全 文 ： 粗毛栓菌(Trametes hirsuta) D2固态发酵山核桃蒲壳产
漆酶的营养条件研究
杨柳 ∗ 吕丹丹 邓杰勇 曹焕英 叶明
(合肥工业大学 生物与食品工程学院 安徽 合肥 230009)


摘 要：【目的】为提高漆酶产量，降低生产成本，以山核桃蒲壳作为基质，对粗毛栓菌 D2
固态发酵产漆酶的营养条件进行研究。【方法】对不同碳源、氮源、碳氮比、蒲壳含量对漆
酶产量的影响进行分析。【结果】山核桃蒲壳是粗毛栓菌生长的良好载体，能够促进漆酶的
合成。粗毛栓菌 D2漆酶固态发酵培养基干物质组成为：山核桃蒲壳 40% (质量比)，玉米粉
24% (质量比)，菜籽饼粉 36% (质量比)，发酵 6 d时，漆酶活性为 126.8 U/g干基。【结论】
粗毛栓菌固态发酵山核桃蒲壳产漆酶具有效率高，生产成本低的优点，具有潜在的工业化应
用前景。
关键词：粗毛栓菌，固态发酵，漆酶，山核桃蒲壳
Nutritional conditions for laccase production by Trametes
hirsuta D2 in solid-state fermentation using hickory hull
YANG Liu* LÜ Dan-Dan DENG Jie-Yong CAO Huan-Ying YE Ming
(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei, Anhui 230009,
China)
Abstract: [Objective] In order to increase the laccase productivity and reduce the production cost,
solid- state fermentation (SSF) (using hickory hull) medium for Trametes hirsuta D2 has been
studied. [Methods] The effects of supplementation with carbon and nitrogen sources, ratio of
carbon and nitrogen source and the content of hickory hull on laccase production were investigated.
[Results] The hickory hull was a good support for mycelial growth during laccase fermentation,
and the corn flour and rapeseed meal were found efficient and selected as additional nutrition for
laccase fermentation. The optimum solid materials in medium were consisted of 40% (W/W)
hickory hull, 24% (W/W) corn flour and 36% (W/W) rapeseed meal. Under these conditions, the
highest laccase activity (126.8 U/g dry substrate) was achieved after 6 days of cultivation.
[Conclusion] The higher laccase productivity and lower production cost could facilitate industrial
application of laccase.
Keywords: Trametes hirsuta, Solid-state fermentation, Laccase, Hickory hull
漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是含铜的多酚氧化酶，能氧化多酚、氨基苯酚、木质素、色
素等生成醌类化合物、羰基化合物和水，因此被广泛地应用在工业废水的脱毒、多氯化合物
基金项目：安徽省科技攻关计划重大项目(No. 09010301022)
∗通讯作者：Tel: 86-551-62919368; : yangliu199@163.com
收稿日期：2013-12-26；接受日期：2014-01-24；优先数字出版日期(www.cnki.net)：2014-02-18

网络出版时间：2014-02-18 17:20
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13344/j.microbiol.china.130920.html
的降解、纸浆废弃物的利用等方面 [1]。
漆酶主要由白腐真菌产生，如香菇 [2]、栓菌 [3-4]、黄孢原毛平革菌 [5]等。真菌漆酶在次
级代谢阶段产生，限碳、限氮、限硫等条件能促进漆酶的合成 [6]。合理的培养基组成是提高
漆酶生产效率的重要条件，研究表明合成培养基不利于漆酶的产生，但在合成培养基中添加
栗子壳 [7]、甘蔗渣 [2]、豆秸 [8]等含木质素的原料能显著提高漆酶产量。真菌在固态基质中的
生长接近其自然生长状态，所产生的漆酶具有酶活高、酶系全的优点 [2,9]，因此固态发酵日
益受到重视。固态发酵中原料成本占总成本的比例较大，选择廉价原料提高漆酶产量已成为
研究热点。
山核桃(Carya cathayensis sarg)蒲壳是山核桃的外果皮，主要成分是木质纤维素，并富含
多酚类单宁 [10]、苷、生物碱 [11]等化合物，许多微生物在其中难以生长，山核桃蒲壳在自然
界中难以被降解，已成为山核桃产区的重要污染物。本课题组分离到一株能在山核桃蒲壳中
生长并能分泌漆酶的菌株 D2，经过形态观察和 ITS 序列分析，确定菌株 D2 属于粗毛栓菌
(Trametes hirsuta)。因仅使用山核桃蒲壳作为漆酶发酵基质，漆酶活性很低，本文研究了外
加营养对 Trametes hirsuta D2固态发酵山核桃蒲壳产漆酶的影响，以期为今后的研究和工业
应用提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 菌种
粗毛栓菌(Trametes hirsuta) D2，从安徽宁国市山核桃种植区朽木上筛选得到，NCBI提
交其 ITS区序列获得登录号为 KF366913，现保藏于合肥工业大学微生物资源与应用研究室。
1.2 主要材料和试剂
山核桃蒲壳从安徽省宁国市南极乡山核桃种植基地收取，风干粉粹过 40 目筛；菜籽饼
粕、玉米粉为市售，粉碎过 40目筛；2,2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)
购自上海生工；其它试剂为国产分析纯。
1.3 马铃薯-愈创木酚培养基
20%马铃薯浸汁 100 mL，愈创木酚 0.04 mL，琼脂 2.00 g，1×105 Pa灭菌 30 min。
1.4 固态发酵产酶与酶液制备
将保藏菌种接种至马铃薯-愈创木酚平板上，30 °C培养 5 d。打孔器接种直径 8 mm的菌
块于装有 50 g物料的 250 mL三角瓶中 30 °C培养。
粗酶液的制备：准确称取 1 g发酵物料，加入 100 mmol/L pH 4.5的乙酸缓冲液，30 °C、
180 r/min振荡 2 h，过滤后滤液即为漆酶粗酶液。
1.5 营养条件对产漆酶的影响
将外加碳源或氮源物质加水配成一定浓度，加入到山核桃蒲壳中，使水分含量为 60% (质
量比)，研究外加碳源、氮源种类和添加量对产酶的影响；将菜籽饼粉与玉米粉按一定比例
混合，调节含水量为 50% (质量比)，研究不同配比的玉米粉和菜籽粕对产酶的影响；将玉米
粉与菜籽饼按 3:2的比例混合后，加入山核桃蒲壳，使蒲壳分别占固体物料质量的 0、20%、
40%、60%、80%、100%，调节水分含量分别为 50%，50%，60%，60%，70%，70%，研究
山核桃蒲壳含量对产酶的影响。每个处理设置 5个重复。
1.6 漆酶活力测定 [12]
10 mL反应总体积中含 1 mL适当稀释的粗酶液，8 mL 100 mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液
(pH 4.5)，加入 1 mL 50 mmol/L ABTS溶液以启动反应，30 °C测定前 3分钟的 OD420变化，
以沸水处理 5 min的粗酶液作为对照。酶活力单位(U)定义为：每分钟氧化 1 µmol ABTS的
酶量为 1个酶活单位。
1.7 可溶性糖测定
采用苯酚-硫酸法 [13]测定。
2 结果与分析
2.1 外加碳源对粗毛栓菌 D2固态发酵产漆酶的影响
分别向马铃薯-愈创木酚显色平板添加不同种类的碳源，比较葡萄糖、木糖、果糖、麦
芽糖、蔗糖、糊精、可溶性淀粉、玉米粉、羧甲基纤维素钠等对粗毛栓菌 D2菌丝平板生长
和产酶(观察变色情况)的影响，发现对粗毛栓菌 D2 平板生长和产酶最有利的单糖、双糖和
多糖分别是葡萄糖、蔗糖和玉米粉。向山核桃蒲壳中添加葡萄糖、蔗糖和玉米粉，使其质量
分别占培养基干重的 2%，5%，10%，空白对照不添加任何碳源，各条件下的最高漆酶活力
如表 1所示。
从表 1知，玉米粉最有利于漆酶合成，其次是蔗糖，而葡萄糖对漆酶活性无明显促进作
用，一般认为简单的糖利于菌体生长，而代谢较为缓慢的多糖利于漆酶的合成 [4]。观察菌丝
体在各培养基的生长状态，发现加入糖类物质后，都促进了菌丝体的生长，这与山核桃蒲壳
中缺乏容易利用的碳源物质有关。外加碳源对漆酶活性的影响与碳源的添加量有关系，10%
(质量比)的碳源添加量对漆酶生产有一定的抑制作用，这是因为山核桃蒲壳含氮量较低(凯氏
定氮法测得氮含量约为 1%)，较高的碳氮比有利于菌丝生长但不利于漆酶的合成 [14]。
2.2 外加氮源对粗毛栓菌 D2固态发酵产漆酶的影响
在前期实验中，在马铃薯浸汁液体培养基中加入终浓度为 1% (质量体积比)的硫酸铵、
硝酸钠、氯化铵、酒石酸钠、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、菜籽饼粕、米糠、麸皮、豆饼粉等
有机氮源以考察不同氮源对粗毛栓菌 D2产酶的影响，实验发现对产酶最有利的无机氮源、
可溶性有机氮源和不可溶的有机氮源分别是硫酸铵、酵母膏和菜籽饼粕。在预实验的基础上
选择了向山核桃蒲壳中加入不同量的硫酸铵、酵母膏和菜籽饼粕考察其对粗毛栓菌 D2固态
发酵产漆酶的影响，结果如图 1所示。从图 1可以看出，氮源种类和浓度对漆酶产量影响较
大。
少量添加硫酸铵对漆酶合成无明显促进作用，但随着硫酸铵添加量增加，漆酶合成受到
抑制，1% (质量比)的硫酸铵使漆酶活性较对照减少 17.6%，且发现加入硫酸铵对菌丝生长无
明显促进作用。添加酵母膏可以促进漆酶合成，添加 7%酵母膏比未添加的漆酶活性提高了
180%，但酵母膏含量为 10% (质量比)，漆酶活性急剧下降。添加 10% (质量比)菜籽饼粕的
漆酶活性最高，较对照提高 250%。实验中发现酵母膏和菜籽饼粕能促进菌丝的生长，有机
表 1 外加碳源对粗毛栓菌 D2固态发酵山核桃蒲壳产漆酶活力的影响
Table 1 Effect of supplemental carbon sources on laccase production by Trametes hirsuta D2 under SSF
using hickory hull
碳源
Carbon source
浓度
Content (%, W/W)
漆酶活力
Laccase activity (U/g ds)
Control 12.714±2.609
Glucose 2 13.831±1.730
5 15.528±2.273
10 11.827±0.659
Sucrose 2 22.327±3.433
5 28.117±3.980
10 26.861±2.892
Corn flour 2 31.177±3.744
5 36.377±0.272
10 28.624±1.339
氮源添加量越高，菌丝生长越好。有机氮源浓度对漆酶产量的影响主要与其含氮量有关，酵
母膏中含氮量为 8.5%，菜籽饼粕中含氮量为 2.5%，因过量的氮会抑制漆酶的合成 [15]，所以
漆酶合成受酵母膏浓度的影响较大。
60



图 1 外加氮源对粗毛栓菌 D2固态发酵山核桃蒲壳产漆酶活力的影响
Figure 1 Maximum laccase activities obtained by T. hirsuta D2 grown on hickory hull under SSF with differ-
ent amounts of initial nitrogen supplementation
注：柱中数字为各氮源的添加量(质量比).
Note：Numbers on bars indicate initial nitrogen percentages (W/W).
2.3 不同菜籽饼与玉米粉比例对漆酶合成的影响
山核桃蒲壳中可利用的碳、氮都较缺乏，需要同时添加碳、氮源，合理的营养组成才能
有效促进漆酶的合成 [14]。因山核桃蒲壳含量对产酶有影响，这部分实验培养基不加入山核
桃蒲壳。发酵培养基由玉米粉、菜籽饼粕和水组成，水分含量为 50%。在含不同菜籽饼/玉
米粉的培养物中，菌丝均生长旺盛，生物量没有明显差别，但不同玉米粉与菜籽粉配比对产
酶影响较大，如图 2所示。当菜籽饼/玉米粉为 6:4时，漆酶活性最高，为 39.368 U/g干基。
当培养基为玉米粉或菜籽饼粉时，酶活非常低，调节菜籽饼/玉米粉比例，改变了培养基的碳
氮比，说明合理的碳氮比能够促进漆酶的合成，这与 DAgostini的研究一致 [14]。



图 2 菜籽饼粕/玉米粉比例对粗毛栓菌 D2产漆酶的影响
Figure 2 Effect of ratio of rapeseed meal and corn powder on laccase production by T. hirsuta D2
2.4 山核桃蒲壳含量对漆酶合成的影响
在菜籽饼/玉米粉(质量比)为 6:4的混合物料中加入不同量的山核桃蒲壳进行漆酶发酵，
定时测定漆酶活性和可溶性糖含量，结果见图 3、图 4。



图 3 山核桃蒲壳含量对粗毛栓菌 D2产漆酶的影响
Figure 3 Effect of hickory hull contents on laccase production by T. hirsuta D2






图 4 漆酶发酵过程中可溶性糖变化曲线
Figure 4 Changes of soluble sugar conents during laccase fermentation by T. hirsuta D2

从图 3知，山核桃蒲壳含量对漆酶高峰出现时间和高峰数值均有明显影响。从图 4知，
培养基中初始可溶性糖随山核桃蒲壳量增加而减少，可溶性糖的减少量与生物量增加有密切
关系。从菌丝的生长情况来看，菌丝浓密程度随山核桃蒲壳量增加而减少。培养前 4天，可
溶性糖被快速消耗，4 d 后漆酶活性增加很快。山核桃蒲壳能显著提高漆酶活性，漆酶活性
从无山核桃蒲壳的 39.4 U/g 提高至 40%山核桃蒲壳下的 126.8 U/g。因蒲壳中易利用的营养
物质贫瘠，蒲壳提高漆酶产量原因不是调节了营养物质的碳氮比，可能的原因是：(1) 山核
桃蒲壳中含有没食子酸、胡桃醌等多酚物质，多酚物质可能会促进漆酶的分泌 [16]；(2) 蒲壳
提供了真菌生长的良好载体。为弄清山核桃蒲壳中的多酚物质对产酶的影响，进行了如下两
个实验：(1) 用乙醇提取法除去蒲壳中的多酚 [17]，发现除去多酚的山核桃蒲壳较未脱除多酚
的蒲壳更能提高漆酶活性；(2) 按 1:2料液比将山核桃蒲壳在 40 °C浸泡水中 2 d，将浸泡液
加入到玉米粉-菜籽饼粉中进行发酵，发现漆酶活性无明显增加。从以上两个实验说明山核
桃蒲壳中的多酚不是提高漆酶活性的原因。山核桃蒲壳中纤维素含量为 27.14%，木质素含
量为 48.17%，结构疏松，是丝状菌生长的良好载体，同时加入蒲壳减少了生物量，合适的
生物量能够促进漆酶的合成 [8]。
综上，漆酶产量受到生物量和山核桃蒲壳促进作用的双重影响，在山核桃蒲壳含量低于
40%的时候，蒲壳对漆酶的促进作用占主导；而在山核桃蒲壳含量高于 40%后，生物量因营
养贫瘠而明显减少，造成漆酶活性降低，但产酶高峰因营养贫瘠而提前。
3 讨论
对山核桃蒲壳的研究主要集中在其中的活性成分上 [10-11]，尚未有利用山核桃蒲壳作为固
态发酵基质的报道，本研究首次报道了粗毛栓菌 D2固态发酵山核桃蒲壳产漆酶的情况。山
核桃蒲壳木质纤维素含量高，易被粗毛栓菌利用的物质很少，粗毛栓菌在其中生长缓慢。合
理添加营养物质能够促进真菌的生长和产酶。在含木质纤维素原料的漆酶固态发酵中，外加
碳、氮源对产酶的影响因菌种、木质纤维素原料不同而有较大差异。如在糙皮侧耳(P. ostreatus)
2191以树叶为基质时，硝酸钠最有利于产酶，而以麦秸为基质，则是硫酸铵最为有利 [2]。王
欣等报道以杂色栓菌(Trametes versicolor) SYBCL3以木屑为基质时，1.0%麦芽糖、2.5%硝酸
钠和 15%豆粕最有利漆酶的产生 [18]。本实验中粗毛栓菌 D2在以山核桃蒲壳为基质进行漆酶
固态发酵时，外加玉米粉和菜籽饼粉显著提高了漆酶产量。在发酵培养基中加入木质纤维素
提高漆酶产量的原因因木质纤维素原料不同而有较大差异，如橄榄叶中的酚化合物是漆酶的
良好诱导剂 [3]，葡萄籽中高含量的木质素减缓了还原糖的释放速度从而维持培养基中的低糖
浓度 [19]，橘子皮因含营养而促进漆酶产生 [4]。研究发现固态发酵漆酶的产量和生物量有一
定关系 [8]，但过于旺盛的生长并不适合漆酶的产生，合适的生物量是提高漆酶产量的重要因
素。本实验中发现山核桃蒲壳中含有的多酚对漆酶生产无促进作用，但山核桃蒲壳质地疏松，
内表面大，是丝状真菌良好的载体，添加山核桃蒲壳能够减少粗毛栓菌的生长，合适的生物
量与生长状态是山核桃蒲壳提高漆酶产量的主要原因。
影响漆酶工业化生产和应用的主要因素是酶的生产效率和生产成本。真菌产漆酶一般需
8-20 d[2,4-5,7-9,15,19]，且长时间的固态发酵易受杂菌污染。缩短发酵时间、减少染菌率是提高漆
酶生产效率的重要手段。本实验中漆酶发酵周期是 6 d，发酵周期短；同时山核桃蒲壳富含
胡桃醌、多酚等抑菌物质，发酵过程不易染菌。本实验用到的山核桃蒲壳和菜籽饼粉都是农
林副产物，价格低廉。较高的生产效率和较低的生产成本使其具有重要的工业生产和实际应
用价值。
参 考 文 献
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