全 文 ：文章编号:1002-8110(2004)03-0097-03
含α-乙酰乳酸脱羧酶基因的啤酒酵母工程菌的构建
张　沛1 ,张博润2
(1.江南大学 ,江苏无锡　214036;2.中国科学院微生物研究所 ,北京　100080)
摘　要:利用基因工程手段将食品级醋化醋杆菌的α-乙酰乳酸脱羧酶基因引入啤酒酵母中 , 使啤酒酵母获
得编码此酶的基因并表达 , 检测到α-乙酰乳酸脱羧酶的活性 , 获得一株性能优良的啤酒酵母工程菌。经测
试 ,构建的工程菌与出发菌在生理 、生化 、发酵特性等方面无差异 ,但发酵液中双乙酰的峰值及还原时间较出
发菌降低 1/ 3左右。
关键词:α-乙酰乳酸脱羧酶基因 ,双乙酰 , 啤酒酵母
中图分类号:TS262.5;TS261.11　　　　文献标识码:A
　　啤酒是营养丰富的深受人们喜爱的世界性饮料 ,随着行业发展
和人们生活水平的提高 ,消费者对啤酒口味的要求越来越高 ,而啤酒
风味成熟与否的重要指标之一就是啤酒中双乙酰的含量。由于啤酒
中双乙酰的风味阈值很低 ,当其超过 0.13mg/L 时 , 就会产生令人不
愉快的馊饭味[ 10] 。啤酒中双乙酰的来源很复杂 ,主要是啤酒酵母代
谢的产物 ,由α-乙酰乳酸经非酶氧化脱羧产生 ,α-乙酰乳酸的非酶
氧化脱羧速度比双乙酰被还原的速度慢得多(后者约为前者的 10
倍)[ 1] ,如果在啤酒风味成熟阶段不能将α-乙酰乳酸充分除去 ,在随
后的啤酒包装 、杀菌过程中就会有较多的双乙酰形成[ 9] 。 这样α-乙
酰乳酸的去除反而成了啤酒成熟的时间限制因素 , 研究表明酵母和
其它微生物在形成缬氨酸的过程中均产生过量的α-乙酰乳酸 ,原因
是催化α-乙酰乳酸还原成二羟基戊二酸的乙酰乳酸还原异构酶效
率非常低 ,使得乙酰乳酸得到积累。α-乙酰乳酸脱羧酶能将双乙酰
的前体物乙酰乳酸直接脱羧转化成乙偶姻 , 不经过形成双乙酰的中
间步骤 ,遗憾的是该酶只存在于原核生物(某些细菌)中 ,所有酵母菌
细胞中都不含有此酶[1] 。本文利用基因工程手段 , 将乙酰乳酸脱羧
酶基因整合到啤酒酵母染色体上[7 ,8] ,使得酵母也能产生乙酰乳酸脱
羧酶 ,将胞内过量积累的乙酰乳酸分解掉 , 从而加速双乙酰的还原 ,
促进啤酒的成熟。
收稿日期:2004-02-16
作者简介:张　沛(1967-)女 ,山东青岛人 ,江南大学在读硕
士生。
1　材料与技术路线
1.1　实验材料
1.1.1　菌株和质粒
1.1.1.1　乙酰乳酸脱羧酶产生菌株
醋化酯杆菌(食品级)是本中心实验室保存的产乙酰乳酸脱羧酶
的菌株。
1.1.1.2　大肠杆菌菌株
E.coli DH5α和 JM107均为本中心实验室保存常规菌株
1.1.1.3　工业啤酒酵母菌株(S.Cerevisiae)TS01(对 6mmol/ LCuSO 4 敏
感)是啤酒生产用菌株。
1.1.1.4　质粒
本研究所用质粒 pUC18 、质粒 YIp5(整合型穿梭载体)及 pBG4
(pUC18::Α-乙酰乳酸脱羧酶)等均为本中心实验室保存或构建。
质粒 pCM1-1(YEp351:CUP1-MT1)由Winge教授惠赠。
1.1.2　培养基
LB培养基按常规配置[ 2] 。YEPD 培养基用于培养酵母菌及其转
化子[ 3] 。
1.1.3　分子克隆工具酶
限制性内切酶 、RNA 、T4DNA连接酶 、溶菌酶 、蛋白酶K 均购自天
象人生物工程公司 、华美生物工程公司。
1.2　α-乙酰乳酸脱羧酶基因克隆的技术路线
Acetobacter acet α-乙酰乳酸脱羧酶基因克隆的技术路线如图 1
所示:
New ClO2 s disinfectant is living the yellow rice wine
　 water treatment respect application analysis
YU Huan-qing
(Zhejiang Shaoxing east wind Shaoxing rice wine limited company manufacture technique ministry 312030 , China)
ABSTRACT:The Chinese yellow rice wine , the domination most , however such is brew beer that water in source mirrors lake water thanks to
deteriorateing of environment quality , the water quality pollution is more and more grave.ClO2 s disinfectant is one kind of new pattern water
tratment means , and previous else sterilize it than gets up that the means possess even more advantage , and are universally having a good
prospect at the moment to have actual popularization value the sterilizeing technique.Not only ClO2 s disinfectant may act as the disinfectant ,
may act as the oxidant once more , and fling plusing before may filtering , but also flinging to plus afterwards may filtering;The amount to be used
of the amount to be used oridinarily in the interest of when sterilizeing behind the 0.5～ 1.5mg/ L is oridinarily in the interest of 0.5 ～ 3.0mg/
L when acting as beforehand the oxidate to handle.
KEY WORD:Yellow rice wine;disinfectant;two oxidated chlorine and handle technology
第 31卷　第 3期
2 0 0 4 年 5 月　 　　　　　　　　　　　　　　　　　
酿　　酒
LIQUORMAKING
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.31 , No.3
May , 　2004
2　结果与讨论
2.1　重组表达质粒的构建
用 BamHI/EcoRI 和 EcoRI/ SacI 酶切质粒 pCM1-1 ,分别回收 0.
43Kb的 CUP1 启动子片段和 0.9Kb的MTI片段 ,两片段在 T4 DNA 连
接酶作用下连接 ,用绿豆核酸酶处理产生平末端 ,回收 1.3Kb片段。
用 BamHI/ EcoRI 酶切质粒 pBG4,回收约 2Kb 、含枯草芽孢杆菌α-乙
酰乳酸脱羧酶基因的 DNA 片段。整合型穿梭载体 YIp5经 BamHI 酶
切线性化 ,碱性磷酸酶处理。构建了重组质粒 pCA1-10和 pCMA2-
1。在 pCA1-10中 ,α-乙酰乳酸脱羧酶基因的表达受 CUP1启动子
的控制, 筛选标记是 URA3 ,要求转化的酵母受体必须是尿嘧啶营养
缺陷型 ,才能有效筛选转化子 ,因此该重组质粒不能用来直接转化工
业生产菌株。质粒 pCMA2-1的构建解决了筛选标记问题 , 它带有
来源于 pCM1-1的铜抗性基因(CUP1-MT1)。由于大多数工业用啤
酒酵母菌对铜较敏感 ,因此可以依据铜抗性的提高有效筛选酵母转
化子。
红色菌落为α-乙酰乳酸脱羧酶阳性克隆
图 1　α-乙酰乳酸脱羧酶基因克隆的技术路线
2.2　重组质粒的酶切验证
用限制性内切酶 BamHI 分别酶切重组质粒 pCA1-10和 pCMA2
-1 ,电泳检测发现 pCA1-10经 BamHI 酶切给出约 2.4Kb 的插入片
断和 5.5Kb的线形载体片断;pCMA2-1酶切后同样有一个约 2.4Kb
的插入片断 ,同时还有两个约 3.9Kb和 2.9Kb的片断 ,但没有空载体
的线形片断 ,表明铜抗性基因内有 BamHI的识别位点 ,这与文献报道
是一致的[ 28] 。
2.3　酵母转化子铜抗性测定
采用完整细胞转化法将重组质粒 pCMA2-1转化啤酒生产酵母
菌株 PJ3-5。由于 PJ3-5最高能在含 6mM CuSO 4的 YEPD平板上生
长 ,因此选择含 7mM CuSO4 的YEPD用于转化子的筛选。从 7mM Cu-
SO4平板上随机挑选 50个转化子 ,编号为 YT1～ 50, 按方法所述测其
铜抗性。 结果表明转化子均能在含 8mM CuSO4 的 YEPD 平板上生
长 ,而受体菌株PJ3-5在 7mM CuSO 4平板上不能生长。可见铜抗性
基因是工业用酵母菌株转化的非常有效的显性选择标记。
2.4　转化子中α-乙酰乳酸脱羧酶活性的测定
从上述铜抗性的转化子中随机挑选五个转化子 YT1 、YT16 、
YT20 、YT35和 YT50 ,按 Suihko 等方法测定Α-乙酰乳酸脱羧酶酶活
性[ 2] 。由于转化子中α-乙酰乳酸脱羧酶基因的表达受 CUP1启动
子的控制 ,因此测定了在不同 CuSO4 浓度的 YEPD中培养的细胞的α
-乙酰乳酸脱羧酶酶活性。由表 1结果可以看出 ,原始菌株 PJ3-5
在任何 CuSO4浓度下都没有α-乙酰乳酸脱羧酶酶活性 ,而转化子的
Α-乙酰乳酸脱羧酶酶活性明显受不同浓度的 CuSO 4 的诱导。在检
测范围内 ,当 CuSO4浓度为 20μM 时 ,转化子酶活性达到最高;而当培
养基中没有添加 CuSO 4时 ,细胞表现的α-乙酰乳酸脱羧酶酶活性可
能为组成性表达产物或培养基本身所含的微量 Cu2+诱导所致。 上
述结果表明 ,枯草芽孢杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因已被成功引入到
工业用啤酒酵母 PJ3-5中 ,并且实现了功能性表达。
表 1　 硫酸铜浓度对酵母菌株
Α-乙酰乳酸脱羧酶酶活性的影响
α-乙酰乳酸脱羧酶活性(U/ L菌液)
硫酸铜浓
度((M) PJ3-5 YT1 YT16 YT20 YT35 YT50
0 0 0.34 0.31 0.31 0.34 0.30
5 0 0.78 0.69 0.77 0.82 0.77
10 0 1.94 1.91 1.86 2.03 1.91
15 0 3.45 3.57 3.31 3.79 3.67
20 0 4.91 5.24 4.87 5.71 5.53
2.5　啤酒发酵液中双乙酰含量的变化曲线
按方法所述测定了不同发酵时间原始菌株 PJ3-5及α-乙酰乳
酸脱羧酶酶活性较高的基因工程菌株 YT35发酵液中双乙酰含量(图
2)。结果表明 ,带有α-乙酰乳酸脱羧酶基因的酵母工程菌在整个发
酵过程中 ,发酵液中双乙酰含量都比较低 ,发酵 6～ 7d,就可以使发酵
液中双乙酰含量降低到口味阀值(0.13mg/L)以下 , 而作为对照的原
始菌株产生的双乙酰量要高的多 ,需要较长的发酵时间(约 12d)才将
双乙酰降到阀值以下。可见通过基因重组技术构建的啤酒酵母工程
菌在发酵过程中可使啤酒的熟化时间缩短近一半 , 从而极大的提高
了设备的利用率。
图 2　啤酒发酵过程中双乙酰变化曲线
2.6　啤酒酵母工程菌发酵性能及传代稳定性试验(篇幅所限 ,试验
数据略)
从工程菌阳性菌株中 ,经酶活测试 、生理生化试验 、发酵性能试
验等筛选出三株工程菌进行进一步的试验。经过连续EBC管中试试
验 ,啤酒酵母工程菌双乙酰的峰值降低约 1/ 3, 还原速度比受体菌提
高 ,通过检测 ,证实α-乙酰乳酸脱羧酶的活性存在 ,说明含α-乙酰
乳酸脱羧酶的啤酒酵母工程菌构建成功 ,而且α-乙酰乳酸脱羧酶基
·98· 　　　　　　　　　　　　　　　　酿　　酒　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　2004
因成功地进行了表达。
啤酒酵母工程菌的生理生化性状正常。其生长曲线 、糖类的利
用等指标与受体菌没有显著的差异 ,这说明α-乙酰乳酸脱羧酶基因
的引入没有影响到酵母的其他生理生化性状 ,构建的工程菌是合乎
要求的;而且其它发酵性状并没有因为α-乙酰乳酸脱羧酶基因的引
入而受到影响。其发酵度 、糖代谢 、氨基酸代谢 、风味物质等性能与
受体菌相比 ,没有产生明显的差异 ,这初步说明构建的啤酒酵母工程
菌能够满足啤酒生产的需求 ,生产出正常的理化指标合格的 、风味满
足要求的啤酒。
啤酒酵母工程菌经过连续传代实验 ,其双乙酰的代谢(包括α-
乙酰乳酸脱羧酶活性 、工程菌的抗铜性)、生理生化性状 、发酵特征等
随着工程菌传代次数的增加尽管有所变化 ,但都基本保持了稳定 , 而
且这种变化完全是由于使用代数的增加使酵母衰老而导致的 ,并非
是由于α-乙酰乳酸脱羧酶基因的引入而产生的。系列实验的结果
表明 ,α-乙酰乳酸脱羧酶基因在酵母染色体上是能够稳定地遗传 ,
并不随着使用代数的增加而发生明显的丢失。
发酵时间(d)
图 3　发酵过程双乙酰的变化曲线
[ 参考文献]
[ 1] Lewis K.F.and Weinhouse S.1958.Studies in valine biosynthesis , α-
acetolactate formation in microorganism[ J] .J.Am.Chem.Soc.80:4913
-4915
[ 2] Smveook J , Fritsch E F , Maniatis T Molecular Cloning :Laboratory
Manual , 2nd ed[M] .New York ,1989
[ 3] Alison Adams , Daniel E Gottschling , Chris A Kaiser , et al.Methods in
yeast Genetics[ M] .A cold Spring Harbor Laboratory Course Manual ,
1998
[ 4] Aschengreen , N.H., S.Jepsen.1992.Use ofα-acetolactate decarboxy-
lase in brewing fermantation.Proc , Conv.-Inst.Brew.22nd, 80～ 83.
[ 5] 陈炜 ,何秉旺.1993.α-乙酰乳酸脱羧酶研究进展[ J] .微生物学
通报 , 20(5):307～ 310.
[ 6] Chuang , L.F., and E.B.Collins..Biosynthesis of diacetyl in bacteria and
yeast[ J] .J.Bac- teriol.1968 , 95:2083～ 2089.
[ 7] 高健 ,铁翠娟 ,王忠彦 ,何秀萍 ,胡永松, 张博润。 枯草芽孢杆菌α
-乙酰乳酸脱羧酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达[ J] .微生物
学通报 , 1999 , 25(6):336～ 338, 1998。
[ 8] 郭文洁 ,何秀萍 ,铁翠娟 ,张博润。枯草芽孢杆菌α-乙酰乳酸脱
羧酶基因在啤酒酵母工业菌株中的表达[ J] .微生物学报 , 41(1):
105～ 108 ,2001。
[ 9] 顾国贤 ,邓灵童.酿造条件与啤酒中双乙酰含量的探讨[ J] .酿
酒 , 1993.(5):12～ 14.
[ 10] 管敦仪.啤酒工业手册(中册)[ J] 北京轻工出版社 , 1985 , P467 ～
469.
2004年酒类产品关税实施方案
经国务院批准 ,国务院关税税则委员会于 2003年 12月 23日下发了税委会[ 2003] 28号文“国务院关税税则委员会关于 2004年关税实施方
案的通知” ,有关酒类产品的关税调整如下(对进口的原产于韩国 、印度 、斯里兰卡 、孟加拉和老挝五国的 9025税目下的商品实行《曼谷协定》优
惠税率):
从价税:
税则税目 产品类别 2003年税率[ %]
2004年
税率[ %]
《曼谷协定》
优惠税率[ %]
12101000 啤酒花 22 20
12102000 颗粒酒花 14 10
13021300 啤酒花浸膏及液汁制品 12 10
21021000 活性酵母 26 25
35030090 鱼胶:其它动物胶 13.2 12
20096100 酿酒葡萄汁 23 20
20096900 酿酒葡萄汁 23 20
22041000 葡萄汽酒 24.2 14
22042100 小包装的鲜葡萄酿造的酒 29 14
22042900 其它包装的鲜葡萄酿造的酒 29 20
22043000 其它酿酒葡萄汁 40 35
22060000 其它发酵饮料 55.9 53.6
22072000 任何浓度的改性乙醇及其它酒精 32 30
22082000 蒸馏葡萄酒制得的烈性酒 28.3 19.2
22083000 威士忌酒 28.3 19.2
22084000 朗姆酒及其它甘蔗蒸馏酒 21 10
22085000 杜松子酒 28.3 19.2
22086000 伏特加酒 28.3 19.2 17
22087000 利口酒及阿迪尔酒 28.3 19.2 17
22089010 龙舌兰酒 28.3 19.2 17
22089090 其它蒸馏酒及酒精饮料 28.3 19.2 17
　　从量税
税则税目 产品类别 2003年税率 2003年优惠税率
2004年
优惠税率
最惠税率
[ %]
22030000 麦芽酿造的啤酒 7.5元/升 1.5元/升 7.5元/升 0
·99·第 3期　　　　　 　张　沛 ,等:含α-乙酰乳酸脱羧酶基因的啤酒酵母工程菌的构建