全 文 ：[基金项目 ] 　浙江省中医药科研基金项目(2006C151)
[作者简介 ] 　徐彩菊(1964-),女 ,学士 , 副主任医师 ,主要从事
免疫 、抗肿瘤及其机制研究。
＊浙江理工大学生命科学学院分子生物学专业研究生
【论著】
三叶青提取物体内抑瘤作用及其机理研究
徐彩菊 , 白宁宁＊ , 孟佳 , 傅剑云 , 姚亚萍 , 丁钢强
(浙江省疾病预防控制中心 , 杭州　310051)
[摘要 ] 　目的:探讨 S180荷瘤小鼠经三叶青提取物干预后抑瘤率 、细胞免疫功能和抗氧化能力的变化。 方法:本次试验
设正常对照组 、肿瘤对照组 、三叶青提取物低 、高(5和 15 g/kg· BW)两个剂量组 、环磷酰胺(CTX)阳性对照组和联合组
(三叶青提取物高剂量 +CTX)。除正常对照组外均接种 S180肿瘤细胞 , 经药物干预后观察各组外周血 T细胞亚群
(CD3 、CD4、CD8和 CD4 /CD8)和抗氧化指标(MDA、SOD和 CAT)的变化 , 并比较抑瘤率的大小。结果:与肿瘤对照组比
较 , 三叶青提取物高剂量组外周血 T细胞亚群 CD3、CD4、CD8 、CD4 /CD8均有明显改善且趋于正常 , 脂质过氧化物丙二醛
(MDA)含量明显下降 ,混合功能氧化酶过氧化氢酶(CAT)的活性明显升高 , 且均有统计学差异;经三叶青提取物高剂量
干预后的抑瘤率达 36.06%。结论:三叶青提取物具有一定的抑瘤效果 , 其作用机理可能与改善荷瘤小鼠机体的细胞免
疫功能 , 激活机体的抗氧化作用途径有关。
[关键词 ] 　三叶青提取物;S180荷瘤小鼠;细胞免疫功能;抗氧化作用
[中图分类号 ] 　R285.5　　　　[文献标识码 ] 　A　　　　[文章编号 ] 　1004-8685(2009)02-0278-03
Astudyoneffectofanti-tumorofextractfromtetrastigmahemsleyanumdielset.gilg
anditsmechanismsinvivo
XUCai-ju, BAINing-ning＊ , MENGJia, FUJian-yun, YAOYa-ping, DINGGang-qiang
(ZhejiangCenterforDiseaseControlandPrevention, Hangzhou310051, China)
[ Abstract] 　Objective:Toinvestigatethechangesofinhibitionratiooftumor, cellularimmunityandantioxidationunderextract
fromtetrastigmahemsleyanumdielset.gilg(TDG).Methods:Micewererandomlydividedintosixgroups(10 micepergroup):
normalcontrolgroup, tumorcontrolgroup, twosamplegroups(5, 15 g/kg· BW), positivecontrolgroup(CTX)andcombination
group(15 g/kg· BW+CTX).EverymouseexceptnormalcontrolgroupswereinoculatedbyS180cells.Thechangesofinhibition
ratiooftumor, Tlymphocytesubpopulations(CD
3
, CD
4
, CD
8
, CD
4
/CD
8
)andantioxidation(MDA, SOD, CAT)inthebloodof
micewereobserved.Results:TheextractfromTDG(15g/kg· BW)werefoundtoimprovetheratioofTlymphocytesubpopula-
tions(CD3 , CD4 , CD8 , CD4 /CD8), decreasethecontentsofMDAandincreasetheactivityofCATcomparedwiththetumorcon-
trolgroup.Theinhibitionratiooftumorwas36.06% underextractfromTDG(15g/kg· BW).Conclusion:Thesedataindicated
thatextractfromTDGcouldhaveanti-tumorefects.Theirmechanismsofactionmightbecorrelatedwithimprovingofcellular
immunityandactivatingofantioxidationintheS180-bearingmice.
[ Keywords] 　Extractfromtetrastigmahemsleyanumdielset.gilg;S180-bearingmice;Cellularimmunity;Antioxidation
　　三叶青作为中药在民间已有较长的服用历史。药理实验
结果表明三叶青提取物有抗病毒作用 [ 1]和明显的消炎镇痛 [ 2]
及保肝作用 [ 3] , 在民间三叶青还用于肿瘤的治疗。目前临床
上往往将三叶青与其他中草药配伍使用治疗恶性肿瘤病人 ,
具有较好的疗效 [ 4] 。三叶青为中国特有植物物种 , 目前本省
已基本解决了组培快繁技术 [ 5] , 为三叶青大规模种植创造了
条件。作者前期的研究结果亦表明三叶青提取物具有增强正
常小鼠免疫力的作用 [ 6] , 而对荷瘤小鼠的抑瘤作用及其相关
的作用机理至今未见报道。
随着分子生物学及相关技术的发展 , 肿瘤的免疫治疗已
成为当前令人关注的研究领域。 T淋巴细胞是细胞免疫的主
要效应细胞。机体的免疫调节作用主要是通过 T淋巴细胞亚
群(TLS)的改变实现的。因此 , TLS的测定是目前国际上公认
的评价机体抗肿瘤免疫的重要指标 [ 7] 。大量研究表明 [ 8] , 肿
瘤患者体内会产生过多的氧自由基 , 后者能攻击生物膜中的
不饱和脂肪酸 , 引起脂质过氧化作用 ,并因此形成脂质过氧化
物 , 如 MDA等 , 同时也作用于细胞膜 , 严重损伤细胞膜的组
分 、结构和功能 , 从而影响人体的正常生理功能 , 而 SOD和
CAT可以清除体内过多的氧自由基 , 从而改善细胞的各种生
理功能。
本研究通过三叶青提取物对 S180荷瘤小鼠抑瘤率的改
变 , 观察其抑瘤效果;从外周血 T细胞亚群和抗氧化能力的变
化 , 进一步探讨其抑瘤作用的机理 , 为本省的植物资源 --三
278 中国卫生检验杂志 2009年 2月第 19卷 第 2期　ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology, Feb2009;Vol19　No2
叶青的进一步开发和利用提供实验依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　三叶青提取物　由浙江省中药研究所协助完成提取。
提取步骤如下:三叶青块根用 75%的酒精提取 低温真空后
得浓缩液 石油醚萃取 乙酸乙酯萃取 正丁醇萃取 水层
干燥后得到样本 , 即为本次实验的受试物 , -20℃冰箱保存备
用。
1.1.2　实验动物　清洁级 ICR雌性小鼠 ,体重 18 ～ 22 g,由中
科院上海实验动物中心提供 ,实验动物生产许可证号为 SCXK
(沪)2002-0010。
1.1.3　S180瘤株　由浙江省中药研究所提供。
1.1.4　试剂及仪器　血红蛋白(Hb)、丙二醛(MDA)、过氧化
氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒由南京建成生物
工程研究所提供 , 流式细胞仪所用试剂均由美国 BD公司提
供。主要仪器为 FACSCalibur流式细胞仪(美国 BD公司产
品), CK-2型倒置显微镜和 CH30型显微镜(日本 Olympus
公司产品)等。
1.2　方法
1.2.1　肿瘤模型的建立　先将瘤株接种于正常小鼠腹腔内 ,
让其大量繁殖 , 7d后抽取腹水(无血性), 用灭菌生理盐水稀
释成细胞浓度为 5×106个 /ml的接种液 , 取 0.2ml接种于每
只实验鼠右腋皮下。
1.2.2　分组处理及给药　接种瘤细胞 1 d后进行随机分组。
设肿瘤对照组(每天灌胃给予蒸馏水)、三叶青提取物低剂量
组(每天灌胃给予 5 g/kg体重 , 按生药计)、三叶青提取物高
剂量组(每天灌胃给予 15 g/kg体重 , 按生药计)、阳性对照组
(隔天腹腔注射环磷酰胺 30 mg/kg体重)、联合组(阳性对照
+三叶青提取物高剂量组 , 给药方法同上), 同时设正常对照
组 , 每组 10只。连续给药 10 d, 于停药次日 , 颈椎脱臼处死小
鼠。
1.2.3　观察指标　实验小鼠常规饲养 , 每日观察小鼠一般生
活状况 、肿瘤大小。于接种后第 12天 , 摘除眼球取血 , 并分为
抗凝血(EDTA二钠)和非抗凝血。取 50 μl抗凝血 , 流式细胞
仪测 CD
3
、CD
4
、CD
8
、CD
4
/CD
8
;取 10μl抗凝血于 990 μl蒸馏
水中(1:99)配成溶血液 ,用试剂盒测 Hb、MDA、SOD和 CAT。
1.3　统计方法
全部数据采用 SPSS/PC软件包在微机上进行统计处理。
2　结果
2.1　受试物对荷瘤小鼠抑瘤率和脏器 /体重比值的影响
从表 1可见 , 受试物高剂量组 、阳性对照组和联合组的抑
瘤率分别为 36.06%、77.37%和 79.88%, 具有明显的抑瘤作
用 , 但阳性对照组和联合组间的差别不明显。与正常对照组
比较 , 荷瘤对照组 、受试物高剂量组 、阳性对照组和联合组的
胸腺 /体重比值及荷瘤对照组 、受试物低 、高剂量组 、阳性对照
组和联合组脾脏 /体重比值均明显降低 , 差异均有显著性(P<
0.05)。正常对照组的胸腺 /体重比值及正常对照组 、阳性对
照组和联合组的脾脏 /体重比值均明显高于肿瘤对照组 , 差异
有显著性(P<0.05)。
表 1　受试物对荷瘤小鼠抑瘤率和主要器官的影响(x±s)
组别 胸腺 /体重(mg/g)
脾脏 /体重
(mg/g)
肝脏 /体重
(mg/g)
抑瘤率
(%)
正常对照组 3.31±0.80# 5.59±1.09# 53.29±8.47 -
荷瘤对照组 1.85±0.72＊ 10.26±1.39＊ 61.21±7.27 -
受试物(低) 2.74±1.16 11.49±2.43＊ 60.9±7.14 6.64
受试物(高) 2.06±0.77＊ 11.07±1.14＊ 62.99±8.13 36.06
CTX组 2.17±0.89＊ 7.63±1.95＊# 61.61±6.98 77.37
CTX+高剂量组 2.08±0.87＊ 8.20±2.35＊# 59.50±8.05 79.88
　　注:q检验:与正常对照组比较 ＊P<0.05,与荷瘤对照组比较 #P<0.05
抑瘤率 =(肿瘤对照组瘤重 -实验组瘤重)×100%/肿瘤对照组瘤重
2.2　受试物对荷瘤小鼠血液中各种酶类的影响
从表 2可以看出 ,与正常对照组比较 , 所有组别的红细胞
SOD活力和荷瘤对照组的溶血液 CAT活性均明显降低 , 荷瘤
对照组 、受试物低 、高剂量组的 MDA含量则明显升高 , 差异均
有显著性(P<0.05)。与荷瘤对照组比较 , 高剂量组 、阳性对
照组和联合组的 MDA含量均明显降低 , 差异均有显著性(P<
0.05);高剂量组 、阳性对照组和联合组均能提高荷瘤小鼠溶
血液中 CAT的活性 ,差异均有显著性(P<0.05)。
表 2　受试物对荷瘤小鼠血液中各种抗氧化指标的影响(x±s)
组别 红细胞 SOD活力(U/gHb)
溶血液 MDA含
量(nmol/mgHb)
溶血液 CAT
(U/mgHb)
正常对照组 26157.31±3598.38# 2.58±0.45# 17.38±2.37#
荷瘤对照组 19011.18±4408.63＊ 4.86±0.88＊ 10.16±4.88＊
受试物(低) 19532.36±3985.89＊ 4.38±0.89＊ 13.17±3.23#
受试物(高) 21778.58±4966.41＊ 3.91±0.70＊# 15.29±2.99#
CTX组 16364.94±4588.78＊ 3.34±0.54# 14.11±2.47#
CTX+高剂量组 20837.61±4144.48＊ 3.32±0.83# 15.18±2.95#
　　注:q检验:与正常对照组比较 ＊ P<0.05,与荷瘤对照组比较 #P<0.05
2.3　受试物对荷瘤小鼠血液中 T细胞亚群的影响
由表 3可以看出 , 与正常对照组比较 ,所有组别的 CD+3 百
分率和荷瘤对照组的 CD+8 百分率均明显升高 , 荷瘤对照组 、受
试物低剂量组的 CD+4 百分率和荷瘤对照组 、受试物低 、高剂量
组的 CD4 /CD8比值均明显降低 , 差异均有显著性(P<0.05)。
与肿瘤对照组比较 , 正常对照组 、受试物高剂量组的 CD+
3
百分
率和受试物高剂量组的 CD+8 百分率均明显降低 , 差异均有显
著性(P<0.05);阳性对照组 、联合组的 CD+
3
百分率 ,受试物
高剂量组 、阳性对照组和联合组的 CD+4 百分率和 CD4 /CD8比
值均明显升高 , 差异均有显著性(P<0.05)。但在所有 T细胞
亚群指标中 , 阳性对照组和联合组之间的差异不明显。
表 3　受试物对荷瘤小鼠血液中 T细胞亚群百分率表达的影响(x±s)
组别 CD
+
3 T细胞
(%)
CD+4 T细胞
(%)
CD+8 T细胞
(%)
CD4/CD8
比值
正常对照组 33.46±16.00# 63.77±13.54# 11.43±3.27# 5.17±0.96#
荷瘤模型组 53.34±7.03＊ 46.00±10.69＊ 18.15±4.23＊ 2.82±0.42＊
受试物(低) 54.22±7.18＊ 44.35±8.46＊ 14.60±3.60 3.08±0.55＊
受试物(高) 43.47±6.62＊# 61.40±10.18# 13.18±3.30# 3.72±0.76＊#
CTX组 84.56±5.34＊# 68.96±7.89# 15.37±3.18 4.71±0.52#
CTX+高剂量组 83.95±2.47＊# 67.87±6.84# 15.39±3.26 4.78±0.62#
　　注:q检验:与正常对照组比较 ＊P<0.05,与荷瘤对照组比较 #P<0.05
279中国卫生检验杂志 2009年 2月第 19卷 第 2期　ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology, Feb2009;Vol19　No2
3　讨论
目前普遍认为提高机体免疫功能和抗氧化作用是抗肿瘤
作用的两条重要途径 [ 9 ～ 11] 。恶性肿瘤的发生部分是由于机体
全身或局部免疫监视和防护功能失常引起的;肿瘤的生长 、扩
散很大程度上取决于机体免疫系统的功能状态。在机体抗肿
瘤免疫中 , 各种淋巴细胞都有可能发挥作用 , 但大量研究表
明 , T淋巴细胞在肿瘤的防御反应中扮演着最重要的角色。 T
淋巴细胞按其功能和其表面标志可分为四个主要亚群 , 即诱
导 -辅助性 T细胞(Ti/Th)、杀伤性细胞(Tc)、抑制性 T细胞
(Ts)及迟发型超敏反应 T细胞。 CD+3 是所有 T细胞表面的共
同标志 , CD+4 是辅助性 T细胞的表面标志 , 而 CD+8 代表 Ts,
CD4 /CD8比值反映 Th与 Ts之间的功能平衡状况。 CD+4 、CD+8
二者在体内的平衡 , 对于稳定和调节免疫系统的生理功能及
免疫反应强度起着重要作用 ,因此 T细胞亚群是反映机体细
胞免疫功能强弱的特异性指标。
本实验中肿瘤对照组与正常对照组相比 , CD+
3
、CD+
8
细胞
数占淋巴细胞数的百分比分别升高了 59.4%、58.8%, CD+4 降
低了 27.9%, CD4 /CD8比值降低了 45.5%,说明小鼠荷瘤后细
胞免疫功能严重受损 , CD+3 细胞数的升高可能与机体在肿瘤
发生状态下的应急和代偿机制有关。 经三叶青提取物干预
后 , 低剂量组各指标均无显著性改善 ,但高剂量组 CD+3 、CD+8
明显降低 , CD+4 明显升高 , CD4 /CD8比值升高 , 其中 CD+4 、
CD+
8
细胞数占淋巴细胞的百分比已经接近正常对照值(与肿
瘤对照比较差异有显著性 , 与正常对照比较差异无显著性)。
CTX组 、联合组与肿瘤对照组比较 , CD+4 、CD4 /CD8 比值明显
升高 , 差异有显著性;与正常对照组比较无显著性差异 , 说明
两者均已接近正常组值 , 但 CTX组与联合组之间比较差异不
大 , 说明三叶青提取物对 CTX的抑瘤作用无明显协同效果。
生物体在疾病状态下体内活性氧代谢有可能加强而使
H2O2、MDA和超氧阴离子自由基(O2 -)等发生累积。各种氧
自由基均能通过不同的方式使细胞膜遭受损害 , 从而加速细
胞的衰老和解体 , 如 H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核
酸 、蛋白质等生物大分子 ,多种氧自由基攻击生物膜中的多不
饱和脂肪酸而产生脂质过氧化物 MDA, MDA可以与蛋白质分
子的氨基发生作用导致多肽链的链内交联和链间交联 , 还能
与蛋白质的巯基反应 , 修饰了的蛋白质和酶将失去他们的生
物活性 , 导致代谢异常 , 甚至死亡 , 另外也可以引起膜蛋白共
价交联与聚合 , 使膜蛋白处于永久性缔合状态 , 严重限制了膜
蛋白在膜平面上的运动性 , 从而导致膜功能的异常。过氧化
氢酶(Catalase)属于血红蛋白酶 ,可以迅速清除细胞代谢过程
中产生的 H2O2 , 使之分解为水和分子氧(在此过程中 CAT起
传递电子的作用 , 既是氧化剂又是还原剂), 从而保护机体免
受 H2O2的损伤 ,是生物体内重要的酶促防御系统之一。 MDA
是脂质过氧化作用的最后产物 ,因此 MDA的含量常被用作脂
质过氧化的量度。 SOD是体内催化歧化反应的一种抗氧化保
护酶 , 对机体的氧化和抗氧化平衡起着重要的作用 ,它能清除
超氧阴离子自由基(O2 -)保护细胞免受损伤。
本次实验结果显示 ,肿瘤对照组与正常对照组相比 , 红细
胞 SOD活力和溶血液 CAT的活性分别降低了 27.3%和
41.5%,溶血液 MDA含量则升高了 88.4%, 说明小鼠荷瘤后
抗氧化酶活力明显降低 , 而脂质过氧化产物 MDA在血中明显
堆积。在清除 MDA作用中 , 三叶青提取物高剂量组 、CTX组
和联合组均能明显降低荷瘤小鼠体内的 MDA含量 , 但三者之
间的差别不明显;在改善 CAT酶活力方面 ,三叶青提取物低剂
量组 、高剂量组 、CTX组和联合组均能显著提高荷瘤小鼠溶血
液中 CAT的活性 ,但尤以三叶青提取物高剂量组和联合组作
用更为明显 , 说明三叶青提取物在改善荷瘤小鼠 CAT的活性
中起着更为重要的作用。三叶青提取物高剂量组和联合组荷
瘤小鼠血液中 SOD活性虽然在数值上远远高于肿瘤对照组 ,
但却无统计学意义 , 可能与其激活荷瘤小鼠体内 SOD酶系统
的作用较缓慢有关。
综上所述 , 三叶青提取物高剂量组的抑瘤率为 36.06%,
具有一定的抑瘤作用;CTX组与联合组的抑瘤率分别为
77.37%和 79.88%,两者之间的差异不大 , 说明三叶青提取物
对 CTX的抑瘤作用无明显协同作用。从实验结果初步推断其
抑瘤作用的机理可能与改善荷瘤小鼠机体的细胞免疫功能 ,
激活机体的抗氧化作用途径有关。
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(收稿日期:2008-10-08)
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