨汁鬼伞的液
态培养。
对墨汁鬼伞液体发酵营养因子的研究表明，葡萄糖