全 文 ：利用连续驯养方法选育优良啤酒酵母的研究
李　崎　顾国贤　孙芙宁　章克昌　潘学启＊
(无锡轻工大学生物工程学院,无锡 , 214036)
(青岛啤酒股份有限公司科研中心 ,青岛 ,266100)＊
摘　要:在对两株啤酒酵母进行紫外诱变 、获得低双乙酰峰值菌株的基础上 , 采用双乙
酰连续驯养手段 ,分离得到一株双乙酰还原能力强的菌株②。对②再次进行紫外诱变 ,获得
一株谷胱甘肽(GSH)产量和风味保鲜期预测值(RSV)较高的突变株②A27 。对②A27进行蛋
氨酸连续驯养后分离得到一株 M I4 , 500ml锥形瓶发酵结束后 ,其主酵液的 GSH 和 RSV 可比
出发株②分别提高 37%和 74%, 羰基化合物(TBA)则下降了 14%;1m3 罐发酵后的成品啤
酒其 GSH 和 RSV 比②高 29.6%和 92%, TBA下降了 19.1%, 啤酒风味有所改善。
关键词:紫外诱变 , 连续驯养 ,双乙酰 , 谷胱甘肽 ,风味保鲜预测值 ,羰基化合物
我国是世界啤酒生产大国 ,但啤酒质量与世界先进水平相比 , 仍有较大差距 ,其中酵母特性是影响
我国啤酒质量的最关键因素。以在我国啤酒厂中应用最广泛的青岛啤酒酵母为例 , 虽然青岛酵母在长
期的生产实践中形成了自己独特的生理特性 ,但也存在一些缺陷 , 双乙酰峰值高 、还原慢和抗老化能力
差是其中最主要的问题。 连续培养技术是一种可富集 、筛选微生物和改变微生物性状的有效手段 ,
Cheng等[ 1] 曾利用连续培养技术成功地选育到一株产芽孢能力低但能高产α-淀粉酶的 Bacillus
caldolyticus , 此外 ,利用连续培养技术筛选高温菌和能够利用特定碳源(如甲醇)的微生物也时有报道。
对青岛啤酒酵母进行改良的前提是确保啤酒风味基本不变 , 故本文在通过紫外线(UV)诱变获得双乙酰
(VDK)峰值低的甲磺隆抗性突变株的基础上[ 2 , 3] , 利用双乙酰连续驯养方法获得一株双乙酰还原快的
②菌株。再对②菌进行 UV诱变 ,蛋氨酸和 1 , 2 , 4-三氮唑平板分离 ,蛋氨酸连续驯养 , 最终获得双乙酰
峰值低 、还原快和抗老化能力强的优良青岛啤酒酵母改良株 M I4 。 1m3 罐中试结果表明 , 该菌株具有十
分广阔的工业化应用前景。
1　材料与方法
1.1　菌种
啤酒酵母(Saccharomyces Carlsbergensis)C-02 , C-03 , 本院酿酒工程研究室保藏。
1.2　培养基
1.2.1　发酵培养基:24%大米作辅料的 12°P麦汁发酵培养基 , 按青岛啤酒厂实际生产工艺曲线制备。
1.2.2　蛋氨酸连续驯养培养基:葡萄糖 5%, 蛋白胨 1%,酵母膏 1%,蛋氨酸 1.5%, pH5.0。
1.3　实验方法
1.3.1　紫外线诱变:15W 紫外灯 25cm 处照射 50s。
1.3.2　双乙酰连续驯养:菌株逐级扩培 ,酵母泥接种低温发酵 3d 后 , 将发酵液倾出 , 0.5kg/ cm2 下灭菌
15min杀灭酵母 , 冷却后外加无菌双乙酰溶液(浓度由实验要求定)供补料用。如图 1 连接实验装置(发
酵液上方用无菌液体石蜡封住 ,以保证系统处于无氧状态),测定流出液的双乙酰含量等指标。其中 , 层
析柱中为含有欲驯养酵母的发酵液(未灭菌),体积为 200ml。系统在 4℃下稳定运行 7d～ 8d 后结束 , 从
柱中悬浮液中分离酵母 ,锥形瓶接种发酵 , 进行各项指标测定。
1.3.3　蛋氨酸连续驯养:实验装置和方法与双乙酰连续驯养基本相同。连续流加含有蛋氨酸的合成培
养基 ,系统在 20℃下稳定运行 5～ 6 天结束 ,层析柱中装液量为 100ml。
1.4　实验装置:如图 1 所示
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图 1　连续驯养装置
1.5　分析方法
1.5.1　双乙酰 、细胞大小 、酵母凝聚性 、麦汁浸出
物浓度和发酵外观浓度测定[ 2] 。
1.5.2　发酵液中谷胱甘肽含量[ 4] 。
1.5.3　羰基化合物含量(TBA)[ 5] :5ml麦汁或啤
酒在 10000 转/分下离心 10min 后 , 弃去沉淀物 ,
加入 2ml含 0.33%硫代巴比妥酸的 50%乙酸溶
液 ,混匀后于 60℃水浴中精确加热 60min , 速冷。
以 5ml离心后的麦汁或啤酒加 2ml蒸馏水为空
白 , 530nm 下吸光度即为 TBA值。
1.5.4　风味保鲜期预测值 RSV[ 5] :同一批次啤
酒分装 5 个小瓶 ,其中 4 瓶置于 60℃水浴中加速陈化 ,分别停留 12h , 24h , 36h , 48h 后放置 4℃保存。另
1 瓶作为对照一直放置 4℃保存。样品陈化完后 , 按 1.5.3 方法处理样品 ,以对照为空白测定 ΔTBA值 ,
按下式计算 RSV 值:
RSV= 1
4
( 12ΔTBA12h+
24ΔTBA 24h+
36ΔTBA36h+
48ΔTBA48h)
啤酒的 RSV 值越高 ,风味保鲜期越长。
2　结果与讨论
2.1　双乙酰连续驯养
双乙酰含量是啤酒成品的一项重要理化指标 , 也是啤酒成熟与否的一个重要标志。在啤酒酵母中 ,
双乙酰通过缬氨酸和亮氨酸的前体-α-乙酰乳酸非酶氧化产生 ,又通过酵母中的醇脱氢酶的作用还原
为 3-羟基丁酮。因此 , 降低酵母胞内α-乙酰乳酸的含量或提高醇脱氢酶的活性 , 都可以达到降低啤
酒中双乙酰含量的目的。
通过 UV 诱变 、甲磺隆抗性平板筛选 , 本研究室获得一株α-乙酰乳酸合成酶活性较低的 4#菌 , 与
出发菌株相比 ,其双乙酰峰值可降低 40%左右。在本文中 , 作者首先在锥形瓶中对 4#菌进行了外加不
同浓度双乙酰的间歇训养 ,结果表明(数据略):(1)经双乙酰间歇驯养后的菌株发酵 5d 后α-乙酰乳酸
和双乙酰的含量比不经驯养的出发株低得多;(2)若 500ml锥形瓶中麦汁装量为 200ml , 则外加双乙酰浓
度在(2～ 3)mg/ L 较为适宜。据此 ,作者利用 4根层析柱进行不同双乙酰浓度的连续驯养实验 , 其中两
批控制较好的连续驯养测定结果列于表 1。
表 1 4#菌双乙酰连续驯养测定结果＊
VDK(2.1mg/ L)＊＊ VDK(3.0mg/ L)＊＊＊
时间(d) 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7
细胞数(×105/m l) 22 8.5 1.3 0.84 0.77 0.68 0.63 33 21 6.5 1.5 0.95 0.87 0.84
出芽率(%) 27.5 29.4 23.5 17.6 20.3 18.5 19.8 22.9 14.6 17.6 13.2 16.8 17.8 18.5
α-乙酰乳酸+VDK(mg/ L) 0.89 0.76 0.33 0.26 0.26 0.26 0.25 0.74 0.42 0.25 0.24 0.24 0.25 0.24
外观发酵度(%) 56.8 51.8 58.6 52.5 52.9 52.9 54.0 70.0 73.4 73.6 73.4 73.2 72.4 73.0
　　＊流速为 6ml/ h ,温度 6℃,稀释率为 0.03h-1。
＊＊柱中初始细胞浓度为 29×106ml ,外观浓度为 5.9%。
＊＊＊柱中初始细胞浓度为 40×106ml ,外观浓度为 5.3%。
由于啤酒酵母在后酵过程中进行双乙酰的还原 ,因此 ,本文采用的双乙酰连续驯养装置其各项操作
参数必须尽可能地与啤酒后酵过程相近:(1)避免搅拌以保持严格的无氧状态;(2)流加液中必须有一定
量的乙醇以刺激醇脱氢酶活性的提高;(3)含双乙酰发酵液的流加速度必须尽可能慢 , 一方面可使双乙
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酰在柱中的停留时间延长 ,另一方面也有助于保持柱中发酵液的无氧状态。这样 ,作者根据啤酒发酵特
点设计的连续驯养装置 ,严格来说不同于通风发酵的连续培养系统 , 但这并不影响系统达到稳态(如表
1 所示 , 反应系统运行 4d 后各参数变化基本稳定)。实验中还发现 , 流加液中不同双乙酰浓度下系统达
到稳态后出口的双乙酰浓度基本一致 ,但柱中发酵液的外观发酵度则与起始细胞密度有较大关系。
驯养结束后从 4 根层析柱中取中上部发酵液 , 稀释涂布分离。共挑出 58 株菌 , 分别接种于锥形瓶
中 ,进行低温发酵试验。综合考虑细胞大小 、外观发酵度 、双乙酰和凝聚性等指标 ,选出 9 株菌进行稳定
性测试。表 2 为这 9 株菌的各项低温发酵指标和稳定性测试结果。
表 2 双乙酰连续驯养后分离株的低温发酵测试结果
添加 VDK 浓度酵母 2.1mg/ L②　　⑦　　⑨ 2.4mg/ LB-5　B-13 2.7mg/ LC-6　C-10 3.0mg/ LD-9　D-12
细胞大小(μm) 5.1×5.7　5.8×6.4　6.5×7.3 6.3×6.7　6.4×7.4 6.0×6.3　5.9×6.5 6.1×6.6　6.2×74
零代 VDK(mg/ L)＊ 0.77　　0.61　　0.86 0.66　　0.71 0.59　　0.65 0.66　　0.70
外观发酵度(%) 70.4　　68.1　　63.9 67.0　　67.8 63.3　　65.2 60.8　　64.6
1代VDK(mg/ L) 0.58　　0.45　　0.49 0.48　　0.46 0.57　　0.63 0.53　　0.48
外观发酵度(%) 70.5　　75.0　　68.5 68.9　　68.9 80.1　　71.5 80.1　　85.7
3代VDK(mg/ L) 0.53　　0.56　　0.35 0.35　　0.59 0.51　　0.31 0.38　　0.30
外观发酵度(%) 67.8　　63.2　　65.4 62.0　　63.2 70.7　　69.0 65.5　　73.7
4代VDK(mg/ L) 0.40　　0.33　　0.49 0.40　　0.53 0.44　　0.57 0.43　　0.48
外观发酵度(%) 71.6　　80.1　　70.5 78.7　　80.1 70.2　　72.2 71.6　　72.8
5代VDK(mg/ L) 0.32　　0.35　　0.35 0.40　　0.41 0.41　　0.52 0.46　　0.47
外观发酵度(%) 72.0　　73.0　　73.6 83.2　　77.9 72.5　　73.5 72.5　　71.5
真正发酵度(%) 72.7　　72.3　　72.1 72.1　　72.9 71.8　　72.0 70.9　　71.5
F 值(%) 48.4　　43.2　　37.0 51.2　　50.0 55.3　　52.8 49.5　　50.3
　　对细胞大小 、双乙酰含量 、外观发酵度及菌株稳定性等指标进行综合评价 , 最终选取②菌进行 EBC
管发酵 ,发酵结束后各项指标分析如表 3所示。作者也利用 1m3 小型啤酒发酵罐对②菌进行了中试研
究(过程曲线略),嫩啤酒双乙酰含量为 0.13mg/ L , 成品啤酒双乙酰含量为 0.06mg/ L , 真正发酵度为
65.6%, 啤酒风味基本不变。这些结果表明 , 利用双乙酰连续驯养手段来选育双乙酰还原快的啤酒酵母
十分有效。
表 3 ②菌 EBC管发酵分析结果
麦汁浓度(%) 真正浓度(%) 酒精浓度(w/ w%) 真正发酵度(%) VDK(mg/ L) pH 总酸(Imol/ LNaOHml/ 100ml)
嫩啤酒 11.7 4.39 3.75 62.5 0.18 4.2
成品啤酒 3.20 4.335 72.6 0.10 2.3
2　蛋氨酸连续驯养
啤酒的抗老化研究是近年来这一领域的热门研究课题[ 6 , 7] 。由于啤酒酵母在代谢过程中会产生一
些羰基化合物和具有还原性的物质(如谷胱甘肽GSH),前者是啤酒老化物质的前体 , 后者则能提高啤酒
的还原力 ,延长啤酒的老化期。因此 , 对啤酒酵母进行改良以提高啤酒抗老化能力的研究就归结到一个
目标:在减少羰基化合物产生的同时 , 提高酵母分泌还原性物质的能力。抑制啤酒酵母合成羰基化合物
的研究 ,作者将另文报道 , 本文主要讨论利用蛋氨酸连续驯养方法提高酵母分泌谷胱甘肽的能力。 日本
专利[ 8 , 9 , 10]报道 , 酵母用紫外线或亚硝基胍处理后 , 其蛋氨酸抗性菌株谷胱甘肽产量明显提高。因此 ,
本文首先对已经获得的低双乙酰②菌再次进行紫外诱变 , 蛋氨酸和 1 , 2 , 4-三氮唑浓度梯度平板筛选 ,
共挑出 45 株菌 ,经低温发酵初筛 、复筛 , 综合评价细胞大小 、羰基化合物(TBA)、双乙酰(VDK)、谷胱甘
肽(GSH)和 RSV 等各项指标 ,选取变异株②A 27进行蛋氨酸连续驯养。
蛋氨酸连续驯养与双乙酰连续驯养的不同之处在于 , 后者实际上是一个模拟的啤酒后酵过程 , 对氧
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和温度的要求比较严格 ,因此稀释率必须控制得很低。而前者则希望在酵母发酵过程中 , 通过连续流加
蛋氨酸提高酵母合成 GSH 的能力 ,进而提高酵母的抗老化能力。在本实验中将培养温度控制在 11℃
(啤酒的主酵温度),利用 4 根层析柱同时进行不同稀释率的蛋氨酸连续驯养实验(流加液中蛋氨酸浓度
为1.5%是根据实验确定的),待系统达到稳态后取柱中发酵液涂布蛋氨酸平板 ,结果共挑出 43 株菌 , 扩
培后进行低温发酵试验 , 4 个稀释率下各取 3 株综合指标较好的菌株进行比较 , 结果列于表 4。
表 4 蛋氨酸连续驯养稀释率对啤酒酵母的综合影响
D(h-1)酵母菌株
0.035
MⅠ4 MⅠ6 MⅠ13
0.06
MⅡ2 MⅡ5 MⅡ9
0.10
MⅢ3 M Ⅲ4 MⅢ7
0.14
M Ⅳ2 M Ⅳ7 MⅣ8 ② ②A 27
细胞大小 5.7× 6.0× 6.3×6.3× 6.1× 6.2×6.7× 6.8× 6.1×5.3× 6.2× 5.6× 5.1× 6.3×
(μm) 6.0 6.5 6.8 7.2 6.8 6.4 7.2 7.3 6.6 6.0 6.4 6.9 5.7 6.3
TBA 0.292 0.31 0.320.322 0.300 0.2710.24 0.272 0.2690.384 0.328 0.38 0.352 0.325
VDK(mg/ l) 0.15 0.27 0.21 0.23 0.26 0.30 0.38 0.35 0.35 0.37 0.31 0.27 0.39 0.38
GSH(mg/ l) 119.1 100.5 84.976.3 84.7 74.6 79.4 84.9 94.0 65.8 87.1 81.9 80.2 90.9
RSV ＊ 85.2 74.4 80.2 69.9 68.6 62.8 61.3 60.4 57.6 66.5 58.9 58.2 48.9 75.0
　　＊RSV 为主酵结束后的测定结果。
从表 4 可知 ,蛋氨酸连续驯养的稀释率越大 , 从中分离出的菌株的 RSV 值越低。稀释率对酵母分
泌 GSH 的影响则不甚显著。对细胞大小 、TBA 、VDK、GSH 和 RSV等指标进行综合评价 ,作者认为在蛋
氨酸连续驯养中仍然以较小的稀释率进行操作为佳。从稀释率 0.035h-1的层析柱中分离获得的 M I4 ,
各项指标较为满意(与驯养前的②A27相比 , GSH 含量和 RSV 值分别提高了 31%和 14%, TBA 值降低了
10%;与出发菌株②相比 , GSH 含量和 RSV 值则分别提高了 37%和 74%, TBA 值降低了 17%);因此在
1m3 发酵罐上对 M I4 菌进行中试(发酵过程曲线略),优选株 M Ⅰ4 与出发菌株②1m3 发酵罐上的结果比较
示于表 5。
如表5 所示 , 在原料及糖化 、发酵工艺完全相同的情况下 ,优选株 M I4 的羰基化合物产量比亲株②降
低了 19.1%, GSH 产量则提高了 29.6%;啤酒风味保鲜期可延长 92%。 由此可知 , 在不改变任何工艺
条件的前提下 ,只需采用常规育种手段与连续驯养相结合的方法 ,便可使啤酒酵母的某些性状得到大幅
度改良。
表 5　优选株 M I4 与出发菌株②1m3 罐发酵结果对比　
菌　　株 Parent st rain②Mutant strain M I4
麦汁浓度(%) 11.7 12.0
酒精浓度(W/W%) 3.95 4.15
发酵度(%) 65.8 66.7
总酸(1mol/ LNaOHml/ 100ml) 1.8 2.16
色度(EBC) 9.0 8.8
总多酚(mg/ L) 146 149
VDK(mg/ L) 0.08 0.07
TBA 0.220 0.178
GSH(m g/ L) 95.6 123.9
RSV ＊ 125 240
　　＊:RSV 为成品啤酒的测定值。
3　结论
3.1　对紫外诱变获得的双乙酰峰值低的啤酒
酵母突变株进行双乙酰连续驯养 , 可加快酵母
还原双乙酰的速度。连续驯养中外加双乙酰的
浓度对酵母还原双乙酰能力的影响不明显。
3.2　蛋氨酸连续驯养能提高经紫外诱变的啤
酒酵母分泌 GSH 的能力和 RSV 值。较低的稀
释率(0.035h-1)对提高菌株 RSV 值和产 GSH
能力较为有利。
3.3　添加特殊物质的连续驯养方法有利于改
良啤酒酵母的某些特性 , 有望成为优良啤酒酵
母选育的一个重要手段 ,但其作用机理还有待于进一步研究。
参考文献(略)
·13·1998.4(总 127)　　　　　　　　　　　　　　酿　酒