全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2011，23:820-823
文章编号:1001-6880(2011)05-0820-04
收稿日期:2010-09-30 接受日期:2011-01-26
基金项目:国家自然科学基金(31070386，21102154) ;中国科学院
兰州化学物理研究所优秀人才计划项目(080423SYR1)，甘
肃省科技支撑计划-社会发展类项目(1011FKCA128)
* 通讯作者 E-mail:bqin@ licp． cas． cn
红车轴草中(6aR，11aR)-三叶豆紫檀苷对
马铃薯腐烂茎线虫的麻醉活性研究
徐 蕊1，金 辉1，刘 权1，燕志强1，崔海燕1，秦 波1，2*
1中国科学院兰州化学物理研究所中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室 甘肃省天然药物重点实验室;
2兰州大学功能有机分子化学国家重点实验室，兰州 730000
摘 要:从红车轴草(Trifolium pratense L．)根乙醇提取物中分离得到了黄酮苷类化合物(6aR，11aR)-三叶豆紫
檀苷，并运用核磁共振波谱学技术鉴定了其化学结构。采用实验室活体生物试验方法，研究了(6aR，11aR)-三
叶豆紫檀苷对马铃薯腐烂茎线虫的麻醉活性。结果表明，该化合物对马铃薯腐烂茎线虫二龄幼虫有一定的麻
醉活性，麻醉作用的强度与其浓度及作用时间密切相关。
关键词:红车轴草;(6aR，11aR)-三叶豆紫檀苷;马铃薯腐烂茎线虫;麻醉活性
中图分类号:Q949． 96 文献标识码:A
Anesthetic Activity of (6aR，11aR)-Trifolirhizin from Trifolium
pratense to Ditylenchus destructor
XU Rui1，JIN Hui1，LIU Quan1，YAN Zhi-qiang1，CUI Hai-yan1，QIN Bo1，2*
1Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources and Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu
Province，Lanzhou Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730000;2State Key Laboratory of
Applied Organic Chemistry，Lanzhou University，Lanzhou 730000
Abstract:(6aR，11aR)-Trifolirhizin was isolated and purified from the root extracts of Trifolium pratense and structurally
characterized mainly by NMR spectra． Its anesthetic activity was tested by bioassay methods with the juvenile stage 2
(J2)nematodes． The results showed that (6aR，11aR)-trifolirhizin had anesthetic effect on Ditylenchus destructor，and
the anesthetic activity had close relationship with its treated concentrations and time．
Key words:Trifolium pratense L．;Ditylenchus destructor;(6aR，11aR)-Trifolirhizin;anesthetic activity
全球范围内，几乎所有农作物都受到线虫的侵
染，素有“隐蔽敌害”之称的植物寄生线虫更是成为
世界第三大农业生物灾害［1］。马铃薯腐烂茎线虫
(Ditylenchus destructor Thorne)即是一种常见的迁移
性内寄生线虫，分布于欧、美、亚洲等地区，在我国主
要分布于山东、河北、河南、江苏、安徽、北京等多个
省市，分布区域广，是导致甘薯茎线虫病的病原线虫
［2，3］。此外，还可侵染当归、薄荷、马铃薯等多达 100
多种植物［4，5］。其适应能力强，发病率高，传播范围
广;仅以甘薯为例，一般发病田块减产 20% ～ 50%，
重病田块基本绝产无收，给农业生产造成经济损失
十分严重［6］。
红车轴草(Trifolium pratense L．)为豆科车轴草
属多年生草本植物［7］，我国南北各地均有栽培或野
生，植物资源丰富。红车轴草富含黄酮类次生代谢
物，其中异黄酮因有植物雌激素样作用和黄酮类物
质的抗癌作用而格外受人关注［8］。此外，近代研究
表明，黄酮类化合物是一类具有明显杀虫活性的化
合物［9］，比如以二氢异黄酮类化合物鱼藤酮作为效
果显著的生物源农药，现已成功开发为农业杀虫
剂［10］。然而，红车轴草中黄酮类化合物对线虫的生
物活性尚未见有研究报道。本文以马铃薯腐烂茎线
虫为活性试验受体，对红车轴草根提取分离鉴定的
(6aR，11aR)-三叶豆紫檀苷对线虫的麻醉活性进行
了研究，为探寻具有线虫麻醉活性的天然化合物奠
定理论基础。
DOI:10.16333/j.1001-6880.2011.05.006
1 材料与方法
1． 1 试验材料
供体植物:红车轴草(Trifolium pratense)植物根
部于 2009 年 10 月采集于甘肃省定西市岷县，由兰
州大学生命科学院植物及植物生理研究所蒲训副教
授鉴定。供试线虫:马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus
Destructor) ，分离自河北省保定市甘薯田发生甘薯茎
线虫病的薯块，由南京农业大学植物保护学院林茂
松教授鉴定。
1． 2 仪器与试剂
旋转蒸发仪 SW-CJ-2G(瑞士 Buchi公司)、循环
水式多用真空泵(上海豫康公司)、恒温恒湿培养箱
(武汉瑞华公司)、超净工作台(苏州净化公司) ，恒
温摇床(武汉瑞华公司) ，倒置显微镜(上海光学仪
器厂)。柱层析用硅胶(200 ～ 300 目)由青岛海洋化
工厂生产，薄层色谱用硅胶板 GF254(0． 20 ～ 0． 25
mm，青岛海洋化工厂出品)。显色剂为 5%硫酸乙
醇溶液，加热显色。1H 和13 C NMR 谱在氘代溶剂
(DMSO-d6)中用 Varian Mercury-400BB 超导核磁共
振仪测定，以 TMS为内标。实验中所用的试剂均为
分析纯。
1． 3 试验方法
1． 3． 1 线虫的分离［11］
将马铃薯腐烂茎线虫危害的甘薯病块自来水冲
洗，撕成小块，采用贝尔曼漏斗分离法提取虫体，待
其自然沉降后，用竹丝将马铃薯茎线虫挑出，冲洗，
收集。将分离收集到的线虫用无菌水洗出，冲入无
菌指型管中，之后用 0． 5%的次氯酸钠消毒 2 min，
无菌水冲洗 3 遍后，定容到一定体积放置于 4 ℃冰
箱中保存备用。
1． 3． 2 线虫的培养
在直径为 9 cm 的培养皿中加入约 20 mL PDA
固体培养基，接入茄腐镰刀菌(Fusarium solani) ，于
25 ℃恒温箱中暗培养。待菌丝长满整个培养皿后，
在培养基中央刻一小口，加入表面消毒过的马铃薯
茎线虫约 500 条。将培养皿用封口膜包好，正置放
入 25 ℃恒温箱中暗培养。接种培养 2 ～ 3 d 后将培
养皿倒置，继续培养 20 ～ 30 d 左右，用无菌水将培
养皿皿盖上的线虫悬浮，置于显微镜下，观察浓度及
虫龄，准确选取 2 龄幼虫(简称 J2) ，供测试用。
1． 3． 3 红车轴草根提取物中(6aR，11aR)-三叶豆
紫檀苷的分离
将红车轴草根干燥样品进行粉碎，取粗粉 500 g
置于广口瓶内，95%乙醇中浸泡过夜，以渗漉法提
取，渗漉液减压浓缩，得乙醇浸膏。乙醇浸膏以
20%乙醇-水液悬浮，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯
于室温下分别连续萃取 5 次，合并萃取液，减压浓
缩，依次制得红车轴草根的石油醚、氯仿、乙酸乙酯
及水相萃取浸膏，待试验用。
将乙酸乙酯萃取浸膏 44． 6 g 上硅胶柱(200 ～
300目，10 ×110 cm)，以氯仿和甲醇(100∶ 1 ～100∶ 100)
梯度依次洗脱，通过薄层色谱检测，合并相近组分，
得到 12 个组分，记作Ⅰ ～Ⅻ。将洗脱至 85∶ 15 时得
到的组分Ⅷ，经甲醇重结晶后，得到白色粉末状化合
物 1． 6 g，利用现代波谱分析技术及文献对照［11］，确
定为(6aR，11aR)-三叶豆紫檀苷( (6aR，11aR)-tri-
folirhizin，1． 6 g)。
1． 3． 4 麻醉活性测定
(6aR，11aR)-三叶豆紫檀苷二甲基亚砜(DM-
SO)溶液与虫样液共混，直接接触进行试验。紫檀
苷加入二甲基亚砜(DMSO)溶解，制成浓度为 40
mg /mL的母液，将上述母液于无菌滤膜过滤，分别
稀释至 20、10、5、2． 5 mg /mL，于 24 孔板中每孔加入
一定浓度的线虫悬浮液 495 μL 及上述试验样品的
五个浓度梯度溶液各 5μL(稀释母液 100 倍) ，即试
验样品在 24 孔板中的最终试验浓度依次为 25、50、
100、200、400 μg /mL 五个梯度。每个浓度重复四
次，以相同比例的 DMSO 作为对照。摇床(180 rpm，
2 min)混合均匀后，置于温度为 25 ℃、湿度为 50%
～60%的培养箱中暗培养。每处理设 6 组重复，每
重复 80 ～ 140 条线虫，以相同比例的 DMSO 作为对
照。处理后 1、4、8、12、16、20、24 h 分别记录各处理
组线虫的麻醉比率。计算公式如下:
线虫校正麻醉率(%)=
处理组线虫麻醉率 －对照组线虫麻醉率
1 －对照组线虫麻醉率
× 100
1． 4 数据处理
采用 Excel 2007 和 DPS 9． 5 软件对试验数据进
行整理和统计分析。数据用 x ± s 表示，同一时间点
五个不同处理浓度的校正麻醉率相互间的显著性差
异用 Duncan’s新复极差法进行统计。
2 结果与分析
2． 1 (6aR，11aR)-三叶豆紫檀苷的分离与结构鉴定
红车轴草根乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物经过
128Vol. 23 徐 蕊等:红车轴草中(6aR，11aR)-三叶豆紫檀苷对马铃薯腐烂茎线虫的麻醉活性研究
反复硅胶柱层析，甲醇重结晶，得到白色粉末状固体
1． 6 g，在 254 nm 处强吸收。以 DMSO-d6 为溶剂，运
用1H 和13C NMR谱对其结构进行了鉴定，数据如下:
1H NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ:7． 38(1H，d，J
= 8． 4 Hz，H-1) ，6． 91(1H，s，H-7) ，6． 74(1H，dd，J
= 8． 4，2． 3 Hz，H-2) ，6． 57(1H，d，J = 2． 3 Hz) ，6． 41
(1H，s，H-10) ，5． 93(1H，s，C8，9-OCH2O-) ，5． 90
(1H，s，C8，9-OCH2O-) ，5． 54(1H，d，J = 7． 2 Hz，H-
11a) ，4． 94(1H，d，J = 7． 6 Hz，H-1) ，4． 28(1H，dd，J
= 10． 8，4． 4 Hz，H-6eq) ，3． 64 ～ 3． 69(1H，m，H-
6a) ，3． 44(1H，m，H-6ax) ;13 C NMR(DMSO-d6，400
MHz)δ:159． 8(C-3，s) ，157． 4(C-4a，d) ，155． 1(C-
10a，s) ，148． 9(C-9，s) ，142． 5(C-8，s) ，132． 8(C-1，
d) ，119． 3(C-7a，s) ，115． 3(C-11b，s) ，111． 3(C-2，
d) ，105． 9(C-7，d) ，105． 2(C-4，d) ，93． 9(C-10，d) ，
102． 1(-OCH2O-)，77． 8(C-11a，d)，66． 9 (C-6，t)，41． 1
(C-6a，d)，101． 7(C-1，d)，79． 1(C-5，d)，77． 7(C-3，
d)，74． 6(C-2，d)，71． 2(C-4，d)，62． 5(C-6，t)。
通过与文献［12］对照，鉴定该化合物为(6aR，
11aR)-三叶豆紫檀苷，结构如下:
图 1 (6aR，11aR)-三叶豆紫檀苷结构式
Fig. 1 The structure of (6aR，11aR)-trifolirhizin
2． 2 (6aR，11aR)-三叶豆紫檀苷对马铃薯茎线虫
室内麻醉活性测定结果
精确称取(6aR，11aR)-三叶豆紫檀苷减压干燥
样品溶于 DMSO 中制成样品母液。试验时以适量
DMSO溶解后，稀释成浓度分别为 25、50、100、200、
400 μg /mL的试液，对马铃薯腐烂茎线虫进行室内
生物活性测定。试验中设与试验药液相应浓度的
DMSO作为对照，(6aR，11aR)-三叶豆紫檀苷对马铃
薯腐烂茎线虫室内麻醉活性试验结果见表 1。
表 1 (6aR，11aR)-三叶豆紫檀苷对马铃薯腐烂茎线虫室内校正麻醉活性测定
Table 1 Anesthetic activity of (6aR，11aR)-trifolirhizin to D． Destructor
处理后时间
Treatments
校正麻醉率 Adjusted anesthesia rate (%)
25 (μg /mL) 50 (μg /mL) 100 (μg /mL) 200 (μg /mL) 400 (μg /mL)
1 h 1． 07 ± 0． 34aA 3． 45 ± 0． 43aA 5． 51 ± 1． 36aA 5． 52 ± 0． 83aA 6． 14 ± 0． 88aA
4 h 2． 58 ± 0． 78bA 5． 47 ± 0． 86abA 9． 57 ± 0． 94aA 9． 68 ± 1． 04aA 11． 51 ± 2． 02aA
8 h 3． 55 ± 0． 68bB 5． 59 ± 0． 72bB 9． 35 ± 0． 53bB 10． 30 ± 1． 38bB 20． 13 ± 1． 85aA
12 h 6． 58 ± 1． 23cB 8． 15 ± 0． 87cB 11． 54 ± 3． 59bcB 20． 43 ± 2． 08abA 26． 06 ± 2． 96aA
16 h 8． 76 ± 1． 54bB 11． 08 ± 1． 29bB 15． 92 ± 2． 08bAB 13． 05 ± 0． 61bB 25． 03 ± 2． 84aA
20 h 11． 14 ± 1． 14aA 12． 73 ± 2． 79aA 16． 86 ± 2． 92aA 15． 41 ± 1． 20aA 20． 55 ± 1． 20aA
24 h 4． 88 ± 0． 80aA 6． 01 ± 0． 72aA 6． 97 ± 1． 14aA 11． 70 ± 2． 24aA 14． 08 ± 2． 80aA
注:a，b，c表示 P ＜ 0． 05;A，B表示 P ＜ 0． 01。Note:a，b，c means P ＜ 0． 05;A，B means P ＜ 0． 01．
由表 1 可以看出，处理后 1、4、8、12、16、20、24 h
后，不同浓度的(6aR，11aR)-三叶豆紫檀苷对马铃
薯腐烂茎线虫均表现出不同程度的麻痹活性，浓度
越高，对马铃薯腐烂茎线虫的麻醉作用越明显。如
处理后 12 h，400 μg /mL 处理组的校正麻醉率与
200 μg /mL 处理组的校正麻醉率相比差异显著(P
＜ 0． 05) ，而与 25、50 μg /mL 及 100 μg /mL 处理组
的校正麻醉率相比差异极其显著(P ＜ 0． 01) ，其中，
400 μg /mL 处理组的校正麻醉率最高，达到
26. 06%。同一测定时间，添加(6aR，11aR)-三叶豆
紫檀苷的浓度与马铃薯腐烂茎线虫校正麻醉率的线
性回归方程见表 2。实验结果表明，药液浓度与马
铃薯腐烂茎线虫的校正麻醉率间呈正相关，具有良
好的量效关系。
表 2 (6aR，11aR)-三叶豆紫檀苷对马铃薯茎线虫的毒力测
定
Table 2 Toxicity of (6aR，11aR)-trifolirhizin to D． Destructor
时间
Time
毒力回归方程
Regression equation
相关系数
Correlation
1h y = 1． 2192x + 0． 6805 0． 8518
4h y = 2． 2071x + 1． 1407 0． 9172
8h y = 3． 7876x － 1． 58 0． 8745
12h y = 5． 1227x － 0． 8145 0． 9356
16h y = 3． 4513x + 4． 4151 0． 7479
20h y = 2． 1515x + 8． 8849 0． 8574
24h y = 2． 4075x + 1． 506 0． 9245
228 天然产物研究与开发 Vol. 23
另外，紫檀苷浓度越高，达到最大麻醉比率的时
间越短(图 2)。就浓度 25 μg /mL 和 50 μg /mL 而
言，最高麻醉率出现在 20 h;浓度为 100 μg /mL 时，
最高麻醉率出现在 16 h，当浓度加至 200 μg /mL 和
400 μg /mL时，在 12 h 就出现了麻醉率的最高值。
随着处理时间的延长，马铃薯腐烂茎线虫的麻醉率
会逐渐下降，当线虫重新苏醒后，活动能力不会降低，
紫檀苷浓度不同，麻醉率下降的速率也有所不同。
图 2 (6aR，11aR)-三叶豆紫檀苷对马铃薯腐烂茎线虫的
麻醉活性比较
Fig. 2 Anesthetic activity of (6aR，11aR)-trifolirhizin to D．
Destructor at different treated time
3 讨论
长期以来，化学类杀虫剂在取得防治线虫危害
的同时，也带来了环境污染、生态平衡受到破坏以及
农药残留等诸多问题，从自然界植物中寻找功效卓
越而副作用小的植物源杀线虫剂，已成为解决上述
问题的突破口。
(6aR，11aR)-三叶豆紫檀苷属二氢异黄酮类化
合物，本文研究结果表明，该化合物对马铃薯腐烂茎
线虫具有良好的麻醉活性，且浓度较高的条件下可
以快速达到最佳的麻醉效果。一旦线虫被麻醉，它
的取食、发育以及繁殖行为都会受到影响［13］，从而
在不破坏生态平衡的条件下，达到防治线虫的目的。
在农作物的播种期及生长期均可使用此类具有麻醉
功效的杀虫剂，且可以与其他药剂复配和混用，以达
到更好的防治增产效果。同时，(6aR，11aR)-三叶
豆紫檀苷在红车轴草根中含量较高，而红车轴草在
我国南北各地均有野生和大面积栽培，植物资源非
常丰富，因此，(6aR，11aR)-三叶豆紫檀苷对线虫麻
醉剂的开发和应用具有较好前景。
致 谢:感谢兰州大学生命科学院植物及植物
生理研究所蒲训副教授对供试植物的鉴定以及南京
农业大学植物保护学院林茂松教授对供试线虫的鉴
定。
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