全 文 ：用。家兔体内药动学和生物利用度研究结果表明 ,
贴剂缓释长效特征明显 ,应用后 FEL 和 MET 血浓
度缓慢爬升 ,此后分别能保持相对较长时间的稳态
有效血药质量浓度:(22.5±9.1)～ (24.5±11.1)
μg·L -1和(257.0 ±98.8)～ (295.9±111.0)μg·
L
-1 。去除贴剂后 ,因皮肤储库效应的存在 ,血药浓
度仍可维持一定时间 ,整体有效血药浓度可持续 2
～ 3 d。统计分析结果表明 ,该贴剂显著提高了 FEL
和 MET 的生物利用度 ,两药的绝对生物利用度分
别约为口服灌胃液的2.75倍(P<0.05)和1.90倍(P
<0.05)。
本实验结果表明 ,透皮吸收促进剂合理联用协
同促透作用优于单用 ,可对理化性质存在较大差异
的多种药物同时达到有效促透 。以优化处方制备的
FEL-MET 复方透皮贴剂较应用透皮吸收促进剂前
给药面积显著缩小 ,且外观和理化特性较佳 ,各项黏
度指标符合优化标准 ,药物的 K 、J s 、Q72和 tlag等指
标均达到设计要求 ,其体外药物释放度和经皮渗透
性稳定 、重现性好 ,达到了预期设计目的 。
参考文献:
[ 1] 　H aria M , Plosker GL , Markham A.Felodipine/Metoprolol:a
review of the fixed dose con t rol led release formulat ion in the
management of es sen tial hypertent ion[ J] .Drugs , 2000 , 59
(1):141-157.
[ 2] 　Dahlof B , J on sson L , Borg holst O , et a l.Improved an tih yper-
t en sive ef fi cien cy of the felodipine-metoprolol extended-release
tablet compared w ith each d ru g alone[ J] .Blood Pres sure ,
1993 , 1:37-45.
[ 3] 　T odd PA , Faulds D.Felodipine.A review of the pharmacolo-
gy and therapeut ic u se of the extended releas e formulat ion in
cardiovascular disorders[ J] .Dru gs , 1992 , 44(8):251-277.
[ 4] 　Plosk er GL , Clissold SP.C ont rolled release m etoprolol formu-
lati ons.A review of thei r pharmacodynamic and pharmacoki-
netic p ropert ies , and therapeut ic use in hypertension an d is-
ch aemic heart di sease[ J] .Drug s , 1992 , 43(3):382-414.
[ 5] 　Kim J , Shin SC.Cont rolled release of atenolol f rom th e ethyl-
ene-vinyl acetate mat rix[ J] .Int J Pharm , 2004 , 273(1-2):23-
27.
[ 6] 　王文刚 ,恽榴红 ,王睿 ,等.高效液相色谱法同时测定经皮渗透
液中美托洛尔和非洛地平的含量[ J] .中国药学杂志 , 2006 , 41
(2):143-146.
[ 7] 　中国药典.二部[ S] .2005:附录 74 , 78.
[收稿日期] 2007-07-20
[ 作者简介] 杜丰玉 ,男 ,硕士 ,电话:13805425142 , E-mai l:f ooddfy@126.com
高效液相色谱法测定枇杷叶中熊果酸和齐墩果酸含量
杜丰玉1 ,陈钧2 ,许月明3 ,张保华1 ,张淑颖1 ,张相飞1 　(1.青岛农业大学植物保护学院 , 山东 青岛 266109;2.江苏大
学药学院 ,江苏 镇江 212013;3.芜湖职业技术学院生物工程系 ,安徽 芜湖 241000)
[ 摘要] 　目的:建立高效液相色谱法同时测定枇杷叶中熊果酸和齐墩果酸含量。方法:L ichro spher C18(250 mm×4.6 mm , 5
μm)为色谱柱 , 甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(90∶10∶0.03∶0.06)为流动相 , 流速为0.8 m L·min -1 , 检测波长为 215 nm。结果:熊果
酸 、齐墩果酸能达到基线分离(RS >1.65), 两者在0.4～ 4.0 μg 范围内线性关系良好。结论:此方法简便 、准确 、重现性好。
[ 关键词] 　高效液相色谱法;枇杷叶;熊果酸;齐墩果酸
[中图分类号] R927.2　　[ 文献标识码] A　　[文章编号] 1001-5213(2008)01-0021-03
Determination of ursolic acid and oleanolic acid in Eriobotrya ja ponica by HPLC
DU Feng-yu1 ,CHEN Jun2 , XU Yue-ming3 , ZHANG Bao-hua1 , ZHANG Shu-y ing 1 ,ZHANG Xiang-fei1(1.
Plant P ro tec tion Institute o f Laiyang Ag ricultural Co lleg e , Shandong Qingdao 266000 , China;2.Colleg e of Pha rmacy o f Jiang su
Univer sity , Jiang su Zhenjiang 212013 , China;3.Department of Bio lo gy Engineering o f Wuhu Professional Technolog y Co llege ,
Anhui Wuhu 241000 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To e stablish a me thod for the determination of ursolic acid and o leanolic acid in Eriobotrya japonica
by HPLC.METHODS　The de termination w as carried out on a Lichro spher C18(250 mm × 4.6 mm , 5 μm)co lumn with
me thanol-wa te r- g lacial ace tic acid- t riethylamine(90∶10∶0.03∶0.06)as the mobile phase , and detec ted at the UV w aveleng th
of 215 nm.RESULTS　UA and OA can be w ell reso lv ed (Rs>1.65).The calibration curv e w as in good linearity ov er the
range o f 0.4-4.0 μg.CONCLUSION　The method is simple , accura te , reproducible and can be used to contr ol the quality of
Eriobotrya japonica.
KEY WORDS:H PLC;Eriobotrya japonica ;ursolic acid;o leano lic acid
·21·中国医院药学杂志 2008年第 28卷第 1期 Chin H osp Pharm J , 2008 Jan , Vol 28 , No.01
　　枇杷叶为蔷薇科植物枇杷[ Eriobotrya japoni-
ca(Thunb .)Lindl.]的干燥叶 ,主产于江苏 、广东 、
福建 、江西等地 ,有清肺止咳 、降逆止呕之功效[ 1] ,收
载于历版中国药典 。近期对其化学成分的研究表
明 ,其主要成分为三萜酸 、倍半萜及其苷类 ,药理活
性的报道主要集中在三萜酸的抗炎 、抗病毒 、抗肿瘤
和降血糖方面 ,其中熊果酸(UA)、齐墩果酸(OA)
含量明显占优势[ 2-3] 。中国药典 2005年版收载的多
种中药中往往 UA和 OA 共存 ,因为两者为一对同
分异构五环三萜酸 ,药典采用的薄层扫描法测定的
实际为两者的总含量 。本实验建立了高效液相色谱
法同时测定枇杷叶中 UA 、OA 含量的方法 ,并首次
对各主要产地 、来源的枇杷叶中两者含量进行了测
定 , 为建立枇杷叶及其中药制剂的质量标准提供参
考。
1　材料
日本 Jasco PU-980型高效液相色谱仪;UV-
100-VI紫外检测器;熊果酸对照品(批号 110742-
200415)、齐墩果酸对照品(批号 110709-200304)均
购自中国药品生物制品检定所;枇杷叶药材采自江
苏 、广东 、福建 、江西 、海南等地 ,经江苏大学生药学
研究所欧阳臻副教授鉴定为 Eriobotrya japonica
(Thunb.)Lindl.的干燥叶;甲醇为色谱纯;水为纯
化水;其他均为分析纯。
2　方法和结果
2.1　提取条件的选择　以江苏产枇杷叶为样品 ,提
取前用石油醚(30 ～ 60 ℃)浸泡 2次 ,每次 15 mL ,
倾去石油醚 ,烘干后进行提取 。
2.1.1　提取溶剂的选择　精密称取样品0.50 g ,分
别加 25 mL 甲醇 、95%乙醇 、乙醚 、氯仿 4种溶剂冷
浸 15 min ,超声提取 40 min ,见表 1。结果表明 ,乙
醚 、氯仿提取的杂质较少 , 但提取率低 。甲醇与
95%乙醇提取率相当 ,而甲醇提取液色谱图杂质峰
少 ,对熊果酸与齐墩果酸测定无干扰 ,基线较 95%
乙醇提取物平稳 ,分离度较高 。因此选择甲醇作为
提取溶剂 。
表 1　不同溶剂提取率的比较
Tab 1 　Compa rison o f ex traction ra tio with different so l-
vents
溶剂 UA 提取率/m g·g -1 OA 提取率/mg·g -1
甲醇 5.83 1.78
95%乙醇 5.77 1.72
乙醚 4.55 1.57
氯仿 4.78 1.60
2.1.2　提取方法的选择　比较同一样品甲醇冷浸
后超声 、加热回流 、索氏提取 3种方式 ,见表 2 。结
果表明 ,超声 40 min×2的提取率显著高于加热回
流提取 2 h ,与索氏提取 6 h 的相当 ,考虑到超声提
取物杂质峰少 ,操作简便 ,耗时短 ,故选择超声提取
枇杷叶。
表 2　不同方法提取率的比较
Tab 2　Comparison o f ex traction r atio with different meth-
ods
提取方法 UA 提取率/mg·g -1 OA 提取率/mg·g -1
超声 40 min×2 6.79 2.25
回流 2 h 4.97 1.58
索氏 6 h 6.60 2.16
2.1.3　提取时间的选择　样品以甲醇冷浸后 ,分别
超声提取 20 ,30 ,40 , 50 min。结果枇杷叶超声提取
40 min/次 , UA 、OA 提取率最高。
2.1.4　提取次数的选择　样品以甲醇冷浸后 ,超声
提取 1 ,2 , 3次 ,40 min/次 。结果枇杷叶以甲醇超声
提取 2次 ,40 min/次 ,即可将熊果酸 、齐墩果酸基本
提取完全 。
2.2　色谱条件
2.2.1　检测波长的选择　熊果酸甲醇液λmax =206
nm ,在此检测波长下 ,流动相中甲醇的紫外吸收干
扰较大 ,基线不稳。故选择 215 nm 为检测波长 ,可
同时检测两者含量 ,且具有较高的灵敏度。
2.2.2　流动相中甲醇含量对熊果酸分离效果的影
响　当甲醇含量>90%时 , UA 出峰时间较短(tR <
20 min),但 UA 、OA 峰重叠 ,分离度差;当甲醇含量
<90%时 ,尽管 UA 、OA 分离度提高 ,但出峰时间
也随之延长(tR >30 min),且甲醇含量对 UA 、OA
保留时间比对其分离度影响更显著 ,故选定甲醇-水
体积比为 90∶10 ,其出峰时间在 22 min左右 ,分离
度也较高 。
2.2.3　色谱条件的确定　色谱柱:Lichrospher C18
(250 mm ×4.6 mm , 5 μm);流动相:甲醇-水-冰醋
酸-三乙胺(90∶10∶0.03∶0.06);流速:0.8 mL·
min
-1 ;柱温:室温;检测波长:215 nm 。在此色谱条
件下 ,熊果酸与齐墩果酸能达到基线分离(Rs >
1.65),理论塔板数以熊果酸峰计不低于12 000。
2.3　对照品溶液的制备　精密称取熊果酸对照品
2.0 mg 、齐墩果酸对照品2.0 mg 置于 10 mL 量瓶
中 ,用甲醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,配成熊果酸 、齐
墩果酸质量浓度分别为0.2 g·L-1的溶液。
2.4　样品溶液的制备　精密称取本品粉末(过 1号
筛)0.50 g ,置 100 mL 具塞锥形瓶中 ,用石油醚(30
～ 60 ℃)浸泡 2次 ,每次 15 mL ,倾去石油醚 ,烘干 ,
加甲醇 25 mL 冷浸 15 min ,超声提取 2次 ,40 min/
次 ,合并滤液 ,转移至 50 mL 量瓶中 ,甲醇定容至刻
·22· 中国医院药学杂志 2008年第 28卷第 1期 Chin H osp Pharm J , 2008 Jan , Vol 28 , No.01
度。取适量于0.45 μm 微孔滤膜过滤后备用。
2.5　线性关系 　精密吸取对照品溶液 0.1 , 0.2 ,
0.3 , 0.4 , 0.5 , 1.0 mL ,分别置 1 mL 量瓶中 ,甲醇定
容 ,摇匀。进样 20μL ,按上述色谱条件测定峰面积
积分值 ,以峰面积值(×105)为纵坐标 ,对照品进样
量(μg)为横坐标 ,经线性回归处理 ,其回归方程为
熊果酸:Y =7.761 8X -0.915 1(r =0.999 6 , n =
6);齐墩果酸:Y =6.706X -0.701 2(r=0.999 6 , n
=6),两者线性范围均为0.4 ～ 4.0 μg 。
2.6　方法学考察　精密吸取对照品溶液 20 μL ,重
复进样 5次 ,按上述色谱条件测定峰面积积分值 ,
RSD分别为0.9%与1.1%。精密称取0.50 g 同一
批样品粉末 5份 ,按上述样品溶液制备方法和色谱
条件测定峰面积积分值 , RSD 分别为 1.1%和
1.2%。取同一对照品溶液 ,在 0 ,1 ,2 , 4 , 8 , 24 , 48 h
分别进样 20 μL ,按上述色谱条件测定峰面积积分
值 , RSD分别为1.6%和1.4%。以上结果表明本方
法具有良好的精密度 、重现性与稳定性 。
精密称取 0.1 g 已知熊果酸 、齐墩果酸含量的
样品粉末 6份 ,分别精密加入 UA 、OA对照品适量 ,
按上述样品溶液制备方法和色谱条件测定峰面积积
分值 ,计算回收率 ,见表 3。
表 3　熊果酸和齐墩果酸加样回收试验
Tab 3　Results of recover y experiment
次数 样品量/mg
添加量
/mg
测得量
/mg
加样回收
率/ %
平均回收
率/%
RSD
/ %
UA
1 0.679 2 0.521 9 1.213 9 101.07
2 0.675 0 0.533 4 1.226 7 101.52
3 0.680 1 0.661 2 1.341 3 98.78
4 0.684 3 0.673 8 1.358 1 98.58
5 0.678 8 0.805 7 1.484 5 102.48
6 0.666 5 0.796 2 1.462 7 100.54
100.49 1.54
OA
1 0.225 6 0.179 6 0.413 4 102.02
2 0.223 3 0.182 3 0.413 8 102.03
3 0.226 2 0.217 9 0.431 6 97.20
4 0.224 8 0.230 8 0.445 8 97.85
5 0.225 4 0.269 1 0.508 7 102.87
6 0.227 9 0.271 4 0.512 3 102.61
100.76 2.52
2.7　样品含量测定　收集不同产地或从药店购买
的枇杷叶 。分别称取0.5 g ,精密称定 ,按上述样品
溶液制备方法和色谱条件测定峰面积积分值 ,含量
测定结果见表 4 ,对照品溶液与枇杷叶样品典型色
谱图见图 1。
3　讨论
枇杷叶甲醇提取液色谱图上齐墩果酸峰前有一
明显干扰测定的色谱峰 ,经石油醚(30 ～ 60 ℃)脱脂
处理后该色谱峰消失 。样品经石油醚(30 ～ 60 ℃)
表 4　不同产地或来源的枇杷叶中熊果酸 、齐墩果酸含量
Tab 4 　Contents o f UA and OA in Ertobotrya japonica
fr om different producing area
编号 产地或来源 UA 含量/mg·g -1
OA 含量
/mg·g -1
1 广东 6.26 2.15
2 广东 8.74 2.81
3 海南 7.57 2.47
4 福建莆田 7.77 2.67
5 福建福州(秋季采收) 6.30 2.17
6 江苏镇江(秋季采收) 6.79 2.25
7 山东淄博 8.6 2.24
8 山东济南 10.16 3.24
9 江西 10.11 2.58
10 江苏镇江药芝林 9.15 2.61
图 1　高效液相色谱图
A.对照品;B.样品;1-熊果酸;2-齐墩果酸
Fig 1　HPLC chromatogram
A.reference subs tance;B.sam ple;1-u rsolic acid;2-oleanolic acid
处理亦可除去枇杷叶中大部分叶绿素 ,提高检测灵
敏度 。流动相系统中加入少量冰醋酸可以创造弱酸
性环境 ,利于熊果酸 、齐墩果酸的分离 ,加入少量三
乙胺作为扫尾剂有利于改善峰形 ,提高分离度[ 4-5] 。
表 4可见 ,收集自江西 、江苏 、广东 、福建的枇杷
叶中 UA 、OA 含量较高 ,与其主产地一致 ,而收集
自山东的药材 UA 、OA 含量也较高 ,与上述省份的
药材含量相近 ,提示枇杷叶产地广泛。中国药典
2005年版记载枇杷叶全年均可采收 ,而本实验中秋
季采收的药材含量相对较低 ,提示其采收分季节较
合适 。
参考文献:
[ 1] 　中国药典.一部[ S] .2005:142.
[ 2] 　ND T ommasi , FD Simone , et al.H ypoglycemic effect s of ses-
qui terpene glycosides and polyhyd roxy lated t ri terpenoids of
Eriobot rya japonica[ J] .Plan ta Med , 1991 , 57(5):414-416.
[ 3] 　Liu J.Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid[ J] .J
Ethnopharmacol , 1995 , 49(2):57-68.
[ 4] 　相延英 ,杨光.常用中药中齐墩果酸和熊果酸的含量测定[ J] .
中国医院药学杂志, 2004 , 24(5):316-318.
[ 5] 　乔非 ,马双成,林瑞超 ,等.回心草药材中熊果酸的研究[ J] .药
物分析杂志 , 2004 , 24(2):208-210.
[收稿日期] 2006-11-24
·23·中国医院药学杂志 2008年第 28卷第 1期 Chin H osp Pharm J , 2008 Jan , Vol 28 , No.01