全 文 ：·论著·
三叶青提取物对肺癌Ａ５４９细胞中
Ｃａｓｐａｓｅ－３表达的影响
曾 娟　周 婷　童雪晴　刘燕丽　李 遥　王小莉
【摘要】　目的　探讨三叶青提取物对肺癌Ａ５４９细胞半胱天冬氨酸蛋白酶３（Ｃａｓｐａｓｅ－３）表达的
影响。方法　分别用浓度为０．１、０．０１和０．００１ｇ／Ｌ的三叶青提取物（Ｄ１、Ｄ２和Ｄ３组）和生理盐水
（对照组）处理体外培养的肺癌Ａ５４９细胞４８ｈ后，采用 Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测各组细胞中Ｃａｓｐａｓｅ－３
的表达。结果　Ｄ１、Ｄ２和Ｄ３组Ｃａｓｐａｓｅ－３的表达均高于Ｃ组（Ｐ＜０．０５），并且呈浓度依赖性。结论
三叶青提取物可通过激活Ｃａｓｐａｓｅ－３诱导人肺癌Ａ５４９细胞凋亡，并且呈剂量依赖性。
【关键词】　　三叶青提取物；Ａ５４９细胞；半胱天冬氨酸蛋白酶３
【中图分类号】　Ｒ２８５　　【文献标识码】　Ａ　　【文章编号】　０２５３－３６８５（２０１３）２０－２４０１－０２
Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｃｌｏｖｅｒ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｎ　Ｃａｓｐａｓｅ－３ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ａ５４９ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｓ　ＺＥＮＧ　Ｊｕａｎ，ＺＨＯＵ
Ｔｉｎｇ，ＴＯＮＧ　Ｘｕｅｑｉｎｇ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｅｇｅ，Ｊｉｓｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｓｈｏｕ４１６０００，ＣＨＩＮＡ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｃｌｏｖｅｒ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ａｓｐａｒｔｉｃ
ａｃｉｄ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　３（Ｃａｓｐａｓｅ－３）ｉｎ　Ａ５４９ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａ５４９ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｓ
ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｗｅｒｅ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｆｏｕｒ　ｇｒｏｕｐｓ　ａｎｄ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｃｌｏｖｅｒ
ｅｘｔｒａｃｔ　０．１，０．０１ａｎｄ　０．００１ｇ／Ｌ（ｇｒｏｕｐｓ　ｏｆ　Ｄ１，Ｄ２ａｎｄ　Ｄ３）ｏｒ　ｎｏｒｍａｌ　ｓａｌｉｎｅ（ｇｒｏｕｐ　Ｃ）ｆｏｒ　４８ｈｏｕｒｓ．
Ｔｈｅ　Ａ５４９ｃｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｌｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｌｙｓｅｄ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　Ｃａｓｐａｓｅ－３ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
Ｃａｓｐａｓｅ－３ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ａ５４９ｃｅｌｓ　ｗａｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｃｌｏｖｅｒ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｉｎ　ａ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ｍａｎｎｅｒ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐｓ　ｏｆ　Ｄ１，Ｄ２ａｎｄ　Ｄ３ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　Ｃ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
Ｔｈｅ　Ｃｌｏｖｅｒ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　Ａ５４９ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　Ｃａｓｐａｓｅ－３
ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎ　ａ　ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ．
【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　　Ｃｌｏｖｅｒ　ｅｘｔｒａｃｔ；Ａ５４９ｃｅｌ；Ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ａｓｐａｒｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　３
［Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｍｅｄ　Ｊ，Ｏｃｔｏｂｅｒ　２０１３，３９（２０）：２４０１－２４０２．］
　　基金项目：湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划［湘教通
（２０１０）２２４号］；吉首大学大学生研究性学习和创新性实验计划
（２０１０－３６）
作者单位：４１６０００　湖南省，吉首大学医学院０８级临床医学本
科班（曾 娟、周 婷、童雪晴、刘燕丽、李 遥），病理学与病理生理学教
研室（王小莉）
通讯作者：王小莉　Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｘｉａｏｌｉｆ＠１６３．ｃｏｍ
　　肺癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率和
病死率均较高。近年来研究发现，细胞凋亡在肺癌
的发生发展过程中起重要作用。半胱天冬氨酸蛋白
酶３（Ｃａｓｐａｓｅ－３）是Ｃａｓｐａｓｅ家族的重要成员，其参
与细胞凋亡过程，对多种肿瘤细胞的发生发展具有
重要意义。三叶青又名金丝吊葫芦，来源于葡萄科
崖爬藤属植物，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛
的功效［１］。倪克锋等［２］运用三叶青为主药用于肿瘤
临床，发现在抑制肿瘤生长、延缓患者生命、改善生
命征象方面有独特的效果。本研究采用 Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ法检测三叶青提取物对肺癌 Ａ５４９细胞中
Ｃａｓｐａｓｅ－３蛋白表达的影响。
材料与方法
一、材料
人肺癌 Ａ５４９细胞株购于中南大学细胞库中
心。三叶青采自湖南吉首市郊，由我院中药学李春
艳教授鉴定，三叶青提取物自制。ＲＰＭＩ　１６４０培养
基、胎牛血清、羊抗人Ｃａｓｐａｓｅ－３抗体、β－ａｃｔｉｎ抗体、
羊抗鼠辣根过氧化物酶标记的二抗均购于长沙艾杰
生物科技有限公司；Ｂｒａｄｆｏｒｄ蛋白浓度测定试剂盒、
彩色预染蛋白 Ｍａｒｋｅｒ、增强化学发光（ＥＣＬ）显色试
剂盒购于江苏碧云天生物科技研究所；封闭蛋白干
粉购于武汉博士德生物工程有限公司；医用Ｘ射线
光片、Ｘ线胶片显影定影粉购于上海同倍检测科技
有限公司。
二、方法
１．细胞培养及分组　人肺癌 Ａ５４９细胞用含
１０％胎牛血清的 ＲＰＭＩ　１６４０培养基在３７℃、饱和
·１０４２·江苏医药２０１３年１０月第３９卷第２０期　Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｍｅｄ　Ｊ，Ｏｃｔｏｂｅｒ　２０１３，Ｖｏｌ　３９，Ｎｏ．２０
湿度的培养箱内传代培养，０．２５％胰酶消化传代，每
３－４天传代１次。实验均采用对数生长期细胞。分
别用浓度为０．１、０．０１和０．００１ｇ／Ｌ的三叶青提取
物（Ｄ１、Ｄ２和Ｄ３组）和生理盐水（对照组）处理体外
培养的肺癌Ａ５４９细胞４８ｈ。
２．Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测 Ｃａｓｐａｓｅ－３蛋白表达　
将对照组和各浓度三叶青提取物作用４８ｈ后的
细胞用蛋白裂解液｛７ｍｏｌ／Ｌ尿素、２ｍｏｌ／Ｌ硫脲、
６０ｍｍｏｌ／Ｌ二硫苏糖醇、４％的３－［３－（胆酰胺丙基）
二甲氨基］丙磺酸内盐、２％两性电解质ｐＨ值３－１０、
１．４ｍｇ／ｍｌ苯甲基磺酰氟｝在冰上裂解４０ｍｉｎ后，
１２００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，取上清液，采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ
法进行蛋白定量，将所有蛋白样品调至等浓度，充分
混合，加载样缓冲液后直接上样。将蛋白样品在
１５％的十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶中电泳
约３ｈ，然后转印至硝酸聚偏二氟乙烯膜上９０ｍｉｎ。
用５％脱脂奶粉封闭１ｈ后，按预染 Ｍａｒｋｅｒ标记的
分子量剪裁转印膜，分别加入 Ｃａｓｐａｓｅ－３ 抗体
（１∶１０００）及β－ａｃｔｉｎ抗体（１∶１０００），过夜。洗膜缓
冲液洗４次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗
（１∶８００）作用３０ｍｉｎ，ＥＣＬ法显色，ＧＩＳ凝胶图像
分析系统拍照并分析处理。
三、统计学处理
采用ＳＰＳＳ　１３．０软件进行统计学分析。计量数
据用均数±标准差（珚ｘ±ｓ）表示，多组间比较采用方
差分析；Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
结 果
Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测结果显示，Ｄ１、Ｄ２和 Ｄ３组
Ｃａｓｐａｓｅ－３蛋白的表达水平均高于对照组（Ｐ＜０．０５），
并且呈浓度依赖性（图１）。
讨 论
目前对肿瘤细胞凋亡机制已有比较清晰的认
识，涉及死亡受体信号通路、线粒体信号通路等，其
中属于死亡受体信号通路的Ｃａｓｐａｓｅ家族对凋亡的
调控起着重要作用。Ｃａｓｐａｓｅ－３是Ｃａｓｐａｓｅ家族中
最重 要 的 凋 亡 执 行 者［３］，Ｃａｓｐａｓｅ－３ 属 于 效 应
Ｃａｓｐａｓｅ，被认为是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白
酶，激活的Ｃａｓｐａｓｅ－３能使许多与细胞结构、细胞周
期及ＤＮＡ修复等有关的蛋白或激酶失活，从而使
细胞凋亡［４］。程伟等［５］发现，三叶青提取物对Ａ５４９
细胞具有明显的体外抑制作用，其抑制作用与药物
与对照组比较，ａＰ＜０．０５
图１　各组处理４８ｈ后细胞内Ｃａｓｐａｓｅ－３蛋白表达量
的浓度和作用时间呈正相关。贾明旺等［６］在研究
Ｃａｓｐａｓｅ－３与肺炎链球菌引起的肺泡上皮细胞凋亡
的关系时发现，Ｃａｓｐａｓｅ－３在肺炎链球菌诱导的肺泡
上皮细胞凋亡过程中起重要作用。本研究观察了
Ｃａｓｐａｓｅ－３蛋白在经三叶青提取物处理后在肺癌
Ａ５４９细胞中的表达情况，结果显示，不同浓度三叶
青提取物作用后，Ｃａｓｐａｓｅ－３蛋白表达明显增加，且
呈浓度依赖性，提示三叶青提取物诱导 Ａ５４９细胞
凋亡可能与其调节 Ｃａｓｐａｓｅ－３蛋白的表达水平有
关。本研究为三叶青的进一步开发及其临床治疗提
供了一些理论参考依据，但合理的用药还需要进一
步研究。
参 考 文 献
［１］　中国医学科学院药物研究所．中药志［Ｍ］．北京：人民卫生出版
社，１９８４：２１９．
［２］　倪克锋，丁志山，黄挺，等．三叶青黄酮对 Ｈ－２２荷瘤小鼠瘤体
的抑制作用及其机理研究［Ｊ］．浙江中医药大学学报，２００８，３２
（６）：７３２－７３４．
［３］　何卫红，徐八一，徐志霞，等．Ｃａｓｐａｓｅ－３和Ｃａｓｐａｓｅ－８在氟化钠
致人神经母细胞瘤ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞凋亡中的作用［Ｊ］．环境与
健康杂志，２００８，２５（５）：３８１－３８４．
［４］　Ｚｈｕ　ＸＦ，Ｌｉｕ　ＺＣ，Ｘｉｅ　ＢＦ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃａｓｐａｓｅ－３ａｃｔｉｖａ－
ｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｑｕａｍｏｃｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅ　ＨＬ－６０
［Ｊ］．Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ，２００２，７０（１１）：１２５９－１２６９．
［５］　程伟，陆曙梅．三叶青提取物对肺癌 Ａ５４９细胞的体外抑制作
用［Ｊ］．中国实验方剂学杂志，２００７，１３（１０）：５３－５６．
［６］　贾明旺，黄文杰．Ｃａｓｐａｓｅ－３与肺炎链球菌引起的肺泡上皮细胞
凋亡的关系［Ｊ］．实用医学杂志，２０１０，２６（８）：１２９１－１２９３．
（收稿日期：２０１２－１０－２２） （供稿编辑：傅友军）
·２０４２· 江苏医药２０１３年１０月第３９卷第２０期　Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｍｅｄ　Ｊ，Ｏｃｔｏｂｅｒ　２０１３，Ｖｏｌ　３９，Ｎｏ．２０