全 文 ：1 9 94 年2 1( 4) 微 生
我们利用台式自控发酵罐对该菌的细胞培
养工艺进行了初步探索 , 培养基仍为 S C S L 培
养基 , 细胞生物量可达 6 5 9 / L 培养基 ; 细胞
S O D 含量为 2 0 5 Ou / g 菌体 (小试结果将另文报
道 ) 。
物 学 通 报
( 1 )
:
1 8一 2 0 .
2 1 3
参 考 文 献
M e C o r d JM
,
F r i d o v i e h 1
.
J B io l C h e m
,
1 9 6 9
,
2 4 4
:
6 0 4 9
-
60 5 5
.
冯启浩 , 袁勤生 , 全国食品添加剂通讯 , 19 9 2 , 3 : 42 一
4 6
.
邹国林 , 裘名宜 , 朱 彤 . 氨基酸杂志 , 19 91 , 3 : 28 一
3 2
.
张博润 , 谭华荣 , 徽生物学通报 , 1 9 9 2 , 19 (6 ) : 35 2一
3 5 6
.
屠幼英 , 倪福弟 , 陆应饪 , 徽生物学通报 . 1 9 9 2 , 19
[ 6 ] N
e d e v a T S
.
aS
v o v v A
.
K u ju m d z i e
v a 一
aS
v o v a A v 。 : a l
.
F E M S M i e r o b i o l L e t t
, 1 9 9 3
, 1 0 7 : 4 9一 5 2 .
[ 7〕 张博润 , 田宇清 . 黄 英 , 等 . 微生物学报 · 1 9 9 .4 35
( 4 ) 待发表 。
【8 〕 袁勤生 , 王志友 , 翁清清 · 等· 医药工业杂志 · 19 8 3 · 卜
1 6一 1 9 .
[ 9〕 邓碧玉 , 袁勤生 . 李文杰 · 生物化学与生物物理进 展 ·
1 9 9 1
,
1 8 ( 2 )
:
1 6 3
.
仁10 〕 方允中 , 超氧化物歧化酶的性质 , 见 : 方允中 、 李文
杰主编 ·
自由基与酶— 基础理论及其在生物学和 医学中的应用 。北京 : 科学出版社 , 1 989 . 71 一 87 .
[ 一z〕 F a r r S B , K o g o m a T . M i e r o b i o l R e v . ] 9 9 1 . 5 5 : 5 6 1 -
5 8 5
.
仁1 2〕 G r a l l a E B , T h i e l e D J , S : l a r P e t a l . P r oc X a r l A e a d
cS i U S A
, 19 9 1
.
8 8
:
8 5 58一 8 5 6 2 .
[ 1 3〕 G r e e o M A . H r a b D I , M a g n e r w e t a l . J aB e t e r : 0 1· 19 9 。 ·
17 2 : 3 17一 3 2 5 .
一J I飞」10é厂LL
一卫J飞」氏J4
r. lweLJ
[ 5〕
原生质体融合技术提高啤酒酵母凝絮性的研究
陈海昌 唐 屹 张岭花 柳冰雄
(大连轻工业学院食品工程系 , 大连 1 1 6 0 3 4)
摘要 融合亲株 A H 一 4 ( A s p 一 IL e 一 ) 和 Z F一 18 ( H i s 一 L y s 一 ) 细胞于 3 0% p E G 浓度 T , s o m m o l / I才 诱导
融合 30 分钟 , 筛出 F P一 19 融合株 , 融合频率为 1 . Z X 10 一 s 。 融合株细胞的体积和 D N A 含量均约为两亲株
细胞之和 。融合株既具有较高发醉度 , 又有较强凝絮性的特点 。
关扭词 原生质体 , 融合 , 凝絮性
细胞凝絮性是选育啤酒酵母的一个很重要
的指标 。 良好的凝絮性不仅可使啤酒发酵液澄
清速度加快 , 降低酵母分离的能源消耗 , 而且
还可防止酵母细胞长时间悬浮于发酵液中致使
细胞 自溶 ,有损啤酒风味 。但凝絮性较好的啤酒
酵母往往发酵度偏低 。所以如何解决好凝絮性
和发酵度两者关系一直是菌种选育工作者关注
的问题之一 。
1
。
1
材料与方法
实验菌株
种室提供 。
S a c c h a or n Z〕 Ic e s c e ver
i s i a e Z F
一
1 5 ( L e u
-
L y s 一 a )
,
S a c c h a r o 州ly e e s c e ver
i s i a e Z F
一
1 8 ( H i s -
L ys 一 a)
, 均 由中国科学院微生物研究所赠送 。
L Z 培养基
产抱前培养基 ( %户〕 : 葡萄糖2 , 酵母膏 1 ,
蛋白陈1 . 5 , N a C l o · 3 , 蕃茄汁 1 5 , 琼脂 2 , p H
自然 。
产抱培养基 ( S P M , % ) : 葡萄糖 0 . 1 , 酵母
膏 0 . 2 5 , K C lo . 1 8 , N a A e o . 8 , 琼脂 2 , p H 6 · o 。
S a c c h a
c e r 廿v i s i a e A S 2
.
1 4
, 本院菌
1 9 9 3
一 0 7一 0 8收稿
DOI : 10. 13344 /j . mi crobi ol . chi na . 1994. 04. 006
2 1 4 徽 生
完全培养基 C( M , % ) : 葡萄糖 2 , 蛋白陈
2
, 酵母膏 l , 琼脂 2 , p H 6 · o 。
高渗完全培养基 ( H C M , % ) : C M + 蔗糖
17
。
基本培养基 (M M , % ) : 葡萄糖 2 , K H Z PO 4
0
.
1 M g SO
4 7 H
Z
O 0
.
0 5
,
( N H
;
)
2
5 0
; o
·
l
, 琼脂 2 ,
p H 6
.
0
。
高渗基本培养基 ( HM M , % ) : M M + 蔗糖
1 7
。
1
.
3 实验方法
1
.
3
.
1 单倍体细胞制备 : 将活化的 A S Z . 14 细
胞接至产抱前培养基 , 28 ℃培养 2天 , 再转接于
S P M
,
21 ℃培养 10 天 。用生理盐水制抱子悬 液 ,
离心洗涤 , 加人终浓度为 2% 的蜗牛酶液 , 3 ` C
水浴酶解 3小时 , 58 C 水浴处理 8分钟 。 菌液迅速
冷却 , 倒入装有玻璃珠的三角瓶中 , 加适量生
理盐水和无菌液体石蜡 , 振荡 1小时 , 取菌液涂
于 C M 平板 , 28 C 培养 3一 5天 。将菌按上述条
件在产抱前培养基和 S P M 再培养 , 凡不形成
子囊抱子的为单倍体细胞 。
1
.
3
.
2 营养缺陷型标记菌株的制备 : 将单倍体
细胞 28 ℃培养 5小时至对数生长期 , 取菌悬液
sm l
, 加人硫酸二乙醋 0 . 05 m l 于 28 ℃水浴中振
荡 , 稀释中止反应 。 用生长谱法确定营养缺陷型
遗传标记 。
1
·
.3 3 接合型的确定 : 参照文献 5[] , 将两亲株
单倍体营养缺陷型啤酒酵母分别与标准单倍体
啤酒酵母菌 Z F 一 1 5 ( a ) 和 Z F 一 18 ( a ) 接种至 C M
斜面同一处 , 28 ℃培养 8小时 , 镜检是否形成哑
铃形合子 , 将已形成合子的培养物转接到 S P M
上 21 ℃培养 7天 。 凡能够形成哑铃形合子并在
S P M 上产抱的便认为进行了杂交 。 能与 Z F 一 15
a( ) 进行杂交的菌株定为接合型 a ; 能与 Z F 一 18
a( ) 进行杂交的菌株定为接合型 a 。
1
.
3
.
4 原生质体的制备与再生 : 将两亲株细胞
分别接种在 s m l 的液体 C M 中 , 2 8 ℃活化 2 4小
时 , 离心收集菌体细胞 , 高渗缓冲液洗涤 , 移
人三角瓶中振荡 1小时 , 加人 0 . 5 %蜗牛酶 , 3 ℃
水浴作用 30 分钟 , 离心 , 高渗缓冲液洗涤 , 培
养于高渗 C M 平板 。
物 学 通 报 1 9 9 4年 2 1 ( 4 )
L .3 5 原生质体融合 : 两亲株的原生质体按 1
, 1 比例混合 , 离心弃去上清液 , 加人融合液
sml
,
30 ℃水浴处理 , 高渗缓冲液适当稀释 , 分
别于 H C M 和 H M M 平板 2 8 C 培养 1 0天 。
1
.
3
.
6 融合株细胞性能测定
凝絮性的测定 : 按 H el m 和光密度两种方
法测定 [幻 。
D N A 含量的测定 : 采用改良的 cS h n ie d er
法提取 D N A 3j[ 。二苯胺法测 D N A 浓度川 。 小牛
胸腺 D N A 标准液作对照 , 59 5 n m 处读光密度
值 。
2 结果与讨论
2
.
1 遗传标记的认定
将菌株 A S 2 . 14 细胞诱导产抱后 , 酶解子
囊壁 , 获得单倍体 H 一 5菌株细胞 。 用 1%浓度
D E S 处理 30 分钟 (细胞死亡率约为 80 % ) , 培养
分离 , 筛选出单倍体营养缺陷型 A H 一 4 ( A sP -
I L e 一 ) 菌株 。传代实验确认菌株遣传标记稳定 ,
交配型测定为 。 型 s[] 。
2
.
2 原生质体的制备与再生
选择对数生长期的融合亲株细胞 就酶浓
度 、 酶作用时间以及再生方法进行了原生质体
制备和再生条件的考察 。
表 1数据表明 , 酶作用时间相同 , 酶浓度增
加 , 原生质体形成率提高 ; 相同酶浓度 , 酶作
用时间延长 , 原生质体形成率提高 , 但再生率
有所下降 。 本试验还表明夹层法比涂布法的再
生率有明显的提高 。
2
.
3 原生质体的融合
影 响原生质体融合的因素主要是 P E G 和
钙离子浓度以及诱导融合时间 。 正交试验结果
见表 2 。
K 值法分析 , 比较极差 R 值得出 , P E G 浓
度是影响原生质体融合的主要因素 , 融合时间
次之 , C a 1C 2浓度的影响最小 。 根据正交试验结
果 , 两亲株细胞最佳融合条件为 : 30 %的 P E G
浓度 , 50 m m ol / L C a 1C 2融合液 , 诱导融合时间
3 0分钟 , 融合频率可达 1 . Z x l o一 “左右 。
2
.
4 融合株的检出与性能测定
19 94年 2 1 ( 4 ) 徽 生
2
.
4
.
1 营养要求测定 : 融合亲株 A H 一 4 (A Ps -
IL e 一 ) 和 Z F 一 1 5 (H i s一 L y s一 ) 在 M M 上均不生
物 学 通 报
长 , 融合株 F P 一 19 按营养互补原则可在 M M 上
生长 。亲株和融合株的营养要求见表 3 。
表 1 醉浓度 、 醉作用时间与再生方法对原生质体形成与再生的影晌
菌 株 破 壁 条 件 试 验 结 果
酶 浓 度 酶作用时间 原生质体形成率 再 生 率 ( % )
( 肠 ) ( m i n ) (% ) 涂 布 法 夹 层 法
A H
一
4 l 3 0 9 9
.
9 2
.
0 3
.
2
6 0 1 00
.
0 l
。
4
0
.
5 3 0 9 6
.
9 9
。
4 1 5
.
0
6 0 98
.
9 7
。
0
Z F
一
1 8 l 3 0 98
.
7 5
。
6 8
。
7
6 0 9 9
.
7 4
.
0
0
。
5 3 0 9 7
。
7 2 9
.
1 4 2
。
l
6 0 9 9
.
0 5
.
1
衰 2 P E G 和 C a cl : 浓度及触合时间对胜合颇率的影晌
产.ǎ .八
.
!
卜le|Ll
.
w月
00.0.8
ǎ甲。一xà哥壕如邀议 A B C 融合报率( X 10 一 6 )l l l l 7 . 52 1 2 2 9 . 0
3 l 3 3 8
.
6
4 2 l 2 10
。
0
5 2 2 3 9
.
1
6 2 3 l 8
.
7
7 3 l 3 7
.
8
8 3 2 l 8
.
1
9 3 3 2 7
。
9
6 .0 一方茄一亦一旅厂交一渝一 .茄 一亩茄
P E G浓度 (% ) 融合时间 (m in )
C a C I
Z浓度 (m m o l / L )
A
:
P E G 浓度 ( % ) : A l = 2 0 , A Z = 3 0 , A 3 =
B
:
C a C 12浓度 ( m m o l / L ) : B ; = 1 0 , B Z
C
: 融合时间 ( m in ) : C l = 2 0 , C Z~ 3 0 ,
4 0
,
B 3 = 10 0
, 图1 P E G 、 C a C 12浓度和融合时间对融合频率的影响
C 3 = 4 0
裹3 亲株和触合株的曹养要求
培养基 M M C M M M + H i s M M + L y s M M + A s P M M + I L e M M + H i s 十 L y s .M M + A s P + I L e
结果
菌株
A H
一
4 + +
ZF
一
18 + +
F P
一
1 9 + + + + + + + +
+ 表示生长 , 一 表示不能生长
2
.
4
.
2 发酵速率与细胞凝絮性的研究 : 根据麦
芽汁发酵时 C 0 2失重和发酵度进行菌种初筛 ,
再测其凝絮性进行复筛 , 得一株发醉性能及凝
絮性均较佳的融合株 F P 一 1 9 。 图 2中可看出 , 融
2 1 6 徽 生
合株 F P一 19 的发酵速率明显高于两单倍体亲
株 , 但略低于 A S Z . 14 菌株 .
H el m 法测定细胞凝絮性表明 , 10 分钟测
定 融合株 F P 一 ” 细胞沉淀体积 ( 0 . 76 m l ) , 为
亲株 A S .2 14 细胞沉淀体积 (0 . 32 m l) 的两倍
以上 。光密度法测定结果也表明 , 融合株 F P 一”
细胞凝絮性明显高于 A S 2 . 14 的 。
2
.
4
.
3 细胞大小的测定 , 随机测量细胞的长短
物 学 通 报 1 9 9 4年 2 1 ( 4 )
轴各` 0。个 , 求出平均值 。 按公式 v 一告二 ·号·
(普}’ 计算细胞的体积 , 结果见表 3 。
融合梅 , P 一 1哟细胞体积明显大于亲株细
胞约为两亲株细胞之和衬旦略小于A S .2 14 细胞
融合株细胞形状类似于出发菌株更呈椭圆形 。
2
.
4
.
4 细 胞 D N A 含量 的测 定 : 以小 牛胸腺
D N A 作标准 曲线 , 各菌株 的 D N A 含量 (三次
测定平均值 )测定结果见表 4 。
数据表明 , 融合株 F P 一 19 细胞 D N A 量与两
亲株细胞的 D N A 量之和 基本相符 。 菌株 A S
2
.
1 4 细胞的 D N A 量也约为菌株 A H 一 4 细胞的
两倍 。 由此也证明 ,菌株 A H 一 4 细胞为单倍体细
胞 。
2
.
4
.
5 巨大菌落的形态 比较 :将各菌株细胞 28 ℃
培养 1 个月 ,长出巨大菌落 形态描述见表 5 。
:0
4
邝ú
ǎ竺阔水NO口
静置时间 (h)
图 2
1
.
A H
一
4
扮叮下’24 4 8 7 2 卿
发酶时间 ( h)
各菌株发酵速率的比较
2
.
ZF
一
1 8 3
.
F P
一
1 9 4
.
A S Z
.
1 4
裹 4 亲株 、 胜合株及出发菌株细胞大小比较
图 3 光密度法测定细胞凝絮性
衰 5 各菌株细胞的 D N A 含 t
菌 株 平均长度 ( 拜m ) 休 积 长轴 /短轴
(拌m 3 )长 轴 短 轴
A H
一 4 6
。
2 5 6
.
0 0 1 1 7
.
8 1
.
0 4
Z F
一
1 8 6
。
2 5 5
.
7 5 1 0 8
.
2 1
.
0 9
F P
一
1 9 8
。
5 0 7
.
0 0 2 1 8
.
1 1
.
2 1
A S 2
.
1 4 9
.
2 5 7
.
2 5 2 5 4
.
6 1
.
2 8
菌株 A H 一 4 Z F 一 1 8 F P 一 1 9 A S 2 . 1 4
数据
项目
D N A 量 4 . 0 5 2 . 8 0 6 。 8 2 8 . 4 1
吐0一 ’ 19胭 l能 ) n n 2 n 2 n
倍体
裹 6 巨大菌落的形态比较
、俞遭牡 表面形状 周边形状 菌落构造
A H
一 4 光清 不规则 隆起生长 , 中部突起较高
ZF
一
18 光滑 不规则 扁平生长 , 中部凹状
F P
一
1 9 光清 较规则 扁平生长 , 中部突起不高
A S 2
.
1 4 皱折 不规则 隆起生长 , 中部突起较高
, 菌落颜色均为黄白色 , 有光泽 。
1 9 9 4年2 2 ( 4) 微 生
2
.
4
.
6发酵度的测定 :麦芽汁发酵结束后 , 用
比重瓶法测定麦芽汁浓度和发酵度 。结果表明 ,
F P
一
1 9 的发酵度与 A S 2 . 14 的相 同 。
物 学 通 报
菌株相比较 ,无明显差异 。
参 考 文 献
表 7 亲株 , 融合株及出发菌株的发酵度
菌 株 原麦汁浓度 真正浓度 真正发酵度
( % ) ( % ) (% )
A H
一 4 1 2
.
4 0 4
.
3 2 9 6 5
.
0 8
F P
一
1 9 1 2
.
18 4
.
6 5 5 6 2
.
7 8
A S 2
.
1 4 1 1
.
94 4
。
3 0 4 6 3
.
9 5
综上所述 , 融合菌株 F P 一 19 的细胞凝絮性
明显优于 出发菌株 A S 2 . 1 4 , 其发酵度和 出发
K
.
B
. 柯西可夫著 . 醉母遗传育种方法 . 北京 : 轻工业出
版社 · 1 9 8 7 ·
杜绿君 . 啤酒酵母和微生物管理 . 北京 : 轻工业出版
社 . 1 9 90 ·
F a r a h n a k F
.
A p P l l e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i e r o b
l o l o g y
.
19 8 6
.
9
:
3 6 2一 3 6 7 .
张龙翔 . 生化实验方法 和技术 . 北京 : 人 民教育出版
社 . 1 98 7 ·
夏淑兰 . 现代应用微 生物学实验技术 , 北京 : 轻工业出
版社 , 1 98 8 ·
酵母菌高产蛋氨酸机理的研究
孔 健 马桂荣 高培基
( 山东大学微生物研究所 , 济南 2 5 01 0 0)
摘要 乙硫氨酸是蛋氨酸的结构类似物 , 150 拜 g / ml 浓度的 乙硫氨酸可抑制丝抱酵母 ( T ir hc os oP or n cu -
at ne
“ m ) S T 85 1 生长 , 又能被蛋氨酸回复 。 经紫外线处理后 , 得到抗性突变株 S T 85 -1 l o , 菌体蛋氨酸含量
提高了 43 . 5% 。 分析合成机理表明 :该突变株 S T 85 1一 10 的 S 一腺昔蛋氨酸合成酶活性降低 ,增大了细胞
内蛋氨酸库 (M e t h i o n i n e p o o l ) 。
关键词 蛋氨酸 , 乙硫氨酸 , 抗性突变株
作为食品和饲料的单细胞 蛋 白 ( S C P ) 生
产 ,在近几十年内国内外都受到普遍重视 。生产
S C P 的首选菌种为酵母 , 但酵母中蛋氨酸含量
一般偏低 l[] , 为平衡其营养结构 , 提高菌体的蛋
氨酸含量是十分必要的 。
酵母菌体中蛋氨酸的生物合成受到严格 的
代谢调节川 , 因此从 自然界中分离的野生株内
蛋氨酸不会过量积累 , 必须获得调节突变株 。 乙
硫氨酸是蛋氨酸 的结构类似物 , 文献报导其抗
性株可积累蛋氨酸 3[, `〕。 本论文借助此育种手
段 , 选育蛋氨酸高产株 , 并对其代谢机理进行研
究 。
1 材料和方法
1
.
1 材料
L L I 菌种 : 丝 抱 酵母 ( T ir c ho soP or n : ut a -
n e u m ) S T 8 5 1 本室 S C P 生产菌株 。
L L Z 培养基
合成 培养基 ( 写 ) : 葡萄糖 2 . 。 , 尿素 0 . 2 ,
( N H
4
)
2
5 0
; 0
.
0 4
,
K H
Z
P O
; 0
.
6
,
N a ZH P O
4 0
.
2
,
M g S O
; · 7 H
Z
O 0
.
0 5
, 复合维生素母液 o · o s m l ,
复合微量元素母液 0 . 05 m l 。
缺硫培养基 : 在合成培养基中以等摩尔氮
1 9 9 3
一 10
一 1 8 收稿