全 文 ：i , , 1 年 1 5 ( 5 ) 微 生 物 学 通 报
啤酒酵母和产阮假丝酵母属间原生质体融合子的筛选
袁 志 明
(中科院武汉病毒研究所 , 武汉 )
摘要 利用不可逆生化抑制剂碘乙酸抑制一亲株细胞的生理活性和利用两亲株细胞间生理性状的
差异性 , 进行啤酒酵母 ( s a c c h a r o 。 , e o s c o r , “ i“ a 。 ) 和产阮假丝酵母 ( C a o d i d。 , , ` l ` s ) 原生质体融合
子的筛选 ,属间原生质休融合率为 3 . 4 7 x l 0一 ` 。 经菌落形态比较 ,碳化合物的同化和发酵 , D N A 含盈侧
定 ,酉旨酶型分析 ,细胞核染色 ,产抱试验和自然的核分离实验证明 , 融合子分三种类型 : 8 7 . 21 % 产阮假
丝醉母型 ; , . 02 % 啤酒酵母型 ; 3 . ” 肠 真正核融合子型 。
关键词 原生质体融合 ; 啤酒酵母 ;产阮假丝酵母 ;生化抑制剂
近年来 , 人们对利用原生质体融合技术对
醉母菌遗传育种进行了广泛的研究 , 获得了一
些稳定的种间和属间融合子 。 但在原生质体灼
融合实验中 , 两亲株 的原 生 质体 在 PE G 和
aC
十 + 的作用下 , 只有少数细胞会发生融合形成
异核体 ,最终经核融合导致融合子的形成 , 因此
必须选择适当的方法将融合子从众多的亲本细
胞中筛选出来 。 目前采用营养缺陷型互补 , 线粒
体基因标记及采用紫外线或高温杀死一亲本细
胞的方法作为选择融合子的标记 。 这些方法有
的虽被广泛采用 , 但缺点很多。 营养缺陷型的
筛选不仅费时 、 困难 , 而且自发回复实变往往会
影响结果 , 甚至导致工业生产菌株的生产性能
明显下降 , 严重阻碍了原生质体融合产物在工
业生产上的应用 。 因此必须找 到其它适当 、 有
效的方法进行原生质体融合子的筛选。
w
r i g ht 山 首次采用不可逆生化 抑制 剂处
理细胞不 可逆抑制细胞的生理活性作为动物细
胞融合的选择性标记获得成功 。 以后 , N e hl s切
又将此法引人到植物原生质体的融合中。 在酵
母原生质体融合中也作了这方面的研究 , 获得
了真正的核融合子 3[] 。 本文进一步探讨了用不
可逆生化抑制剂碘乙酸不可逆抑制某一亲株细
抱酶活性和两亲株细胞间生理性状的差异作为
酵母菌属间原生质休融合的筛 选 系统 的可 行
性 . 为进行酵母原生质体融合提供一种有效方
法 。
材 料 与方 法
(一 ) 菌种
融合实验中的两亲本菌株 s a e c人。 , 。 , , e , t
c君 r 心口 i s i a o 3 9 6 和 C a o d i d a “ r i l i , A S 2 . 1 1 8仓
由云南微生物研究所提供。
(二 ) 培养墓
1
. 固体完全培养基 ( Y P D ) : 蛋白陈 2拓 ,
葡萄糖 2沁 , 酵母膏 l多 , 琼脂 2 外 , p H 6 . , 。
2
. 液体完全培养墓 : 同 Y P D , 不加琼脂 。
3
· 高渗完全培养基 ( Y p D S ) : Y P D十 17务
蔗糖 。
4
· 基石i力培 养 基 朴度M , 舜 ) : 葡 萄 糖 2 ,
M g 5 0
; . 7 H
2
0 0
.
0 7 , N a N O
3 0
.
4 , N a C I 0
.
0 5
,
e a N o
, 0
.
0 4 , K H
Z
PO
;
0
.
1 , K
:
H P O
。 0
.
0 1 , 微
量元素液 l (硫胺素 、 毗哆醉 、 芋酸各 4 Om g , 生
物素 。 . 2 0 9 , 肌醇 2g , 蒸馏水 l 升 ) , 水洗琼脂
2 , PH 6
.
s o
.5 高渗基础培养基 ( M M s) : M M + 17 并
蔗糖 。
(三 ) 原生质体形成和再生
活化的 5 . ` 。 r 。 , i: i a , 3 9 6 和 C . o r i l i r
A S 2
.
1 18 0 斜面菌种分别接种在 Y P D 液中 ,
3 0℃ 摇床 ( Zo o r /m i n ) 培养 2 0 小时 ,再按 1 0并
爱分别转接到新鲜的 Y P D 液中 , 摇床培养 ,
。
2, 2
。 徽 生 物
小时 ,取 I Om l 菌液离心 ,洗涤 ,收集菌体 , 悬浮
于 Zml 处理液 ( 1务 蜗牛酶 , 0 . 1肠筑基 乙醇 ,
1多 ED T A , 0 . s m o l / L K C I ; p H S . 4 )中 , 3 0 C 处
理不同时间 , T G L 一 6 G 离心机离心 ( 2 o 0 0 r /
二 i n , s m i n ) , 用 0 . 5 : n o l / L K c l 洗涤三次 ,收集
原生质体备用 。
原生质体形成率和再生率计算参见谭蓓英
等阅。
(四 ) 旅生质体触合
新制备的 C . 川 il i’ 原生质休用 0 . 1多碘
乙酸 ( ID ) 在 30 ℃ 下处理 40 分钟 , 充分洗涤
后 , 用血球计数计计数原生质体数 , 按 1 :1 的比
例同 5 . ` 。 r 。 , 沉。 。 原生质体混合 , 离心除上清
掖 , 将沉淀悬于 l m l 3 5多 P E G 6 0 0 0 (含 Z om
二 0 1/ L aC C 12 , 0 . s m o l / L K C I ) 中 , 混匀 , 3 0℃
处理 30 一 40 分钟 , 用 .0 s rD ol 7L 稀 释涂布 在
M M S 上 , 30 ℃ 培养七天 , 挑取在 M M S 上长
出的菌落。 分别以 5 . ` 。 。川 , i。 。 原生质体和
用 0 . 1并 ID 处理过的 C . “ it il , 原生质体徐 布
在 M M S 作对照 ; 用未作处理的 C . 二 , 1115 和
s
.
c ` r e , i , i a e 原生质体混合物涂 布 在 Y P D S
上进行融合率的计算。
学 通 报 1 9 9 1 年 1 . ( , )
3
. 细胞核染色 ; 改进的 N ur . 。 法口 。 即培
养 2 4小时的菌体涂布在载玻片上 , 80 ℃ 固 定
15 分钟 , 水洗 , 用新鲜 C or n ey 固定液 (乙醇 60
m l
, 氯仿 30 m l , 乙酸 10 m l) 固定 15 分钟 , 重新
水洗 , 在含 4肠 G ie m sa 染液中染色 90 分钟 ,
油镜观察并摄影 。
融合率 ~ 高渗完全培养基上菌落数
融合子的鉴定
X 1 0 0并
(五 )
D N A 含最测定 : 用改良的 S e h n e id e
法切提取 D N A , 用二苯胺法侧定 D N A 含量 。
2
. 酣酶型分析 : 参照参考文献 〔6 ]。
实 验 结 果
(一 ) 原生质体的形成和再生
对数前期酵母细胞对蜗牛酶十分敏感 , 用
蜗牛酶处理 20 分钟 ,平板菌落计数法计算出原
生质体形成率高达 80 多 , 但镜检原生质体形成
率却只有 30 务 左右 , 此时大部分细胞是细胞壁
被部分分解但对渗透压敏感 , 保持细胞形态的
营养细胞 , 详细研究结果另文发表 。 随着酶处
理时间的延长 ,细胞壁被逐渐分解 , 镜检原生质
体形成率也逐渐提高 。 考虑到我们所分离的原
生质体是用于细胞融合研究 , 所以将酶处理时
间延长至 4 0 分钟。 5 . ` , r 亡衍万 oe 原生质体形
成率和再生率分 别为 97 . 2% 和 6 . 4 3务 , 而 .c
u, il 行 原生质体形成率和再生率分别为 92 . 4%
和 4 . 8 7并。
另外 ,增加酶浓度 ,延长酶处理时间或提高
酶处理温度都可以提高原生质体形成率 , 但原
生质体再生率却随之而下降 (图 1 ) 。 用 1关 蜗
牛酶处理 5 . “ , 。 is ae 两小时 ,原生质体形成
率可达 10 肠 , 但再生率几乎为零 。 酶处理时
间太长 , 还会导致原生质体破裂 。
六次)铃州抹乞雄陇
.rfLrL
0勿咒lǎ欲)辞侣袭挂唱斌巨
(次à并嗦州昭挂吸伙`)井似映旅侣斌甘
30 50
处理时间 (m i n )
孟0 30
处理时间 (m in )
图 l 酵毋原生质体形成率 和再生率之间的关系
一 . 一 表示原生质体形成率 ; 一 。 一 表示原生质体再生串
(
一: C二 , 11` , A S 2 . 1 1 8 0书 b : s . e , r , , 15` a , 3 , 6 )
1 , 9 1 年 1 8 ( , ) 微 生 物
(二 ) 碘乙酸对 .C 时 11钻 的致死效应
用 0 . 1外 碘乙 酸 在 30 ℃ 处 理 细 胞 40 分
钟 , 或 0 . 4务碘乙酸处理细胞 10 分钟都可以达
到完全抑制 C . o il it 生长的效果 。 但较高浓
度的碘乙酸处理 ,细胞中大部分酶系受抑制 ,导
致融合实验失败 ;在高渗溶液中 ,碘乙酸处理时
间太长又会影响原生质体的活性 和 再 生 `81 , 所
以我们采用 0 . 1外碘乙酸在 30 ℃ 处 理 4 0 分钟
抑制 C . , , 111 , 生长 。
(三 ) 原生质体融合及融合子的筛选
两亲 株 原 生 质体 用 P E G 6 0 0。 和 20 m
DI ol /L ca CI
: 悬浮后 , 原生质体立即凝集在一
起 , 30 分钟后取样观察到原生质体紧密靠在一
起 , 同时还观察到细胞融合和可能的融合子细
胞 。按所述方法涂布后 , 30 ℃ 培养 7 天 ,对照皿
中无任何菌落生长 , 而在 M M s 上出现三种菌
落 : ① 菌落较大 、 湿润 、 光滑 、 淡灰色 , 同 .c
盯 11 , 菌落形态相似 , 占 87 . 21 沁 , 随机挑取 8
株 , 记为 S C 一 F一 1一叭 ② 菌落较小 、 湿润 、 光
滑 、 乳白色 , 同 5 . “ fe 讨 , i“ 菌落形态相似 , 占
9
.
0 2并 , 随机挑取 10 株 , 记 为 S C 一 F一 1 1一 2 0 ;
⑧ 菌落形态既不同于 5 . “ r o is i 。 。 , 也不同
于 C . 川il it 的大菌落 , 占 3 . 7 % , 挑取两株 ,
记为 S C 一 F一 9一 10 , 经鉴定 , 只有这种类型 的
菌落才是由真正的核融合子形成的。
根据三种菌落出现的机率 ,计算出 C . 川 i -
11, 和 5 . c e r 。 , i : i a 。 的属间原生质 体 融 合率
为 3 . 4 7 x l 。一 ` , 而以真正核融合子出现机率计
学 通 报 。 2 , 3 。
算 ,属间原生质体融合率为 1 . 32 x 1 0一、
(四 ) 融合子的鉴定
1
. 碳化合物的同化和发酵 : 从表 l 可以看
出 , 融合子对碳化合物的同化和发酵大致可以
分三种类型 : c . , , 111, 型 : s c 一 F一 z , s e 一 F一 4 ,
S C一 F一 8 , 但 S C 一 F一 1 和 S C 一 F 一 8 却获得了发
酵麦芽糖的能力 ; 5 . c e r , , i s sa , 型 : s e 一 F一 x7 ,
S C
一 F一 18 , S C 一 F一 20 碳化合物同化和发酵特性
完全同于 s . c , r 。 , i s i a 。 ; S C 一 F一 9 既表现出
5
.
c o r 。 , i , i a , 的特性 , 又表现出 C . , r i l i , 的
特性 。
2
. 同化硝酸盐试验 : 所有的大菌落都能在
以硝酸盐为唯一氮源的基础培养基上生长 , 而
挑取的小菌落再回接在以硝酸盐为唯一氮源的
基础培养基上 ,却不能在其上生长。
3
. 产抱试验 : 将筛选到的融合子接种到乙
酸盐产抱培养基上 , S C 一 F一 l一 10 都不能 形成
子囊抱子 , 而 s C 一 F 一 10一 20 都能象 5 . ` er 。 `-
, ia 。 一样形成典型的子囊抱子 。
4
.
D N A 含量测定 : 从表 2 可以看出 , S C -
F 一 l 、 S C 一 F一 4
、
S C 一 F 一 8 的 D N A 含t 同 C .
, r i l i , D N A 含量相近 , 而 S C 一 F 一 17 , S C 一 F一 2 0
的 D N A 含量却同 5 . c o r 。 , i: i a 。 相近 , S C -
F一 9 的 D N A 含量明显高于两亲株 , 但并非两
亲株 D N A 含量之和 。
5
. 醋酶型分析 : 根据醋酶带的 R , 值绘出
了亲株和融合株的醋酶图谱 (图 2 )。 s c 一 F一 1 7 ,
S C 一 F一 2 0 的醋酶带同 占. ` e r 。 , i t i a e 在 R . 值
农 1
菌株
亲株和胜合株刘破化合物的同化和发醉
碳化合物同化 碳化合物发醉
动萄塘 半乳搪 麦芽藕 纤 维二艳 木塘 阿拉伯艳 水杨昔 柠像酸 果艳 }葡萄精 半乳塘 交芽抢 眼李抢 乳抢
十++一+一+十+一+十5 . ` 口 r ` p i ,沁 口
C二 t i l` ,
S C一 F一 1
S C 一 F一 4
S C 一 F一 8
S C一 F 一 9
S C . F
一
17
S C一 F一 !性
S C一 F一 2 0
+
十
+
+ +
+
+
十
+
十
+
+
+
+
+
+
十+十++十
+
十
+
十
+
十
+
+
+
+
+
十
+
+
+
+
+
十
+
十
本
+
+
+
+
十
+
十
十 : 发阵 、 生长 ; 一 : 不发酵 、不生长
` 2 7 峪 - 微 牛 物 学 通 报 一9 , l 年 l舀 ( 5 )
.cS 已三一 . _ {:’. 止 - 一 口三二二二二二〕
.cU 〔 万一 , , 丁尸 , 一二 二 丫二〕 口 I口
S C
一
F
S C
一
F
一 9
S C
一
F
一 17
S C
一
F
一即
一 迁移方向团 2 亲珠和融合株脂酶型比较, 2 雍株和胜 合株 O N人 含且分析日 株
S
。 ` 户 r口 , 一 r浦a r 3 , `
C
. “ r` I一 , A S 2 . 11 3 )
S C
一
F一主
S C
一
r
一 4
S C
一「一 8
S C一 F 一 9
S C一 F 一 1 7
S C 一尸一 2 0
D N A 含址 ( 拌 9 1 10` 细胞 )
3
. 今0 2 3
峪。 今6 , 7
4
,
4 , 72
今 呜 7 6 乞
4
. 今7 Z L
乍 之一马3
3
。 压9确 [
3
。
4 0 14
为 “ . , , 62 . 2 处有一主一次两条带 ; s C 一 F 一 1与
C
.
, t i l i , 酣酶型相同 , 在 R : 值为 8 3 . 7 、 8 7 . 0 、
92
.
2 处 , 有两主一次共三条带 ; s C 一 F 一 9 在 R’
值为 7 7 . 呼、 8 1 . 2 、 8 5 . 6 、 9 0 . 3 处分别有两主 两次
共四条带 , 明显不同于两亲株的醋酶型。
6
. 异核子排除 : 用 G ie m sa 对 S C 一 F一 9 进
行细胞核染色 ,发现融合子只有一个细胞 核 , 无
双核现象(图 3 ) 。
圈 , 愚台月 . 舀 ` 一 r 一 , 兰U」介万淡裂 1三2 叹` u U u X 少
将 S C 一 F 一 9 在 Y PD 斜面上转接数代后 ,
再接种到 Y P D 液中 , 摇床培养 48 小时 , 涂布
在 Y P D 平皿上 , 待长出菌落后 , 考查了 2 1 61
个菌落的菌落形态 , 均未发现两亲株类型的菌
落出现 , 说明融合子是稳定的 。
结合融合子的其它特征 , 说明 s c 一 F 一 9 融
合性状的出现并非由异核体导致 ,证明 s c 一 F 一 9
是一个真正的核融合子 。
讨 论
利用不 可逆生化抑制剂砂乙酸抑制一亲株
细胞活性的同时 , 利用丙亲株细抱间生理性状
的差异作为酵母属间原生质体融合的选择性标
记是可行的。 经菌落形态比较 、 产抱实验 、 碳化
合物的同化和发酵 、 硝酸盐利用 、 D N A 含 t 测
定 、 醋酶型分析和自然的核分离试验证明 ,从选
择性培养基上筛选的融合子分三种类型 。 属间
原生质体融合率为 3 . 47 X 10一 ` , 同采用其它选
择系统所得到的融合率相近 ’` 一川 。
C
.
, 石厅 , 原生质体经碘乙酸处理后 , 原生
质体中某些酶系不可逆失活 , 从而导致原生质
体不能在选择性再生培养基上再生 、 繁殖 ; 而
5
. “ cr 沂 : ia 。 原生质体中缺乏硝酸盐还原酶系
统 , 也不能在以硝酸盐为唯一氮源的选择性再
生培养基上再生 、 繁殖。 两亲株原生 质体在
P E G 和 C az 十 作用下发生凝集 , 最后发生融合
形成同核体或异核体 , 前者因得不到酶的互补
而不能在选择培养基上再生 、 繁殖 ;后者则因酶
的互补而在选择性培养基上再生 、 繁殖 , 最后在
C
.
, it 厅 , 基因的作用下重新合成那些被碘乙酸
不可逆抑制的酶。 这种异核体只有少数会发生
核融合形成真正核融合子 ( 3 . 7 肠 ) , 而大部分
异核体则会因细胞核的不亲和性而发生核的分
离 。 但由于 5 . “ r 。川 : “` 不能在选择性培养
l , 9 1 年 1 8 ( 5 ) 微 生 物 学 通 报 . 2 7 5 -
基上生长 , 所以由异核体核分离得到 的是 .c
, x i l i s 类型的菌株 ( 8 7 . 2 1外 ) 。 5 . c e r 。 , i“ a 。
类型融合子的出现可能是由无核 的 c . 0 1 :
原生质体和有核的 5 . “ ,。 is “ 原生质体融
合形成的 。 无核的原生质体无细胞核 , 但却带
有细胞质中的全部酶系 , 由于酶的互补 ,这种融
合子在选择性培养基上再生 、 繁殖。 但通过无
核的 C . ut il’ : 原生质体带来的硝酸盐还 原 酶
系统得不到补充 , 最后耗尽 , 所以在选择性培
养基上出现了 5 . “ cr 衍 , i。 类型 的 小 菌 落
( 9
.
0 2多 ) , 这类菌落再转接到选择性培 养基 上
也不能生长 。 一部分 c . “ ilt it 类型的融合子
也是通过这一方式形成的 。
经细胞核染色和 自然核分离实验证明 S C -
F 一 9 融合特性的出现是由核融合导致的 , 是一
株稳定的核融合子 , 但其 D N A 含量并非两亲
株细胞 D N A 含量之和 , 结合其碳化合物的同
化和发酵 、 酮酶型等性状 ,我们认为 , 融合子的
遗传物质是以一亲株的遗传物质为主 , 再加上
另一亲本的少数几条染色体的非整倍体化形成
的`u , ` , ]。
s c 一 F一 1和 s c 一 F一 8 菌株获得了发 酵 麦芽
糖的能力 , 可能是在原生质体形成 、 融合处理或
再生中抑制基因突变所致 。
这一融合子选择系虽然简便 、 实用 ,但有一
定的局限性 ,且选择性不强 ,不可逆生化抑制剂
处理剂量 、时间难以掌握 , 同时 , 真正核融合的
融合率较低 , 难以对融合子进行精细的遗传学
分析都是这一选择系统存在的主要问题 。
参 考 文 献
1 1
.
12
.
1 3
.
W r i g h l W E : E x P r
.
C考 11
.
R r ` 二 11 2 : 2 9 ,一 3 0 7 . 19 7 8·
N e h l` R : M o l亡 c
. ` 尸二 G口 . 砂 r二 1 6 6 : 1 17一 1 18 . 1, 7 8` .
袁志明等 : 云南大学学报 , 1 1( 、 ) : ` 。一 6` , l ” , .
谭蓓英等 : 真自学报 , 找 3 ) : 19 2一 19 6 , 19 8 3 .
N o r
r
i s J R : M e rh o d i n M i e r o l
, : . , 1
0 9 , , v o l
.
SB
.
A e . d e m i c
P r
.
OL
n d o n a n d 匀 e w Y o r k . p p . 3 2 2一 3 2 8 , 19 7 0 ·
张龙翔等 : 生化买骇方汁和技术 , 人民教育出版社 , 北
京 , 9峪一 1 1 1 , 1 9 8 1。
N u r s e P : M o l亡 e
.
C了月 . G e 即 e r , 1 4 6 : 16 7一 17 8 . 1 9 76 ·
A n h J S e r a l
.
: 滩
PI
.
E
。 , i r o . M万c r o bi o l , 4 9 : 1 55 0一
1 5 , 2
, 19 8 3
.
P i n . A
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: 才P P I . E . p i r口二 M `c r o吞· oI , ` l : 9 9 5一
10 0 3
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P r vo o s t A e t t ,l
.
: F石材占 M ic r 口 bi o a l eL r r亡 r` , 3 1 : 3 0 , e
3 12
.
19 7 8
.
T a m a ki H : M时 e c . C e月 . G亡月亡 , , 18 7 : 17 7一 17 9 , 1 98 4 .
G r a v e d D P e t : 1
.
: C “ r r
,
G 君 . ` r , 8 : 4 9一 5 5 , 19 8呼.
P
e r e z C e t a l
.
: 伪 r r . 召` 附t , 8 : , 7 5一 58 0 . 1 , 8心.
.…2-3.5`
毛霉 目真菌 D N A 的提取及其 G C 含 t 的测定补
周 志 伟 黄 河
(中国科学院微生物研究所 , 北京 )
摘要 试验证明 ,通过液氮冷冻 、 手工研磨破碎后用稍加改进的常规 D N 人 提取方法 , 可以成功地
提取聚合度高 ,符合于热变性测 T m 值的毛睡目真菌 D N A 。 对 60 株菌的测定结果表明 ,毛霉目各属真
菌中 G 十 C m o l肠 高低有一定顺序 , 基本与文献报道相符 。 对提取时应注意的细节 、 T . 值的测定 、
心 C 含最计算公式的选定和结果分析进行了讨论。
关健词 毛霉目 ; D N A 提取 ; G c 含 t ; T . 值
核酸作为生物的遗传物质 , 不仅决定了生
物的形态特征 , 而且也包含了生物进化的信息。
由于核酸在生物进化中的特殊地位 , 分离与测
定生物核酸组成成份即 D N A G C m ol 多 并加
以比较 , 日益为生物分类工作者所重视。 特别
是对于那些用形态分类方法难以区分 的 类群 ,
分子生物学的分类手段更显示 出 它们 的优 越
性 。 D N A G C m ol 务 在分类上的作 用首先在
国家自热科学 基金及真菌地衣 系统学开放研究实脸 宜
资助项 目。
我所四室李文忠副研究员提供 B o k m . n D t ,一 , 分光
光度计并指导使用 , 特此致谢。