全 文 ：
触抗原时 ,致敏 T 细胞分化增殖 ,释放各种淋巴因子
及直接杀伤靶细胞 ,出现以单核细胞浸润为主的局
部炎症反应 。鼻炎口服液能显著抑制 2 ,4-二硝基氯
苯诱导的小鼠耳壳肿胀 ,表明该药物具有抗迟发型
过敏反应的作用 。
本项实验证实 ,鼻炎口服液具有抗过敏作用 ,可
用于变态性鼻炎的临床治疗。
[参考文献]
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三叶青提取物对肺癌A549细胞的体外抑制作用
程 伟＊ ,陆曙梅
(信阳职业技术学院 ,河南 信阳 464000)
[ 摘要] 目的:探讨三叶青提取物对肺癌细胞 A549 的体外抑制作用。方法:采用体外细胞培养技术 , 用MTT法观察三叶
青提取物对肺癌细胞A549 体外抑制作用的时效 、量效关系;琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡;RT-PCR法检测细胞凋亡相关基因
BcL-2的表达。结果:三叶青提取物以 1×10-3 g·L-1的浓度与 A549 细胞共培养 48 h , 其细胞活性有显著降低;不同浓度的三叶
青提取物和A549 细胞共同培养 , 药物浓度为 1×10-2 、1×10 -3 、1×10-4 g·L-1的三叶青提取物对 A549 细胞活性有显著性抑制
作用。琼脂糖凝胶电泳有明显的梯状条带;不同浓度三叶青提取物作用于 A549 细胞后 , 细胞 BcL-2 基因的表达随浓度的增加
而降低。结论:三叶青提取物对 A549 细胞具有明显的体外抑制作用 ,其抑制作用与药物的浓度和作用时间呈明显正相关。
[ 关键词] 三叶青提取物;A549细胞;体外抑制作用
[ 中图分类号] R285.5 [文献标识码] B [ 文章编号] 1005-9903(2007)10-0053-04
Depressant Efects of the Extract of Radix Tetrastigma Hemsleyani
On Lung Carcinoma Cell Line A549 in vitro
CHENG Wei
＊ ,LU Shu-mei
(Xinyang Vocational Technical College ,Xinyang 464000 , China)
[Abstract] Objective:To study depressant efects of the extract of Radix Tetrastigma Hemsleyani on lung
carcinoma cell line A549 in vitro.Methods:The time-effect and quality-effect of the extract of Radix Tetrastigma
Hemsleyani on lung carcinoma cell line A549 were observed by cell culturein vitro using the method of MTT.Agarose gel
electrophoresis was used to detect the apoptosis.RT-PCR were used to detect the expression of BcL-2 gene ,which was
related to apoptosis.Results:48 hours after co-culturing A549 and Radix Tetrastigma Hemsleyani with a concentration
[ 收稿日期] 2007-04-24
[ 通讯作者] ＊程伟 , Tel:13507602586;E-mail:chengwei@yahoo.com.cn
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of 1×10-3 g·L-1.the cell activity decreased significantly compared to control.When culturing A549 and the extract with
different concentrations , it had a significant depressant effect on cell activity with concentrations of 1×10-2 ,1×10-3 ,1
×10-4 g·L-1.There was an obvious apoptotic ladder in agarose gel electrophoresis.Culturing A549 and the extract with
different concentrations , the expression of BcL-2 gene was low following the density raise of Radix Tetrastigma Hemsleyani.
Conclusions:the extract of Radix Tetrastigma Hemsleyani has a significant depressant effect on lung carcinoma cell line
A549 ,which positively relates with its concentration and efect-time.
[ Key words] The Extract of Radix Tetrastigma Hemsleyani;A549;depressant effects in vitro
肿瘤的发生取决于肿瘤细胞的凋亡率和增殖率
的动态平衡是否破坏 ,这一过程取决于多种凋亡相
关基因的表达及相互作用 ,这些正常调控机制的紊
乱促使肿瘤的发生发展。三叶青具有清热解毒 、祛
风化痰 、活血止痛的功效 ,用于治疗高热惊厥 、肺炎 、
哮喘 、肝炎 、风湿等症 ,具有良好疗效[ 1] 。在民间三
叶青用于肿瘤的治疗 ,被许多民间验方收载。徐彩
菊等对三叶青提取物抗肿瘤抑制进行了初探 ,认为
调节机体的免疫功能是三叶青提取物抗肿瘤的重要
机制之一[ 2] 。本研究对三叶青提取物作用于 A549
肺癌肿瘤细胞 ,主要探讨对其体外抑制作用 ,为临床
应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材 料 三叶 青块根 (Radix Tetrastigmatis
Hemsleyani),产自云南 ,购于华东医药公司中药分公
司;三叶青提取物是由上海之江生物科技有限公司
提供 。
肺癌细胞株 A549由上海之江生物科技有限公
司提供;小牛血清及 RPMI 1640 培养液购自 GIBCO
公司 。
1.2 细胞培养及实验分组 A549细胞株用含 10%
小牛血清的 RPMI 1640培养基 ,于37 ℃, 5%CO2 饱
和湿度条件下培养 ,(2 ～ 3)d传代1次 。
1.2.1 不同浓度三叶青提取物对 A549细胞的作用
取对数生长期细胞使其脱壁 , 用 10%胎牛血清
RPMI 1640培养液重悬成单细胞悬液。以 1×104 孔
密度将A549细胞接种于 6孔细胞培养板 ,用含 10%
小牛血清的DMEM培养液培养 24 h后 ,弃去原有细
胞培养液 ,加入用DMEM 培养液稀释成 1×10-2 ,1×
10
-3 ,1×10-4 ,1×10-5 ,1×10-6 g·L-1浓度的三叶青
提取物各200 μL ,每个提取物重复 3 孔。对照组只
加含 10%小牛血清的 DMEM 培养液 ,在培养 48 h
后 ,每孔加入mol·L-1MTT 溶液 20 μL ,继续培养 4 h
后终止培养 ,小心吸弃孔内上清液 ,每孔加入 DMSO
150μL震荡混合仪震荡 10 min ,使结晶充分溶解 ,选
择酶标分析仪 490 nm 波长测定每孔光吸收值(OD
值)。肿瘤细胞生长抑制率(%)=(1-实验组吸光
值 对照组吸光值)×100%。
1.2.2 10-3 g·L-1三叶青与 A549细胞共同培养不
同时间对细胞的作用 将用 10%胎牛血清 RPMI
1640培养液培养的A549细胞以每孔 103 ～ 104 个细
胞接种于 96孔细胞培养板 ,每孔培养液 200 μL。将
培养板置细胞培养箱继续培养 24 h ,吸弃孔内原培
养液 ,加入用 DMEM培养液稀释成 1×10-3 g·L-1浓
度的三叶青提取物 ,对照孔只加含 10%小牛血清的
DMEM培养液 ,分别在 24 , 48 ,60和 72 h 加入 5 mg·
mL
-1
MTT 溶液测定细胞活性 ,每个时间点重复 3
孔 。
1.3 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 梯状条带 对数生
长期细胞接种于细胞培养板中继续培养 24 h 后 ,加
入 10-3 g·L-1三叶青提取物继续培养 ,对照组加等
量的 DMSO ,培养 24 h 后 ,取 1×106 个细胞用 DNA
Ladder Isolation Kit提取 DNA ,吸取 20μL的 DNA与 4
μL上样缓冲液混匀点于点样孔中 ,以 90V电泳1 h ,
紫外透射仪上观察电泳结果。
1.4 三叶青提取物对 A549细胞凋亡相关基因 BcL-
2表达的影响 取 1×10-6 ,1×10-5 , 1×10-4 , 1×
10
-3 ,1×10-2 g·L-1 5个不同浓度三叶青提取物作
用 24 h后的细胞 ,抽提 RNA ,进行 RT-PCR ,检测细胞
凋亡相关基因 BcL-2的表达。BcL-2 基因的引物序
列:F:5′-GGAGAGAGCTGAAGATTGATG-3′;R:5′-
TTTCCCCCTTGGCTTGAGATG-3′。扩增片段 219 bp 。
1.5 统计学方法 每组实验在相同条件下重复 3
次 ,结果用 spss 11统计软件进行方差分析。当 P <
0.05时 ,认为两组间有显著性差异。
2 结果
2.1 不同浓度的三叶青提取物对 A549细胞的抑制
将A549细胞与不同浓度三叶青提取物共培养 48
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h后 ,用MTT法测定 ,发现随着药物浓度的增加 ,细
胞的生长抑制作用增强 ,呈剂量-效应关系 ,见图 1。
随着药物浓度的增加 ,A549 细胞的抑制率分别为
0.96%, 1.62%, 17.94%, 49.3%和 60.3%。三叶青
提取物浓度为 10-2 ,10-3 ,10-4 g·L-1时对A549细胞
活性有显著性抑制(P <0.05)。抑制半数癌细胞生
长的药物浓度约为 10-3 g·L-1 。
图 1 不同浓度的三叶青提取物
对A549细胞的抑制率
2.2 共同培养不同时间后细胞的抑制率 在贴壁
培养的 A549细胞加入浓度约为 10-3 g·L-1三叶青
提取物后继续培养 ,用MTT 法检测 24 ,48 ,60和 72 h
的OD值 。从图 2可见 ,加入三叶青提取物后 ,A549
细胞增殖受到抑制 ,在 24 h 时 ,细胞抑制率低 ,48 h
时细胞抑制率明显增加 ,和对照组比较有显著性差
异(P<0.05),接近半数抑制 , 48 h 后抑制率增长变
缓。
图 2 与 10-3 g·L-1三叶青提取物共培养不同
时间后细胞的抑制率
2.3 琼脂糖凝胶电泳检测 琼脂糖凝胶电泳检测
药物作用后的 A549细胞 ,凋亡细胞呈现梯状条带 ,
表明三叶青提取物能促进 A549 细胞的凋亡 , 见图
3。
2.4 细胞凋亡相关基因 BcL-2的表达 结果见图
4 ,图4A为内参GAPDH电泳图 ,4B为目的基因 BcL-
2电泳图 。从图中可看出 ,随着药物浓度的增加 ,
图 3 三叶青提取物作用后 A549细胞的 DNA ladder
M为 Marker;1为对照组;2为作用组。
BcL-2基因的表达降低。在浓度达到 10-4后 , BcL-2
基因表达迅速降低 ,在浓度达到 10-3后 ,表达降低变
缓 。
图 4A 不同浓度三叶青提取物作用后细胞 GAPDH电泳图
图 4B 不同浓度三叶青提取物
作用后细胞 BcL-2基因电泳图
M 为Marker;1为对照组;2～ 6分别为 10-6 , 10-5 , 10-4 ,
10-3 , 10-2 g·L-1不同浓度三叶青提取物作用后的细胞
3 讨论
丁钢强等发现三叶青提取物对肝癌细胞 HepG2
具有明显的体外细胞毒作用 ,其毒性作用与药物的
浓度和作用时间呈明显正相关[ 3] 。冯正权等[ 4] 发现
三叶青黄酮能显著地抑制胃癌细胞 SGC-7901 的生
长 ,并且具有浓度依赖性。本研究在肺癌A549细胞
中加入不同浓度的三叶青提取物后 ,共培养 48 h 后
检测吸光值 ,发现随着三叶青提取物浓度的增加 ,对
肺癌A549 细胞的抑制作用明显增强 , 在浓度达到
10
-4
g·L-1后 ,与对照组有显著差异 ,表明10-4 g·L-1
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可能是三叶青药物发挥药效的最低浓度。将一定浓
度的三叶青提取物作用于A549细胞 ,共培养不同时
间后检测吸光值 ,结果随着共培养时间的延长 ,对细
胞的抑制作用也变强 ,在共培养 48 h后 ,抑制率接近
50%,继续培养 ,细胞的抑制变缓 ,这为三叶青抗肿瘤
的进一步研究及临床用药提供了药效时间的依据 。
DNA琼脂糖凝胶电泳呈现“梯状”条带 ,是细胞
凋亡的一个重要标志 。本研究表明三叶青提取物能
促进A549细胞的凋亡。BcL-2基因在细胞凋亡中起
着重要作用 ,与肿瘤的发生发展关系极为密切[ 5 , 6] 。
Kren等(2004年)研究发现 Bcl-2基因的过量表达能
使多种肿瘤细胞系统对放 、化疗药物产生耐药性[ 7] 。
BcL-2不但与肺癌的发病有关 ,在治疗反应性及预后
方面也起重要作用[ 8 , 9] ,本研究发现 ,随着三叶青提
取物浓度的增加 ,BcL-2基因的表达降低。在浓度达
到10-4后 , BcL-2 基因表达迅速降低 ,在浓度达到
10
-3后 ,表达降低变缓 。我们可以认为10-4 g·L-1至
10
-3
g·L-1是三叶青提取物作用于 A549细胞的最佳
浓度区域 ,这与以上体外肿瘤细胞的抑制作用的结
果一致 ,这对将来用于临床提供了量的依据和参考 。
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[ 收稿日期] 2007-05-10
[ 通讯作者] ＊杨保存 , Tel:(029)85324060
祛癜生血颗粒治疗慢性原发性
血小板减少性紫癜的临床观察
杨保存＊ ,张彩霞 ,杜 雷
(西安交大医学院第一附属医院 ,陕西 西安 710061)
慢性原发性血小板减少性紫癜(CITP)是一种自身免疫
性疾病。笔者运用祛癜生血颗粒与皮质激素联合治疗 32 例
CITP, 并同长春新碱和激素联合治疗的 30 例 CITP作比较 ,取
得了满意的疗效 ,且副作用降低 , 现报道如下。
1 临床资料与治疗方法
1.1 一般资料 62 例 CITP均为西安交大医学院第一附属
医院门诊患者 ,均符合首届中华血液学会全国血栓专业学会
有关出血和凝血疾病诊断标准(修订案)[ 1] 和中华中医药学
会内科学会制定的原发性血小板减少性紫癜诊断标准[2] 。
按就诊的先后次序随机分为治疗组和对照组。其中治疗组
32例 , 男 12 例 ,女 20例;平均 30 岁;对照组 30 例 , 男 11 例 ,
女 19 例;平均 31岁。两组年龄 、性别 、病情无显著性差异 ,具
有可比性。
1.2 治疗方法 治疗组:根据临床症状对火盛气伤者用祛
癜生血颗粒 1 号(生地黄 、大蓟 、小蓟 、肉桂 、鹿角胶 、三七 、旱
莲草 、仙鹤草 、当归 、大黄等);对虚证者用 2 号(熟地黄 、黄
芪 、当归 、菟丝子 、淫羊藿 、补骨脂 、鹿角胶 、阿胶 、西洋参 、山
药 、枸杞子 、杜仲 、山茱萸等), 每次 1 袋 , 1 日 3 次 , 水冲服。
病情较重者 , 以此两方加减改为汤剂口服 , 至病情稳定后仍
服冲剂。 3 个月为 1个疗程 , 治疗 2 个疗程后判定疗效。泼
尼松(1 ～ 2)mg·kg-1·d-1 , 晨 1 次顿服 ,(4～ 6)周后渐减量至
维持量。对照组:生理盐水 500 mL加长春新碱(VCR)(1～ 2)
mg(儿童酌减), 持续缓慢静点(4 ～ 5)h , 每周 1 次 , 用(4 ～ 6)
周;泼尼松用法同治疗组。两组酌情予以血小板输注及西药
止血剂。
(下转第 63页)
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