全 文 ：文章编号:1002-8110(2003)02-0063-02
收稿日期:2002-09-27
作者简介:张　伟(1963-), 男 , 河北省保定市人 ,副教授 , 学
士学位 ,现从事发酵工程方面的研究。
原生质体紫外诱变筛选还原双乙酰能力强的啤酒酵母
张　伟 ,袁耀武 ,檀建新 ,李英军 ,刘景武
(河北农业大学食品科技学院 ,河北 保定　071001)
摘　要:实验采用原生质体紫外诱变方法 ,对啤酒酵母进行处理 ,然后用双乙酰梯度板检测突变株还原双乙酰
能力 , 通过实验室摇瓶发酵 ,得到一株还原双乙酰能力强的菌株。
关键词:啤酒酵母;原生质体;紫外诱变;双乙酰
中图分类号:TS262.5;TS261.11　　　　文献标识码:A
1　材料
1.1　菌种
由河北农大食品科学学院微生物实验室提供。
1.2　培养基与试剂
1.2.1　完全培养基(YPD):蛋白胨 20g　葡萄糖 20g　酵母膏
10g　琼脂 20g
1.2.2　再生完全培养基(HYPD):在 YPD中添加 KCl0.6mol/ L
1.2.3　ZYCM 培养基:3%蛋白胨　0.5%酵母膏　0.5%酪蛋
白分解　4%葡萄糖　0.4%硫酸锌(w/v)
1.2.4　双乙酰
1.2.5　0.8mol/ L KCl溶液
1.2.6　2%蜗牛酶(配制时用缓冲液 ,微孔滤膜过滤除菌)
1.2.7　缓冲液:pH6.2 的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液加入
KCl至 0.8mol/ L
1.2.8　1%邻苯二胺
1.2.9　4mol盐酸
1.2.10　消泡剂:甘油　硅油
1.3　仪器
1.3.1　具有加热套的常规分析用定氮仪
1.3.2　756分光光度仪
1.3.3　恒温摇床
2　方法
2.1　原生质体制备
取活化后的 SM 菌种接种液体培养基 , 30℃、200rpm 恒温
摇床培养 12 ～ 14h , 离心收集培养对数期的酵母菌体 , 用
0.8mol/L KCl溶液洗涤两次 , 加入终浓度为 2%的蜗牛酶。
经实验测得最适 pH 值为 6.2 , 最适温度 30℃振荡处理 2h ,
3000rpm离心 10min , 再用 pH6.2 高渗缓冲液反复洗涤 2 ～ 3
次 ,除去残余的酶液 , 然后制成 107个细胞的细胞悬液。
2.2　原生质体再生:双层平板法
2.3　原生质体紫外诱变
取5mL原生质体细胞悬浮液于无菌培养皿中 ,置于 20w
紫外灯下距离 30cm 照射不同时间 , 用双层平板法计算存活
率。
2.4　初筛(双乙酰梯度板检测)
将250μg/mL双乙酰完全培养基 10mL 注入一与水平成
30°角的平皿中 ,制成双乙酰梯度板 ,将固化后 , 涂布 0.5mL菌
悬液待吸入后 ,注入一层约 10mL完全培养基在其上 ,将平皿
放水平 ,双乙酰浓度中 50μg/mL增加到 250μg/mL。变异菌株
悬浮细胞在每个梯度平板上分布浓度均为 105 , 在 18℃下培
养 55d。
生长在合流生长区前沿单菌落 ,再次转换 , 做进一步实
验。
同时对未经诱变的原菌株进行比较实验 , 挑选出还原能
力强的菌株。
2.5　摇瓶发酵实验
500mL三角瓶加入 300mL麦芽汁 ,麦芽汁浓度 10°P , 接种
初筛出来的菌株(经传代处理 4 代后), 接种量达到 106/ mL
个以上 , 12℃发酵 , 不同时间取 100mL 发酵液测定双乙酰含
量。
2.6　双乙酰的测定
邻苯二胺与双乙酰反应生成 2 , 3-二甲基苯丙咯嗪 , 其
盐酸在波长 335nm 处有一吸收峰 ,用作定量分析。
2.6.1　蒸馏
在一个 25mL量筒内放 2.5mL左右蒸馏水 , 置于蒸馏装
置冷凝器下端管口(冰水浴中), 于 100mL 量筒内加入 2 ～ 4
滴消泡剂 ,再加入酒样 100mL ,迅速加入已预先加热的蒸馏器
内进行蒸馏 ,直到馏出液接近 25mL时取下量筒 , 用蒸馏水补
足至 25mL。
注意:蒸馏时切勿使泡沫被蒸汽带出 , 为避免泡沫带出
也可以分两次加入。
2.6.2　反应
混匀溜出液 ,分别吸取 10mL加入比色管中 , 第一管加入
0.5mL邻苯二胺溶液 , 充分振荡混和后置于暗处 , 放置 20 ～
30min再加入4mol HCl盐酸溶液 2mL;第二管内加入 4mol HCl
溶液 2.5mL ,混匀。
注意:整步反应操作都应在低温下进行 , 以防双乙酰挥
发 ,显色反应应在冰箱中进行。
2.6.3　测定:用 756 分光光度计于波长 335nm 处 , 用 2cm 吸
第 30卷　第 2期
2 0 0 3 年 3 月　 　　　　　　　　　　　　　　　　　
酿　　酒
LIQUOR MAKING
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.30 , No.2
Mar., 　2003
收池以第二管为空白管 , 对照测定第一管的光密度 , 此项测
定应在 20min 内完成。
结果代入公式:双乙酰(mg/ L)=E×(1.2-0.01)
式中:E———光密度
1.2———光密度和双乙酰含量时换算系数
0.01———校正系数 , 与比较正确的方法测定结果作比
较时的差数
3　结果与讨论
3.1　原生质体的制备
不同生长期的酵母细胞对酶的敏感程度不同 , 也就是说
菌龄是影响原生质体形成的一个重要因素。 一般来讲对数
生长期早期的酵母细胞壁容易被酶溶解。
据文献报道:用 β -巯基乙醇和 EDTA 对酵母菌进行预
处理 ,可以提高蜗牛酶对酵母菌细胞壁的溶解效果。
在原生质体制备过程中 , 形成率达到一定高度时 , 随原
生质体形成率提高 , 再生率下降 ,本实验制备原生质体的目
的是去除酵母细胞壁对紫外线的阻碍作用。 过低的再生率
对诱变选育优良菌株不利。
在上述条件下 , SM菌的原生质体形成率>80%。
3.2　紫外线诱变剂量选择
紫外线具有杀菌和诱变双重生物学效应。 过高剂量致
死率容易产生负突变 , 据文献报道 , 一般致死率在 70%～
80%或更低剂量诱变效果更好。
紫外灯为 20瓦 , 距离为 30cm , 选择时间梯度为 15s , 20s ,
25s , 30s , 35s , 40s 进行紫外诱变处理 , 得出诱变致死曲线 , 如
图 1所示:
时间 15s 20s 25s 30s 35s 40s
致死率% 75 80.2 89.5 92.5 95 97.5
图 1　照射时间曲线
由图 1可知:对 SM 菌原生质体进行紫外诱变处理时 , 紫
外照射时间可选择 20S , 此时该菌原生质体诱变存活率为
20%左右。
3.3　初筛
以 SM 原菌株为标准 ,选取在双乙酰梯度板上 ,生长在比
原菌株浓度高的双乙酰梯度板上的菌株 , 挑出后做传代培
养 ,共挑选出 7 株。
3.4　摇瓶发酵
对突变株分别做摇瓶发酵试验 , 用比色法测发酵液的双
乙酰含量 ,所得数据列表如下 , 见表 1。
下述数据显示:突变 3 、突变 4 的降双乙酰能力优于原菌
株 ,突变 3 发酵三天后 , 双乙酰含量 0.27mg/L , 发酵五天后 ,
双乙酰含量 0.17mg/L , 显示出较强的降双乙酰能力 , 而且发
酵液有较好的风味 ,但发酵力略差。
突变 4三天发酵与五天发酵双乙酰含量相差不大 ,均低
于原菌发酵的含量。
表 1
突变株 3d发酵双乙酰含量(mg/ L)
6d发酵
双乙酰含量(mg/ L)
原菌 0.42 0.24
突变 1 0.46 0.26
突变 2 0.44 0.36
突变 3 0.27 0.17
突变 4 0.37 0.25
突变 5 0.51 0.31
突变 6 0.33 0.36
突变 7 0.53 0.30
另对突变 3做复发酵试验 , 测得结果如下:
表 2
菌株 3d发酵双乙酰含量(mg/ L)
6d发酵
双乙酰含量(mg/ L)
原菌株 0.42 0.33
原菌株 0.40 0.30
突变株 3 0.28 0.20
突变株 3 0.30 0.22
突变株 3 0.29 0.19
通过以上结果可以看出:通过紫外诱变后得到的突变株
3其发酵液在三天时的双乙酰含量与原菌株相比降低了
29%,此时为双乙酰高峰期 , 国外啤酒酵母的高峰期双乙酰
含量一般为 0.3～ 0.4mg/ L, 而经过诱变得到的菌株的高峰期
为 0.29mg/L与其相比略有降低 , 而与国内啤酒酵母相比有
显著的降低 ,在六天发酵时与原菌株相比降低了 35%, 接近
于国外啤酒酵母的还原能力 ,再通过工艺控制可以将双乙酰
降至很低水平 ,且该酵母凝絮性质好 ,发酵液风味良好 ,非常
适合于啤酒的酿造。
[ 参考文献]
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新工艺·新设备·新技术
本栏目由卢氏神曲独家协办
文章编号:1002-8110(2003)02-0065-04
连续细胞循环 ———真空发酵生产乙醇研究
王泽云 ,朱浩里 ,张　君 ,刘德华＊
(清华大学化学工程系 ,北京　100084)
摘　要:通过连续细胞循环实现了高菌体浓度发酵 ,常压连续细胞循环发酵生产乙醇产率为 9～ 10g/(h·L);通
过抽真空消除了乙醇抑制 , 连续细胞循环———真空发酵的乙醇产率达 23.03g/(h·L)。
关键词:乙醇;早籼米;真空发酵
中图分类号:TQ223.122　　　　文献标识码:A
0　前言
近年来 ,一方面由于我国杂交水稻技术的迅速发展 , 水
稻产量大幅度提高 ,市场出现严重供过于求的局面 ,尤其是
收稿日期:2002-11-16
作者简介:王泽云(1970-), 男 , 硕士 , 主要从事应用化学研
究。
早籼米因食用性较差而大量积压 , 导致米价下跌;而另一方
面 ,随着大庆油田产油量的下降及国内因汽车数量的大幅增
加汽油消耗量的日益增长 ,汽油价格持续升高。为解决这一
矛盾 ,国家已将发展燃料乙醇列为“十五”重点推广项目 。本
文以廉价的早籼米为原料 ,经液化 、糖化后 ,发酵生产乙醇。
这样不仅可以解决早籼米过剩的问题 , 而且发酵生产的燃料
乙醇可减少汽油的消耗量 ,从而控制油价的不断上涨。
[ 7] 李用芳.面包酵母原生质体的制备 、再生及紫外诱变的初步研究
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(3):26-27.
[ 9] 顾国贤.酿造酒工艺学[M] .182-183.
Mutagenesis-selection of Saccharomyces cerevisiae which have the better
ability of reducing diacetyl by protoplast mutagenization with UV.
ZHANG Wei , YUAN Yao-wu , TAN Jian-xin , LI Ying-jun , LIU Jing -wu
(Agriculture University of He Bei , Bao Ding 071001 , China)
ABSTEACT:This experiment used the technique of protoplast mutagenization with UV to deal with Saccharomyces cerevisiae.Several mutage-
nized strains which have the ability of reducing diacety.After fermentation in shaking flasks we analyzed the content of diacetyl in the Fermented
liquid , and we have got better mutagenization strains.
KEY WORDS:Diacetyl , Saccharomyces Cerevisiae , Protoplast Mutagenization with UV.diacetyl
第 30卷　第 2期
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酿　　酒
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　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.30 , No.2
Mar., 　2003