全 文 ：极大螺旋藻胞外多糖 EPⅡ的分离、纯化及免疫学研究
吴　洁　张成武 1　刘义峰 2
(中国药科大学微生物教研室 ,南京 210009; 1南京化工大学生物工程与科学系 ,南京 210009;
2南京大学医学院 ,南京 210008)
　　摘　要　极大螺旋藻培养液经浓缩 ,脱盐 ,醇沉得胞外粗多糖 ( EPI)。 EPⅠ 依次经 DE-52和
Sephadex G-100纯化得纯品多糖 ( EPⅡ )。 经 Sephadex G-200检测 , EPⅡ为均一组分 ,Mr 60 000。
薄层层析、气相层析、红外光谱分析表明 , EPⅡ是由 L-岩藻糖 , D-甘露糖 , D-半乳糖 , D-葡萄糖和葡
萄糖醛酸组成的酸性杂多糖 ,糖苷键为 β型。免疫调节活性试验表明 , EPⅡ有提高小鼠的 NK细胞
杀伤活力 ,促进 IL-2产生及淋巴细胞和混合淋巴细胞转化功能。
关键词　极大螺旋藻 ;胞外多糖 ;理化特性 ;免疫活性
　　螺旋藻 ( Spirulina )是一种无分支、螺旋
型的丝状蓝藻 ,蓝藻胞外多糖对其能在生态
环境中生存起着重要的作用 [ 1]。小谷野等 [2 ]
研究发现 ,盐泽螺旋藻 ( Spirul ina subsalsa )
胞外多糖对肉瘤 S180,肿瘤细胞株 IM C具
有明显抑制作用 ,同时具有免疫增强作用。我
们也发现 ,极大螺旋藻 ( Spirulina max ima )
胞外多糖 ( EPⅡ )对肿瘤细胞 K562有显著的
抑制作用 ,本文研究了 EPⅡ的分离纯化、初
步结构鉴定及部分免疫活性。
1　材　料
1. 1　极大螺旋藻 ( Spirulina max ima )
藻种来源于美国 Taxas大学藻种保藏
中心 ,选用 Zar rouk氏培养液 , 30± 5℃ ,光强
4000Lx ,充气培养 30d。
1. 2　试剂
DE-52, Sephadex G-100, Sephadex G-
200,标准 M r Dex t ran,咔唑 ,植物血凝素
( PHA)、四甲基偶氮唑盐 ( M TT)均为 Sigma
产品 , RPM I-1640培液粉为美国 GIBCO产
品 , K562人慢性粒细胞急变白血病细胞购自
中科院上海细胞生物学研究所。 其余为国产
BR. 或 AR试剂。
1. 3　仪器
721分光光度计为上海第三分析仪器厂
产品 ; Kontron Uvikon 860型紫外可见扫描
仪 ; Shimadzu GC-9A气相色谱仪 ; Nicolet-
170x FT 红 外 光 谱 仪 ; CO2 培 养 箱 ;
DG3022A酶标免疫检测仪。
1. 4　动物
BALB /c小鼠: 上海实验动物中心
2　方　法
2. 1　分离纯化
取 30d左右的培养液 ,绢筛过滤去藻体 ,
浓缩后透析除盐 ,乙醇沉淀 ,丙酮脱水干燥得
胞外粗多糖 ( EPⅠ ) , EPⅠ 经 DE-52柱层析
纯化 , 0. 1～ 3. 9mo l /L NaCl梯度洗脱 ,苯酚 -
硫酸法跟踪检测 ,收集单一峰 ,经 Sephadex
G-100柱层析进一步纯化得纯品多糖 ( EP
Ⅱ )。
2. 2　纯度鉴定及分子量检测 [ 3]
Sephadex G-200凝胶柱层析测其纯度 ,
99
药　物　生　物　技　术
Pha rmaceutical Bio technolog y　 1999 6( 2): 99～ 102
收稿日期: 1998-05-20
0. 1mo l /L NaCl洗脱 ,苯酚 -硫酸法检测 ,作
洗脱曲线 ,并测其洗脱体积 Vt,以兰色葡聚
糖和标准 M r分别为 10 400, 41 000, 71 400,
580 000的 Dex tran相继上柱 ,得 M r标准曲
线 ,根据样品所测洗脱体积 ,查标准曲线可得
多糖平均分子量。
2. 3　紫外光谱及红外光谱分析 [4, 5 ]
紫外光谱: 190～ 400cm- 1区间扫描 ;红
外光谱: KBr压片 , 4000～ 400cm- 1区间扫
描。
2. 4　单糖组成分析
2. 4. 1　薄层层析　以 2mol /L H2 SO4水解
浓缩样点硅胶板 ,展层剂为正丁醇∶乙酸乙
酯∶异丙醇∶醋酸∶水= 7∶ 20∶ 12∶ 7∶ 6,
苯胺-邻苯二甲酸显色。
2. 4. 2　糖腈乙酸酯衍生物的气相层析　据
文献方法 [ 6]将水解样进行干燥 ,糖腈乙酸酯
衍生化后进行气相色谱分析 ,色谱条件: 5%
OV-225 /ch romosorb W PV P 80～ 100目。
2. 4. 3　糖醛酸含量测定　硫酸 -咔唑试剂
法 [7 ] ,以葡萄糖醛酸为标样。
2. 5　 EPⅡ免疫活性测定 [8 ]
2. 5. 1　动物分组　分组: ( 1)正常对照组
( Normal g roup) ; ( 2)免疫功能低下组 ( Weak
g roup) (正常小组 2次注射环磷酰胺 ( cAMP
40mg /kg ) ,先静脉注射 , 4d后腹腔注射 ) ;
( 3)免疫功能低下组+ EPⅡ ( Weak+ EPⅡ )
(小鼠静脉注射 cAMP后 ,腹腔注射 EPⅡ ,
50mg /kg ,共 5d, d6进行检测 )。
2. 5. 2　淋巴细胞转化实验　取小鼠脾细胞
( 4× 107个 /m l) ,加 RPMⅠ -1640完全培养
液至 3ml,再加入 PHA 100μg ,置培养瓶中 ,
于 37℃ 5% CO2培养箱培养 48h,将细胞液混
匀 ,吸取细胞悬液 100μl加到 96孔板中 ,加
入 M T T继续培养 4h,于 570nm处测定 A
值。
2. 5. 3　混合淋巴细胞转化实验　取 BALB /
c鼠脾细胞 ( 5× 106个 /ml )和 N IH鼠脾细胞
( 5× 106个 /ml )各 100μl,加 PHA后于同样
条件培养 16～ 18h,悬液移入 96孔培养板
中 ,加入 M TT继续培养 4h,于 570nm测 A
值。
2. 5. 4　 IL-2活性检测　取转化的小鼠脾细
胞培养液上清 100μl,加入 96孔培养板中 ,再
加 CT LL细胞 100μl ( 1× 105个 /m l)同样条
件培养 48h,加入 M TT 继续培养 4h,于
570nm测 A值。
2. 5. 5　 NK细胞杀伤活力的检测　取小鼠
脾细胞 ( 2. 5× 107个 /ml )与 K562细胞 ( 5×
105 个 /ml )各 100μl混匀 , 1000r /min离心
5min,吸去悬液 ,细胞置 96孔培养板中培养
2h ,加冰的 RPM I-1640 50μl /孔 ,终止反应 ,
于 570nm处测 A值。 同时设自然释放管
( 100μl K562细胞 , 5× 105个 /ml ) ,按下式计
算 NK细胞杀伤活力。
杀伤活力% = 实验孔 A值 -自然释放孔 A值最大释放孔 A值 × 100
3　结　果
3. 1　纯度及分子量检测
DE-52与 Sephadex G-100柱层析所得
为纯品多糖 ,冷冻干燥所得的 EPⅡ为白色絮
状粉末 ,溶于水呈粘稠状 ,不溶于乙醇、丙酮
等有机溶剂 , Sephadex G-200柱层析洗脱峰
为单一对称峰 (见图 1) ,表明 EPⅡ为均一组
分 ,M r为 60 000(见图 2)
Fig 1　 Gel Chroma to g raphy of EPⅠ on Sephadex
G-200
100 　 　 　 药 物 生 物 技 术 　 　 第 6卷第 2期
Fig 2　 Determination of molecular weight of
EPⅡ by Sephadex G-200
3. 2　紫外光谱和红外光谱
EPⅡ 的紫外吸收光谱图无 260nm 和
280nm吸收峰 ,表明不含核酸和蛋白质 ,红外
光谱中两组宽峰 3387、 2954cm- 1为多糖特征
吸收峰 (见 Fig . 3)另外还存在 899cm- 1吸收
峰 ,表明 EPⅡ分子结构中存在 β型糖苷键。
Fig 3　 The inf rar ed spec trum o f EPⅡ
3. 3　单糖组成
EPⅡ完全酸水解产物经薄层分析显示 ,
EPⅡ单糖组成中存在 L-岩藻糖 , D-甘露糖 ,
D-半乳糖 ,葡萄糖醛酸 ,为进一步证实薄层
层析结果 ,将 EPⅡ水解产物糖腈乙酸酯衍生
化后经气相层析分析 ,结果多了葡萄糖的存
在 ,另外葡萄糖醛酸未出峰 ,这主要是由于葡
萄糖醛酸衍生化后极性仍较大 ,不易气化 ;而
葡萄糖由于含量较少 ,薄层层析灵敏度不高 ,
因而未检测出 ,以肌醇六乙酰酯为内标 ,根据
各个单糖的峰面积计算其摩尔比 ,并结合咔
唑法测糖醛酸含量结果 ,可得 EPⅡ中单糖的
组成比为: L-岩∶ D-甘∶ D-半∶ D-葡∶葡萄
糖醛酸 = 1. 00∶ 0. 13∶ 0. 060∶ 0. 035∶
0. 68。
3. 4　免疫活性测定
EPⅡ的免疫活性试验中 ,四种免疫指标
的检测结果如 Tab. 1所示: 在混合淋巴细胞
转化和 NK活力检测两组实验中 ,因环磷酰
胺引起的免疫功能低下的小鼠 ,腹腔注射 EP
Ⅱ后 ,与免疫功能低下组与正常对照组相比 ,
实验组均有显著提高 ( P < 0. 01) ,其中 NK
杀伤活力超过正常值近 1倍。在淋巴细胞转
化实验中 ,小鼠腹腔注射 EPⅡ后 ,与免疫功
能低下组相比 P< 0. 01,实验值 ( 45. 92)已与
正常对照值 ( 53. 33)无显著差异 , IL-2活性
检测有相似的结果。
Tab 1　 Results o f four immunolog ical activity a ssay s ( A× 100)
Immuno lo gica l activ ity No rmal g roup Weak g roup Weak+ EPⅡ
Lymphocyte t ransfo rmation 53. 33± 6. 08 39. 83± 31. 5* 45. 92± 4. 83
M ixed lymphocy te transfo rma tion 48. 92± 4. 19 46. 33± 5. 25 57. 42± 3. 00*
IL-2 production 26. 75± 3. 95 19. 25± 2. 60* 23. 25± 3. 14
Killing activ ity o f NK cells 69. 75± 6. 51 59. 75± 3. 88* 112. 0± 789*
　　　　* : Compa re w ith no rmal g roup ( P < 0. 01)
　　　　 : Compa re w ith w eak g roup ( P < 0. 01)
4　讨　论
我们从螺旋藻丝斜向纵切透射电镜的超
微结构中观察到 ,藻细胞壁外无明显的胶鞘
和粘液层结构 ,而培养液粘稠度较大 ,因此推
测藻细胞向壁外释放的多糖大部分溶解在培
101吴洁等:极大螺旋藻胞外多糖 EPⅡ的分离、纯化及免疫学研究
养液中。
一般认为 ,多糖的抗肿瘤活性机理在于
多糖能提高机体免疫功能而间接抑制肿瘤的
生长 [9 ] ,鉴于前人及本实验室在胞外多糖抗
肿瘤方面的实验结果 ,我们设计了此实验 ,从
实验结果可初步认为 ,螺旋藻胞外多糖具有
提高机体免疫功能的作用。
参 考 文 献
1 Filkwill D L. Production, iso la tion, preliminar y
charac terization o f the exopo ly saccharide of
Cyanobac terium Spirulina platensis. Biotechn
Lett , 1993, 15( 6)∶ 567
2 小谷野 . JP61-158926, 1985, 7, 18, 1
3 曾和平 ,郭宝江 .螺旋藻多糖的化学研究 .药学学
报 , 1995, 30( 11)∶ 856
4 吴梧桐 ,陈琼华 ,徐碧如 .银耳孢子多糖的分离和
分析 .真菌学报 , 1982, 1( 2)∶ 119
5 方积年 ,叶淳渠 ,刘玉荣 ,等 .竹黄多糖的研究 .生
物化学与生物物理学报 , 1980, 12( 4)∶ 365
6 李铁林 ,吴昌贤 ,张燕霞 ,等 .糖和糖醇的气相色
谱分析研究 .分析化学 , 1982, 10( 5)∶ 272
7 Dische Z. A new special co lo r o f hexuronic
acids. J Biol Chem , 1947, 167( 1)∶ 189
8 方福德 .现代医学实验技巧全书 .北京: 北京医科
大学和中国协和医科大学联合出版社 , 1995, 446
9 邹建华 .国外对多糖的抗肿瘤作用研究简况 .国
外医学中医中药分册 , 1991, 13( 6)∶ 321
Isolation, Purif ication and lmmunological Activities of
Extracel lular Polysaccharide EPⅡ from Spirul ina Max ima
Wu Jie, Zhang Chengwu
1 , Liu Yifeng
2
(Department of Microbiology ,China Pharmaceutical University ,Nanjing 210009;
1Department of B iotechnology and Science, Nanjing University of Chemical and
technology , Nanjing 210009; 2Medical College , Nanjing University , Nanjing
210008)
Abstract　 The raw ex t racellula r po lysaccharide ( EPⅠ ) was iso lated f rom the fermentativ e
solution through concentra ting、 desalting and precipi tating wi th ethanal sepa ra tely. EPⅠ was
further purified by loading on DE-52 and Sephadx G-100 column chromato g raphy, so EPⅡ
was obtained. EPⅡ was identified by sephadex G-200 to be homogenous, with the mo lecula r
w eight 6. 0× 104 . The ul t ravio let spectrum o f EPⅡ indica ted that nucleic acid and protein are
absent. The da ta of IR revealed that EPⅡ is chief ly linked by β -glyco sidic bonds. Chemica l
composi tion analy sis by TLC and GC showed that EPⅡ i s composed of L-fucose, D-
mannose, D-galato se, D-gluco se and g luco ronic acid. Immunological activ ity assays indicated
that EPⅡ could improve IL-2 production, killing activ ity of N K cells, lymphocyte
t ransforma tion and mixed lymphocy te response t ransfo rmation in mice.
Key Words　 Spirulina max ima , Ex tracellular poly saccha ride, Phy sico chemical properties,
Immunolo gical adjustment
102 　 　 　 药 物 生 物 技 术 　 　 第 6卷第 2期