全 文 ：文章编号:1002-8110(2005)05-0088-02
浅议啤酒酵母的分离纯化
张玲玲
(黑龙江北大仓啤酒有限公司)
摘　要:针对酵母菌的性能对啤酒质量的稳定起到关键作用 , 论述了为稳定酵母菌的性能要定期进行的分离
纯化操作 , 并就几个主要的操作和控制指标进行了探讨。
关键词:啤酒;酵母菌;分离;纯化
中图分类号:TS261.1;TS262.5　　　　文献标识码:B
　　酵母菌属单细胞真菌 ,性状相对某些微生物来讲比较稳
定 ,但由于其保存或使用环境的营养 、温度 、水分等因素 , 做
不到始终是最适宜其生长繁殖 ,因此往往经过一段时间后易
产生一定程度的变异 ,会直接造成酵母发酵产物与副产物的
改变 ,从而影响产品的质量。所谓变异指生物体在某种外因
或内因的作用下 ,所引起的遗传物质结构或数量的改变。 特
点是原微生物的性能状态发生改变 , 群体中以极低的几率出
现 ,即针对某类微生物的菌落来讲 , 个体变异的几率极低 , 但
因酵母菌等微生物个体繁殖速度快 , 可稳定遗传等原因 , 变
异后的酵母菌会因大量繁殖而对啤酒的大生产造成不可估
量的损失 , 如影响到发酵度 、双乙酰还原 、酵母凝聚性 、发酵
副产物生成量 ,进而影响到啤酒的口感及风味。因此各啤酒
生产企业对该厂使用的酵母菌种都要定期分离纯化 , 以保证
啤酒质量的稳定。
在我厂进行酵母菌分离纯化所采用的菌株有两种来源 ,
一是原实验室保藏菌种(四株);二是大生产正使用的二 、三
代酵母菌种各两株 , 此时的菌种处于生命活动旺盛期 , 经几
代周转适应了发酵液的环境 ,各项性能指标都较好 , 因此被
选择在内。具体操作步骤如下:
收稿日期:2005-06-09
1　啤酒酵母菌的分离
1.1　菌悬液的制作
a.保藏菌株恢复活性:取斜面保藏菌种一菌环接入 5mL
麦汁培养基 20℃培养 24h(酵母在 20℃时同化氮源 、碳源能
力最强), 为使其活力恢复旺盛 , 从中吸 1mL 菌液转接入
10mL麦汁培养基继续培养 24h , 可重复 1-2 次直至保藏菌
种从休眠状态完全恢复到活力旺盛状态。
b.大生产使用菌株的处理:无菌锥型瓶到生产现场取高
泡期发酵液 ,于 0℃条件下静止 2d ,让酵母自行存优汰劣 , 取
底部酵母泥接入 10mL麦汁培养基 20℃培养 24h。将所制作
的 a、b 菌悬液 ,采用平板稀释分离法 , 即以 10 倍稀释法用无
菌生理盐水稀释 8次 , 以原菌悬液 5ⅸ108个/mL计稀释 7 次
为 5个/mL, 取第 6次 、第 7次稀释度的溶液每 1mL置于 1 个
无菌平皿中 ,第 8 次稀释因细胞浓度极低可取 3-4mL, 每个
浓度梯度取入 3-5个平皿 , 倒入麦芽琼脂培养基铺平 , 20℃
无菌环境培养 ,每天进行观察记录。
1.2　酵母菌的筛选
待菌落长至 2-3mm 时即可进行挑选 ,选择中等偏大且
丰满色白 、边缘整洁 、没有尖形突起的菌落进行镜检 , 确定没
被细菌污染 ,将其接种至麦芽汁培养基 , 为减少优良菌株的
漏选 ,共制作 30-50 个菌株的培养液 , 25℃培养 24h 待用。
与酚类化合物形成聚合物 ,引起酒液浑浊。硅藻土能吸附蛋
白质 , pvpp酰胺中的氢键能吸附于蛋白质胶链的多酚。所以
在成品酒过滤前 , 往酒液中添加这两种吸附剂 , 具有防止胶
体浑浊的作用。
4.5 　啤酒指标
感官指标:啤酒清澈透明 , 无悬浮物 , 具有啤酒特有的清
香和蔬菜香味 ,色泽呈棕黄色 , 泡沫细腻洁白 ,挂杯持久 。
理化指标:酒精 2%左右 , 原麦汁浓度为 8%, 色度:5 ～
12EBC , 双乙酰含量低于 0.1mg/ L。[ 4]
[ 参考文献]
[ 1] 高学本 ,李运成.曹州牡丹的研究开发与利用[ J] .农业系统科学
与综合研究 , 1991(7).
[ 2] 王开发.花粉营养成分与花粉资源利用[ J] .复旦大学出版社 ,
1993.
[ 3] 王秉谦 , 等.花粉食品生产技术[M] .济南:山东大学出版社 ,
1990.(6).
[ 4] 无锡轻工业学院.酿造酒工艺学[M] .北京:中国轻工业出版社 ,
1990.(6).
[ 5] 天津轻工业学院 .食品微生物[ M] .北京 :中国轻工业出版社 ,
1986.(5).
第 32卷　第5期
2 0 0 5 年 9 月　　　　　　　　　　　　　　　　　　
酿　　酒
LIQUORMAKING
　　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.32 , No.5
Sep., 　2005
1.3　酵母的纯化
对筛选后菌株采用平板分离法进行酵母纯化 , 即对筛选
后菌株制作的培养液再进行平板分离 , 重复操作 2-3 次效
果更好 ,即尽力达到单细胞形成菌落的效果。
2　啤酒酵母菌性能的测定及筛选
2.1　初选
此阶段对以上所制 30-50 个菌株进行筛选 ,进行两个指
标的鉴定保留优良的淘汰不好的菌株。
2.1.1　细胞形态观察与大小测定。从菌液中取样 , 于显微镜
下观察细胞形态 , 即短轴与长轴之比 , 出芽情况以及细胞大
小进行比较 ,淘汰与原菌相差过大的菌株。
2.1.2　降糖速度测定。 做简单发酵实验 , 测定降糖速度 , 淘
汰降糖速度过快或过慢的菌株 , 降糖过慢说明酵母有退化迹
象 ,而降糖过快不利于发酵液中双乙酰的还原 , 容易造成酒
体中双乙酰浓度偏高 , 延长主酵期 , 最终影响啤酒的风味和
保质期。
经过以上两步初选 , 淘汰近 2/3 的菌株 , 保留 10-15 个
菌株进入复选。
2.2　复选
此阶段对保留的菌株进行几个主要指标的测定 , 来达到
筛选出生产用性能优良菌株的作用。
2.2.1　酵母菌发酵能力的测定。仪器为发酵瓶 , 瓶口安装发
酵栓起止逆阀作用。将实验的菌株分别接种于 5mL 麦汁试
管中 25℃培养 24h ,用无菌吸管分别吸 0.5mL 发酵液接入装
有 300mL无菌麦汁的锥型瓶内 , 装上发酵栓(内装浓 H2SO4)
10℃培养。每天摇两次称重 , 直到两天减重小于 0.2g 为止 ,
把发酵液倒出进行品尝 , 测定总酸 、pH 、双乙酰等理化指标 ,
用此方法实验到7-8 代 ,淘汰发酵不正常 、双乙酰值高 、有异
酯味香的菌株 ,做此实验时要求有平行样品 , 即既有新筛选
出各菌株 ,又包括原生产用菌株 , 且各平行实验的麦汁成分 、
接种量 、温度等因素尽量保持一致 , 才有可比性。
2.2.2　酵母死灭温度的测定。死灭温度是指在一定时间内
使酵母死灭的最低温度。生产上的纯粹培养酵母其死灭温
度是一个恒定值。准备每个酵母菌株发酵旺盛期的发酵液 ,
取盛有 10mL灭菌麦汁的试管若干个 , 恒温在所需温度(一组
温度的梯度为 46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃)取其中一个
温度如 46℃,用无菌吸管分别吸 0.1mL发酵旺盛的酵母悬液
接入麦汁试管 ,该温度阶段菌株接 3 支试管 , 取其中一支插
入精密温度计作为测量温度用 , 酵母悬液接入后 , 于水浴中
达到该温度即开始计时 ,保温 10min之后取出冷却 ,同样再重
复其他温度的操作 , 做好标记 , 操作完毕所有温度阶段的试
管一同置于 25℃保温箱中培养一周 , 每日检查有无发酵现象
作好记录。 无发酵现象的最低温度即该试样的死灭温度。
记录各菌株的死灭温度 ,并与原生产用菌株死灭温度进行比
较 ,如果有所不同说明该菌株已发生变异或为野生酵母应淘
汰。
2.2.3　酵母凝聚力的测定。酵母的凝聚性对啤酒生产影响
很大 ,菌株凝聚力增强或减弱会直接关系到发酵副产物的改
变 、酵母的添加与排放 、酒液澄清过滤等 ,是一个很重要的指
标。测定酵母凝聚力的方法是:将待检测的酵母悬液各吸 0.
5mL置于 300mL麦汁发酵瓶中 25℃培养 7d ,取底部酵母泥装
于 50mL离心管中离心(3500r/ min)15min ,收集凝聚酵母 , 用无
菌水洗涤2-3 次。下面操作各做三个平行样 , 取离心出的酵
母泥准确称量 1g , 放于 15mL 刻度离心管中 , 加入 10mLpH 为
4.5的 CaSO4缓冲液(内含醋酸钠和醋酸), 摇匀使其呈悬浮
状态 , 20℃水浴中放置 20min , 再振动使酵母重新分散后静
止 ,观察酵母沉淀情况 , 一般将沉淀 10min 时酵母的体积称为
本斯值。记录此值并与生产用菌株进行比较 , 凝聚性较好的
酵母本斯值在 1.0mL以上。
经过发酵力 、死灭温度 、凝聚力的测定 ,筛选出 2-3 株较
理想的菌株 ,继续进行发酵实验 , 其他菌株被淘汰。
2.3　管式发酵器发酵实验
经过以上各步骤检测筛选出的菌株在发酵器内进行发
酵实验 , 它是模拟生产现场比较菌株进行发酵的全项指标 ,
观察其是否适合大生产。
经过无菌处理的管式发酵器接入无菌麦汁 ,将各菌株分
别接入每支管式发酵器内(接种量为 1.2ⅸ107-1.5ⅸ107 个/
mL)温度控制9-10℃发酵。每天测麦汁降糖 、总酸 、pH、酵母
细胞数 、酵母发芽率 、α-氨基氮 、双乙酰值等 , 发酵度在 58%
-60%之间时 , 从取样口取出嫩啤酒装入灭菌啤酒瓶 , 瓶口
用无菌纱布包好置于培养箱 , 温度控制如下:10℃3d(1d 后压
盖)※8℃2d※6℃2d※0℃7d , 然后进行口味品尝。 管式发酵
器内的酵母泥可以倒入无菌三角瓶里作为下一代使用 ,同上
方法一直试到7-8 代。最后筛选出一株降糖较快 , 双乙酰峰
值低且还原快 , α-氨基氮同化作用强 , 发酵度较高 , 凝聚性
适中的性能优良并且稳定的酵母菌 , 应用于大生产代替原生
产中的菌株。利用如上步骤分离纯化的啤酒酵母菌 , 具有原
菌种的各项优异性能 ,酿造出的啤酒质量稳定 , 口感纯正 、清
爽 、协调 ,保持了本厂独特的啤酒风味 , 对于啤酒生产具有重
大意义。
[ 参考文献]
[ 1] 杜绿君 ,袁惠民.啤酒酵母和微生物管理[M] .轻工业出版社.
[ 2] 郝庆山.啤酒微生物管理技术及风味稳定性[M] .中微啤酒科技
发展中心.
[ 3] 管敦仪.啤酒工艺手册[M] .
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·89·第 5期　　　　　　　　　　　　　张玲玲:浅议啤酒酵母的分离纯化