全 文 ： 中药化学
HPLC法测定苦参及苦参汤有效部位中三叶豆紫檀苷含量
刘　斌　石任兵　朱丽君　尹　冉　陈　硕
　刘　斌 ,男 , 39岁 ,医学博士 ,副教授 ,医学硕士生导师
(北京中医药大学中药学院　北京 100102)
摘要:目的　建立测定苦参及苦参汤有效部位中三叶豆紫檀苷含量的高效液相色谱方法。方法　Phe-
nomenex LunaC18(250mm ×4. 6mm , 5μm)色谱柱 ,流动相为乙腈 -磷酸水溶液 [磷酸 -水(2∶530)] (26
∶74),流速为 1. 0mL /m in,检测波长为 310 nm。结果　三叶豆紫檀苷在 0. 161 6 ～ 0. 808 0μg范围内线性
良好 ,相关系数 r=0. 999 4。 3组样品三叶豆紫檀苷平均回收率为 98. 97%、99. 93%、97. 94%, RSD为
1.80%、1. 84%、1. 67%(n =3)。结论　本方法操作简便 ,分离效果好 ,灵敏度高 ,重复性好 ,可用于控制苦
参及苦参汤有效部位质量。
关键词:三叶豆紫檀苷;高效液相色谱法;苦参;苦参汤;有效部位;含量测定
中图分类号:R284.2
Quantitative determ ination of trifolirh izin in Sophora flavescens A it. and
the effective fraction ofKushen Decoction
LIU B in, SH IRen-bing, ZHU L i-jun, YIN Ran, CHEN Shou
(Be ijing University of ChineseM edicine, Be ijing 100102)
Abstract:Objective　To establish a me thod fo r the quantitative dete rm ination o f the contents o f
trifolirhizin in Sophora flavescensA i.t and the e ffec tive fraction ofKushen Decoction byHPLC. M ethods
The HPLC procedure w as used in the de te rm ination as fo llow s: the chroma tograph ic co lumn w as
Phenomenex Luna C18(250 mm ×4. 6mm , 5μm), themob ile phase w as aceton itrile:phosphoric ac id
w a te r so lu tion [ H3PO 3 -H 2O (2:530)] (26:74)w ith a flow rate of 1 mL /m in, and the detection
w ave leng th w as 310 nm. Result　The result show ed tha t trifolirhizin had a good linear re lationship in the
range of 0. 1616 ～ 0. 8080μg (r=0. 9994). The ave rage recoveries for trifo lirh izin in th ree batches o f
samp lesw ere 98. 97%, 99. 93% and 97. 94% respectively, RSDs w e re 1. 80%, 1. 84% and 1. 67%
respective ly (n =3). Conc lusion　 The procedu re w as easy, sensitive w ith a good result and
repeatability. It can be used to control the qualities ofSophora f lavescensA i.t and the effective frac tion o f
Kushen Decoction.
Key words:trifo lirhizin;HPLC;Sophora flavescens A i.t ;Kushen Decoction; e ffective fraction;
quan tita tive de term ina tion
　　苦参为豆科槐属植物苦参 Sophora flavescens
A i.t的干燥根 ,具有清热燥湿 、杀虫 、利尿等功效 。
苦参主要活性成分包括生物碱 、黄酮等 ,其中紫檀素
类黄酮化合物因具有明显的化学分类学特征和广泛
的药理活性 [ 1] ,对鉴别和评价苦参质量具有重要意
义 。为此 ,我们选择其中重要的紫檀素类黄酮化合
物三叶豆紫檀苷 ,采用高效液相色谱法 ,建立含量测
定方法 ,为全面 、准确评价苦参药材质量提供方法和
依据 。
苦参汤始载于《千金方》,由苦参 、黄芩 、生地黄
3味中药组成 ,具有清热燥湿 、泄毒养阴的功效。我
们运用中药复方有效部位研究思路与方法 ,通过药
412
北京中医药大学学报
Journal of Beijing University o f T raditiona l ChineseM edic ine
　 　第 29卷第 6期 2006年 6月
Vo .l 29 No. 6 June. 2006
效学研究 ,筛选确定了苦参汤治疗生殖系与泌尿系
炎症的有效部位 。为了能够进一步将该有效部位进
行创新药物开发 ,我们根据对其主要化学成分的研
究分析结果 ,确定以总生物碱 、总黄酮以及主要有效
成分 5种苦参生物碱 (槐果碱 、苦参碱 、槐定碱 、氧
化槐果碱 、氧化苦参碱 )、3种苦参黄酮(三叶豆紫檀
苷 、黄腐醇 、苦参啶)和 4种黄芩黄酮 (黄芩苷 、汉黄
芩苷 、黄芩素 、汉黄芩素 )为定量指标 ,控制和评价
苦参汤有效部位的质量。
1　仪器与试药
W ate rs 515高效液相色谱仪 ,W aters 2487紫外
检测器 ,W atersM illenn ium32色谱工作站 , 25μL可调
进样器 , METTLER-AE240型 1 /100000电子分析天
平 (瑞士梅特勒公司), CX-250型超声波清洗器 (北
京医疗设备二厂 )。
苦参 、生地黄 、黄芩药材购自北京同仁堂医药集
团北城批发部 ,经北京中医药大学张贵君教授鉴定
分别为豆科植物苦参 Sophora f lavescens A i.t的干燥
根 ,玄参科植物地黄 Rehmann ia g lu tinosa Libosch.的
干燥块根和唇形科植物黄芩 Scutellaria baica lensis
G eo rg i的干燥根。三叶豆紫檀苷对照品 ,自制 ,经
UV、 IR、MS、1HNMR、13 CNMR鉴定结构 ,经 HPLC检
测 ,峰面积归一化法测定纯度为 99. 27%。
层析用中性氧化铝 (100 ～ 200目 ,北京金欧亚
科技发展有限公司);乙腈 (Fisher公司 ,色谱纯 );娃
哈哈纯净水 。其他试剂均为分析纯。
2　方法与结果
2. 1　色谱条件
色谱柱:Phenom enex Luna C18色谱柱 (250 mm
×4. 6 mm , 5 μm);流动相:乙腈 -磷酸水溶液 [磷
酸:水 (2∶530)] (26∶74);流速:1. 0 mL /m in;检测波
长:310 nm;柱温:室温。
2. 2　溶液制备
2. 2. 1　对照品溶液的制备:精密称取干燥至恒重的
三叶豆紫檀苷 4. 04 mg,置 100 mL量瓶中 ,加甲醇
溶解后稀释至刻度 ,摇匀 ,作为对照品溶液 。
2. 2. 2　供试品溶液的制备:按苦参汤处方单味药比
例 ,称取苦参 、黄芩 、生地黄一定量 ,混匀 ,用稀乙醇
回流提取。乙醇提取液减压回收溶剂 ,残留物加水
分散 ,通过大孔吸附树脂柱 ,树脂柱水洗去杂后 ,用
稀乙醇洗脱 。乙醇洗脱液回收溶剂 ,残留物减压干
燥 ,得苦参汤有效部位 。精密称取苦参汤有效部位
约 20mg,置 25mL锥形瓶中 ,精密加入 50%甲醇 10
mL,超声溶解。溶解液通过中性氧化铝柱 (4 g),用
50%甲醇 30 mL洗脱 ,收集洗脱液 ,减压回收溶剂 ,
残留物加甲醇 4 mL溶解 ,用 0. 45 μm微孔滤膜滤
过 ,作为供试品溶液 。
2. 2. 3　阴性样品溶液的制备:根据苦参汤原方比
例 ,称取黄芩 、生地黄二药 ,混合 ,按 “2. 2. 2”项下苦
参汤有效部位制备方法制备阴性样品后 ,采用供试
品溶液制备方法制备阴性样品溶液。
2. 2. 4　苦参药材溶液的制备:取苦参药材 1 g,粉碎
(40目),混匀 。精密称取约 0. 1 g,置 25mL锥形瓶
中 ,精密加入 50%甲醇 10 mL,称重。超声提取 40
m in,称重 ,以 50%甲醇补至原重。过滤 ,弃去初滤
液 ,精密移取续滤液 5 mL, 通过中性氧化铝柱 (4
g),用 50%甲醇 30mL洗脱 ,收集洗脱液 ,减压回收
溶剂 ,残留物加甲醇 4mL溶解 ,用 0. 45 μm微孔滤
膜滤过 ,作为苦参药材溶液。
2. 3　系统适用性试验
依上述色谱条件 ,分别精密吸取对照品溶液 、供
试品溶液 、苦参药材溶液和阴性样品溶液各 10μL,
分别进样 。在对照品溶液和供试品溶液色谱图相应
位置上 ,有相同保留时间的色谱峰 ,而阴性样品溶液
在此无干扰 ,结果见图 1。
2. 4　线性关系考察
分别精密吸取三叶豆紫檀苷对照品溶液 4、8、
12、16、20 μL,注入液相色谱仪 ,测定色谱峰峰面积。
以对照品量(μg)为横坐标 ,色谱峰峰面积为纵坐标
绘制标准曲线 ,计算回归方程为 Y =813 932. 284X
+2 831. 857, r = 0. 999 4。表明在 0. 161 6 ～
0.808 0 μg范围内线性关系良好。
2. 5　精密度试验
精密吸取供试品溶液 20 μL,重复进样 5次 ,测
定三叶豆紫檀苷色谱峰峰面积 ,计算 RSD为 1. 67%
(n =5)。表明精密度良好。
2. 6　稳定性试验
取 “ 2. 2. 2”项下供试品溶液 ,分别于制备后 0、
1、2、3、4、6、8、12 h依法测定 ,计算 RSD =2. 05%(n
=8)。表明供试品溶液在 12 h内基本稳定 。
2. 7　重复性试验
取同一批苦参汤有效部位 ,按 “2. 9”项下方法测
定含量。连续测定 5次 ,计算平均含量为 0.44%,
RSD=2. 33%(n=5),表明试验方法重复性良好。
413 第 6期 刘　斌等　HPLC法测定苦参及苦参汤有效部位中三叶豆紫檀苷含量
A对照品　B供试品　C阴性样品　D苦参药材　1三叶豆紫檀苷
图 1　HPLC色谱图
2. 8　回收率实验
精密称取干燥至恒重的三叶豆紫檀苷对照品
4. 52mg置 100 mL量瓶中 ,加 50%甲醇溶解 ,并稀
释至刻度 ,摇匀 ,备用 。
精密称取已测知三叶豆紫檀苷含量的苦参汤有
效部位 9份 ,每份约 10 mg,置 25 mL锥形瓶中 ,分
为 3组(每组 3份)。分别精密加入上述对照品溶
液 0. 5, 1. 0, 2. 0 mL,再分别精密加 50%甲醇至 10
mL,按 “2. 2. 2”项下方法制备供试液 。分别精密吸
取上述溶液 20 μL,注入液相色谱仪 ,测定峰面积 ,
计算含量和回收率 。结果见表 1。计算 3组样品的
平均回收率为 98. 95%, RSD=1. 01%。
表 1　回收率试验结果
分
组
样品称样
量 /m g
样品中对照品
含量 /mg
添加对照品
量 /mg
测出对照品总
量 /m g
回收率
/%
平均回收
率 /%
RSD
/%
10. 08 0. 0448 0. 0676 100. 88
1 9. 88 0. 0439 0. 0226 0. 0659 97. 35 98. 97 1. 80
10. 06 0. 0447 0. 0670 98. 67
10. 02 0. 0445 0. 0894 99. 34
2 10. 11 0. 0449 0. 0452 0. 0910 101. 99 99. 93 1. 84
9. 95 0. 0442 0. 0887 98. 45
9. 92 0. 0440 0. 1320 97. 35
3 9. 96 0. 0442 0. 0904 0. 1344 99. 78 97. 94 1. 67
10. 01 0. 0444 0. 1318 96. 68
2. 9　样品含量测定
精密称取苦参汤有效部位约 20 mg,置 25 mL
锥形瓶中 ,精密加入 50%甲醇 10 mL,按 “2. 2. 2”项
下方法制备供试液 。分别精密吸取上述供试液 20
μL和对照品溶液 10 μL,注入液相色谱仪 ,测定色
谱峰峰面积 ,外标一点法计算含量。结果见表 2。
表 2　样品含量测定结果(%;n =3)
批 次 1 2 3
含 量 0. 46 0. 45 0. 43
RSD 1. 58 2. 36 2. 10
(下转第 418页)
414 北京中医药大学学报　 　 　 　　　 　　　　　　　　　　　第 29卷
3　讨论
在对颐神达络方化学成分研究的过程中 ,我们
发现葛根素 、3′-甲氧基葛根素 、芹糖基葛根素 、大豆
苷和芍药苷的含量均比较高 ,而有关同时测定赤芍
与葛根复方中多指标成分的文献仅有一篇 ,报道了
用 HPLC法同时测定葛根素和芍药苷的含量 [ 2] ,但
同时测定葛根素 、3′-甲氧基葛根素 、芹糖基葛根素 、
大豆苷和芍药苷的方法未见报道 。 4个异黄酮类化
合物的最大吸收波长均在 250 ～ 240 nm之间 ,而芍
药苷则在 230 nm ,故选择 240 nm作为同时测定这 5
个化合物的检测波长 。本试验首次用高效液相色谱
法同时测定这 5个化合物的含量 ,所建立的方法简
便 、准确 、可靠 ,对于颐神达络方有效部位中指标性
成分的含量测定 ,及对相关中药复方的质量标准研
究具有重要的参考价值 。
参考文献:
[ 1] 王彦志 ,石任兵 , 刘　斌 ,赤芍化学成分的分离与结构鉴
定 [ J] .北京中医药大学学报 , 2006, 29(3):267 -269.
[ 2] 王铁军 ,郭绪林 , 王宏洁 ,等 .高效液相色谱法同时测定
根痛平冲剂中芍药苷和葛根素的含量 .中国试验方剂
学杂志 [ J] , 1997, 3(2):2 - 5.
(收稿日期:2006-03-01)
(上接第 414页)
2. 10　苦参药材含量测定
精密称取苦参药材粉末约 0. 1 g,置 25mL锥形
瓶中 ,按 “2. 2. 4”项下方法制备供试液。分别精密
吸取上述供试液 20 μL和对照品溶液 10 μL,注入
液相色谱仪 ,测定色谱峰峰面积 ,外标一点法计算含
量 。结果见表 3。
表 3　苦参药材含量测定结果(%;n =3)
批 次 1 2 3
含 量 0. 21 0. 20 0. 18
RSD 2. 13 1. 44 1. 89
3　讨论
苦参汤有效部位中存在的大量黄芩苷对测定三
叶豆紫檀苷含量会产生干扰 ,我们从黄芩苷和三叶
豆紫檀苷的结构和性质考虑 ,采用中性氧化铝柱色
谱对样品进行预处理 ,有效消除了共存的黄芩苷等
其他黄酮类成分对测定的影响 ,而三叶豆紫檀苷的
平均回收率为 98. 95%, RSD =1. 01%,满足定量要
求。
参考文献:
[ 1] 苗抗立 ,张建中 , 董 颖. 苦参的化学成分及药理的研究
进展 [ J] . 天然产物研究与开发 , 2001, 13(2):69 - 73.
(收稿日期:2005-11-24)
418 北京中医药大学学报　 　 　 　　　 　　　　　　　　　　　第 29卷