全 文 ：中 国 酿 造
2013年 第 32卷 第 10期
总第 259期
野生毛葡萄（Vitis quinquangularis Rehd）是广西特色
品种，与普通酿酒葡萄相比，其果实中白藜芦醇、花色苷等
功能性成分含量更高，适合用于酿造保健性能优良的特色
葡萄酒[1-2]。毛葡萄果实中的苹果酸含量极高，采用普通商
品活性干酵母发酵得到的葡萄酒原酒酸涩粗糙、口感不
佳，因此毛葡萄原酒通常需要经过降酸处理或与其他酒
类进行勾兑方可作为成品出售。
生产上常用的降酸方法包括物理降酸法、化学降酸
法和生物降酸法[3]。物理或化学法降酸容易破坏酒的风味
和稳定性，生物法降酸则主要是针对生理特性比较活跃的
苹果酸，该方法利用微生物的代谢活动分解苹果酸而达到
降酸目的。其中，苹果酸-乳酸发酵（malolactic fermentation，
MLF）是目前葡萄酒降酸的主流工艺，主导此种降酸过程
的微生物主要是乳酸菌类的明串珠菌属、乳杆菌属、片球
菌属和酒球菌属[4-7]。部分酵母类菌株（如粟酒裂殖酵母、解
苹果酸裂殖酵母和酿酒酵母等）也具有降解苹果酸的能
力，此类微生物主要通过苹果酸-乙醇发酵（maloalcoholic
fermentation，MAF）将苹果酸分解成乙醇和二氧化碳，从而
降低酒的酸度[8-11]。
本研究广泛收集广西都安、罗城、永福等野生毛葡萄
产地的土壤、毛葡萄果实和毛葡萄自然发酵醪，利用苹果
酸降解指示培养基快速筛选获取耐酸降酸酵母资源，并
对菌株的降酸特性进行了研究，以期为广西特色野生毛
葡萄酒生物降酸及菌种资源和微生物多样性的开发利用
野生毛葡萄产地来源耐酸降酸酵母的筛选鉴定及其特性研究
李 玮1,2，黄梅华2,3，易菊阳2,3，朱月莲2,3，张 劲1,2，曹慕明1,2，陈国品1,2，张 瑛1,2*
（1.广西农业科学院 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，广西 南宁 530007；
2.广西农业科学院 葡萄与葡萄酒研究所，广西南宁 530007；3.广西大学生命科学与技术学院，广西 南宁 530004）
摘 要：采用苹果酸降解指示培养基从野生毛葡萄产地来源土壤、毛葡萄果实和自然发酵醪中快速筛选苹果酸降解酵母菌，从946株
初筛酵母菌中获得3株苹果酸强降解酵母菌。经菌落形态、培养特征、生理生化特征以及分子生物学方法鉴定，分别命名为酿酒酵母
L3（Saccharomyces cerevisiae L3）、酿酒酵母Y1（Saccharomyces cerevisiae Y1）和解苹果酸裂殖酵母D2（Schizosaccharomyces malidevo-
rans D2）。降酸特性试验结果表明，3株菌均能有效降解苹果酸，其中酿酒酵母L3的降解率达到86.4%。实验结果为实现毛葡萄酒一步
发酵产酒和降酸提供了优良酵母资源。
关 键 词：毛葡萄；生物降酸；酵母菌；筛选鉴定
中图分类号：TS261.1 文献标识码：A 文章编号：0254-5071（2013）10-0031-04
Screening, identification and characterization of yeast with deacidification ability from
wild Vitis quinquangularis Rehd production areas
LI Wei1,2, HUANG Meihua2,3, YI Juyang2,3, ZHU Yuelian2,3, ZHANG Jin1,2, CAO Muming1,2, CHEN Guopin1,2, ZHANG Ying1,2*
(1.Guangxi Key Lab of Crop Genetic Improvement and Biotechnology, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007, China;
2.Viticulture and Wine Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007, China;
3.College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China)
Abstract: Rapid screening of yeast with malic acid degradation ability using malic acid degradation indicator plates from soil, grape fruit and natural
fermented mash of Vitis quinquangularis Rehd production areas was carried out. Three strains with strong malic acid degradation ability were ob-
tained from 946 isolates, which named Saccharomyces cerevisiae L3, S. cerevisiae Y1 and Schizosaccharomyces malidevorans D2 by colonies mor-
phology, cultural characteristics, physiological and biochemical characteristics and molecular biological identification. Deacidification characteristic
test results showed that the yeasts could effectively degrade malic acid, and the degradation rate of S. cerevisiae L3 reach 86.4%. These results pro-
vided excellent yeast resources for the realization of one step fermentation of wine production and deacidification.
Key words: Vitis quinquangularis Rehd; deacidification; yeast; screening and identification
收稿日期：2013-08-17
基金项目：广西科技攻关项目（桂科攻1123003-5A）；广西大学行建学院科研基金项目（2013GXNSFBA019074）；广西农业科学院科技发展基
金和基本科研业务费项目（桂农科2013JZ05）
作者简介：李 玮（1984-），男，助理研究员，博士，研究方向为微生物工程。
*通讯作者：张 瑛（1974-），女，副研究员，硕士，研究方向为葡萄育种与栽培。
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China Brewing
2013 Vol.32 No．10
Serial No．259
提供支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
广西都安、罗城、永福等野生毛葡萄产地的土壤、毛葡
萄果实和毛葡萄自然发酵醪。
富集培养基[12]：葡萄糖 5%、KH2PO4 0.25%、尿素 0.1%、
酵母膏 0.05%、MgSO4 0.1%、Fe2（SO4）3 0.01%、孟加拉红
（1%的水溶液）0.023%，自然pH值，115℃高压蒸汽灭菌
30min。
分离保藏培养基（yeast extract peptone dextrose medi-
um，YPD培养基）：葡萄糖 2%，蛋白胨 2%，酵母粉 1%，自
然pH值，添加1.5%琼脂为固体培养基，115℃高压蒸汽灭
菌30min。
苹果酸降解指示培养基[13]：酵母氮源（yeast nitrogen base，
YNB）2mL，YPD3mL，（NH4）2SO40.5%，苹果酸0.3%，葡萄糖
2%，琼脂1.2%，溴酚兰指示剂1mL，蒸馏水定容至100mL，pH
值3.8，115℃高压蒸汽灭菌30min。其中，溴酚兰指示剂：0.1g
溴酚兰，加入0.2mol/LNaOH7.45mL，蒸馏水稀释至250mL。
苹果酸降解测试培养基[13]：酵母粉 0.5%，蛋白胨1%，葡
萄糖0.2%，毛葡萄汁20mL/L，L-苹果酸0.3%，MnSO4·4H2O
0.005%，乙醇11%vol，pH值为3.2。
酵母菌生理生化测试所需实验材料[14]。
1.2 仪器与设备
METTLER TOLEDO PL303精密电子天平：德国ME-
TTLER公司；SKJH-1109超净工作台：上海苏坤实业有限公
司；SPX-250生化培养箱：上海跃进医疗器械厂；SKY-211B
恒温摇床：上海苏坤实业有限公司；HVE-50高压灭菌锅：
日本HIRAYAMA公司；OLYMPUS CX41光学显微镜：日
本OLYMPUS公司；Biometra T1 PCR仪：德国Biometra公司；
MINI-SUBCELLGT水平电泳仪：美国Bio-Rad公司；G：BOX
凝胶成像系统：香港基因有限公司；LC-10AT高效液相色谱
仪：日本SHIMADZU公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品预处理
称取5g土壤或毛葡萄果实样品于250mL三角瓶中，加
入 30mL生理盐水和数粒玻璃珠，25℃、160r/min振荡
30min，取出静置30min备用。
1.3.2 菌株分离、筛选
富集培养：取预处理上清液或毛葡萄自然发酵醪5mL，
接入装有50mL富集培养基的 250mL三角瓶中，25℃、
160r/min振荡培养24h。
平板快速分离：取富集培养液梯度稀释，均匀涂布于
YPD培养基上，25℃恒温培养，待培养基长出菌落后，在其
上倾倒一层苹果酸降解指示培养基，25℃恒温培养，挑取
蓝色单菌落进行纯化、保存于试管斜面备用。
复筛：将保存的平板分离单菌落挑取一环于装有
30mL YPD培养基的250mL三角瓶中，25℃、160r/min振荡
培养20h作为种子液。以5%接种量将菌株接入装有50mL
苹果酸降解测试培养基的250mL三角瓶中，25℃恒温静置
培养4d，检测苹果酸残余量，选取具有显著苹果酸降解能
力的菌株作为目标菌株。
1.3.3 菌株鉴定
方法参照真菌鉴定手册，包括菌体培养特征和显微形
态观察，生理生化测试[14-15]。26S rDNA鉴定采用试剂盒进
行（Universal Genomic DNA Extraction Kit、TaKaRa Fungi
Identification PCR Kit和TaKaRa DNA Fragment purifica-
tion Kit，TaKaRa大连宝生物工程有限公司），测序工作由生
工生物工程（上海）股份有限公司完成。
1.3.4 耐酸降酸特性检测
将待测降酸菌株接入成熟毛葡萄酒中，25℃恒温静置
发酵，测定苹果酸、酒石酸、柠檬酸等有机酸和总酸含量变
化，以降酸能力对待测菌株降酸特性进行评判。
1.3.5 分析方法
有机酸定量测定方法参照GB/T 5009.157—2003《食品
中有机酸的测定》[16]。
2 结果与分析
2.1 降酸菌株分离和筛选
2.1.1 平板快速分离
从广西都安、罗城、永福等野生毛葡萄产地收集土壤、
毛葡萄果实和自然发酵醪样品30份，经过富集培养和苹果
酸降解指示培养基快速筛选，共分离得到酵母菌946株，其
中初步确定具有苹果酸降解能力的蓝色单菌落共177株见
表1。
由表1可知，来源于3个野生毛葡萄产地的土壤和自然
发酵醪样品中酵母总菌数均显著多于毛葡萄果实样品中
酵母总菌数。3个地区苹果酸降解菌的分布情况相同，土
壤样品中最多；而自然发酵醪中由于大量优势酿酒酵母存
在，苹果酸降解菌则相对较少。
表1 平板分离结果
Table 1 Results of plates isolation
来源 分离材料 酵母总菌数/个 蓝色菌落数/个 分离率/%
都安 土壤 118 36 30.5
果实 62 15 24.2
发酵醪 136 9 6.6
罗城 土壤 129 42 32.6
果实 55 12 21.8
发酵醪 142 11 7.7
永福 土壤 108 29 26.9
果实 66 15 22.7
发酵醪 130 8 6.2
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2.1.2 苹果酸降酸菌株复筛
将平板分离初筛获得的177株苹果酸降酸菌株接入苹
果酸降解测试培养基中，25℃恒温静置培养4d后检测苹果
酸残余量。结果显示，90%的菌株具有不同程度的苹果酸
降解能力，说明利用苹果酸降解指示培养基进行苹果酸降
解菌的快速筛选是可行的。10株苹果酸降解菌株的复筛
结果见图1。由图1可知，苹果酸下降了54.5%~83.7%，其中，
菌株L3、D2、Y1降酸能力最强，以其处理过的苹果酸降解测
试培养基，苹果酸分别下降了83.7%、82.6%、77.3%。因此，
选取L3、D2和Y1菌株作为目标菌株进行下一步实验。
2.2 菌株鉴定
2.2.1 菌落形态与培养特征
根据参考文献报道[14]，将菌株L3、D2、Y1于10°Bx麦芽
汁液体或固体培养基中，20℃恒温静置培养，观察菌落形态
和培养特征，结果见表2。由表2可知，菌株L3和Y1的菌落
形态和培养特征相似，而菌株D2差异较大，菌落表面无光
泽，菌体细胞呈椭圆形，无性繁殖为裂殖。
2.2.2 生理生化特征
菌株L3、D2、Y1的生理生化特征鉴定见表3。由表3可
知，碳源同化实验表明在D2和L3、Y1在麦芽糖和柠檬酸
同化上存在差异，而其他生理生化特征均相同。3株菌株
均能在强酸高糖环境中生长。
2.2.3 分子生物学鉴定（26S rDNA序列分析）
采用Blast同源序列比对分析对菌株L3、D2、Y1进行
分子生物学鉴定，结果显示L3和Y1与酿酒酵母具有高度同
源性，相似度达99%，D2与解苹果酸裂殖酵母具有高度同
源性，相似度达99%。结合菌体形态、培养特征以及生理生
化特征，确定L3和Y1为酿酒酵母，分别命名为酿酒酵母L3
（Saccharomyces cerevisiae L3）和酿酒酵母Y1（Saccharo-
myces cerevisiae Y1）；D2为裂殖酵母，命名为解苹果酸裂
殖酵母D2（Schizosaccharomyces sp. D2）。
2.3 降酸特性试验
将菌株L3、D2、Y1分别接入成熟毛葡萄酒中，25℃恒
温静置发酵，测定有机酸和总酸含量变化，结果见表4所
示。由表4可知，3株菌对有机酸降解情况相似，均能有效
图1 苹果酸降酸菌株复筛
Fig. 1 Rescreening of malic acid degradation strains
表2 菌落形态与培养特征
Table 2 Colonies morphology and cultural characteristics
菌株 L3 D2 Y1
菌落 颜色 乳白色 乳白色 乳白色
质地 黏稠 黏稠 黏稠
表面 光滑 无光泽 光滑
边缘 平滑透明 平滑暗淡 平滑透明
液体 澄清度 澄清 澄清 澄清
培养 沉淀物 白色 白色 白色
菌醭 无无 无 无
细胞形状 卵圆形 椭圆形 卵圆形
繁殖方式 芽殖 裂殖 芽殖
表4 菌株在毛葡萄酒中降酸特性试验结果
Table 4 Results of deacidification ability test about yeast strains
in the Vitis quinquangularis Rehd wine
g/L
处理 草酸 酒石酸 苹果酸 乙酸 柠檬酸 琥珀酸 总酸
原酒 0.13 2.37 8.72 0.18 0.56 0.35 12.31±0.12
L3处理 0.11 2.35 1.19 0.19 0.42 0.35 4.61±0.08
D2处理 0.12 2.38 1.68 0.18 0.45 0.34 5.15±0.09
Y1处理 0.11 2.36 2.13 0.18 0.43 0.35 5.56±0.09
表3 生理生化特征
Table 3 Physiological and biochemical characteristics
项目 L3 D2 Y1 项目 L3 D2 Y1
碳源同化 氮源同化
葡萄糖 + + + 硫酸铵 + + +
麦芽糖 + - + 硝酸钾 - - -
乳糖 - - - 尿素 + + +
半乳糖 + + + 糖类发酵
蔗糖 + + + 葡萄糖 + + +
阿拉伯糖 + + + 麦芽糖 + - +
棉籽糖 + + + 半乳糖 + + +
L-山梨糖 - - - 蔗糖 + + +
鼠李糖 - - - 阿拉伯糖 + + +
纤维二糖 - - - 棉籽糖 + + +
蜜二糖 - - - 其他
柠檬酸 - + - 无维生素生长 + + +
琥珀酸 - - - 产淀粉实验 - - -
甘油 - - - 耐温42℃ + + +
肌醇 - - - 耐酸（pH 1.5） + + +
可溶性淀粉 + + + 耐糖（60%） + + +
注：“+”表示生长；“-”表示不生长。
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降解苹果酸，对柠檬酸也有轻微降解效果，基本不降解草
酸、酒石酸、乙酸和琥珀酸。其中，酿酒酵母L3降解苹果酸
能力最强，降解率达到86.4%。结果表明，酿酒酵母L3是一
株苹果酸降解能力强的优良降酸酵母。
3 结论
目前，关于毛葡萄酒降酸工艺的研究主要集中于苹果
酸-乳酸发酵技术，通过乳酸菌类微生物对酒体进行二次
发酵将酸味尖锐的苹果酸转化成口感柔和的乳酸，从而
降低酒体酸度的效果，该工艺存在发酵过程难以控制，周
期长等缺点。通过分离筛选具有优良降酸性能的酵母菌
株，将其与产酒精能力优良的酵母菌株通过生物技术手
段构建成强降酸毛葡萄酒专用酿酒酵母重组菌株，使其
兼具高产酒精和强降酸能力，实现毛葡萄酒一步发酵产酒
和降酸，是葡萄酒生物降酸的另一种技术路线。
通过广泛收集广西都安、罗城、永福等野生毛葡萄产
地的土壤、毛葡萄果实和毛葡萄自然发酵醪，利用苹果酸
降解指示培养基快速筛选获取了一系列优良降酸野生酵
母菌株。其中，菌株L3、D2、Y1降酸能力最强，经菌落形态、
培养特征、生理生化特征以及分子生物学鉴定，L3和Y1为
酿酒酵母，D2为解苹果酸裂殖酵母。降酸特性试验结果表
明，3株菌均能有效降解苹果酸，酿酒酵母L3的降解率达
到86.4%。实验首次对南方葡萄产地的酵母资源进行开
发，为毛葡萄酒生物降酸提供了优良酵母资源，同时也为
构建强降酸毛葡萄酒专用酿酒酵母重组菌株，实现毛葡萄
酒一步发酵产酒和降酸奠定了基础。
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笠广告笠
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