全 文 ：基和抗氧化作用有关 [ 9] 。
近年来的研究发现多种植物生物碱具有抗肿瘤活性作
用 [ 10] 。本实验首次发现马齿苋生物碱对人 A-549、Hela和 Hep
-2细胞的增殖 , 以及荷瘤小鼠的肿瘤生长均具明显的抑制作
用 , 但对 RD细胞没有抑制效果 , 对瘤株的抑制作用具有广谱性
和选择性。但其抗肿瘤作用的机理及抗瘤谱值得进一步深入研
究。
早期研究发现多不饱和脂肪酸(PUFA)具有抑制肿瘤细胞
生长的作用 , 近期有学者认为不同种类 PUFA的作用也存在差
异 , n-3 PUFA可抑制肿瘤生长 , 而 n-6 PUFA的作用则相
反 [ 11] 。在本研究中 ,马齿苋脂肪酸(n-3 PUFA)对 Hep-2细胞
增殖有抑制作用 , 实验结果与有关 n-3PUFA的报道一致 [ 11] 。
综上所述 , 不同的活性成分对肿瘤细胞株的敏感性不同 ,具
有明显的选择性。目前关于马齿苋活性成分为何对瘤株具有选
择性和究竟是通过何种机制抑制肿瘤细胞的还不十分清楚 ,本课
题组正进一步对其进行深入研究 ,期待为更好开发利用马齿苋活
性成分提供更全面的理论依据。
参考文献:
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收稿日期:2009-01-14;　修订日期:2009-06-20
基金项目:广西教育厅自然科学基金项目(No.200710MS014);
广西大型科学仪器协作共用网资助项目(No.601-2008-014)
作者简介:林　兴(1975-),男(壮族),广西来宾人 ,现任广西医科大学讲
师 ,硕士学位 ,主要从事生化药理学 、心血管药理学研究工作.
＊通讯作者简介:黄仁彬(1955-), 男(汉族),广西南宁人 , 现任广西医科
大学教授 ,博士生导师 ,硕士学位 ,主要从事心血管药理学 、生化药理学教
研工作.
六月青总皂苷对 HepG2.2.15细胞 HBV复制的抑制作用
林　兴 1 , 黄权芳2 , 张士军 1 , 刘　曦1 , 黄仁彬 1＊
(1.广西医科大学 ,广西 南宁　530021;　2.广西中医学院附属第一医院 ,广西 南宁　530023)
摘要:目的 观察六月青总皂苷(theterpenoidsofLiuyueqing, TLYQ)体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用。方法 采用血清
药理学方法 , 在 HBV的体外细胞培养系统中(2.2.15细胞)进行 TLYQ抗 HBV作用观察。 结果 TLYQ含药血清在
HepG2.2.15细胞培养中可有效地抑制细胞 HBVDNA的复制 ,其作用呈明显的量效和时效反应关系。结论 TLYQ在体
外能明显抑制 HBV, 是六月青主要活性成分之一。
关键词:六月青总皂苷;　乙型肝炎病毒;　HepG2.2.15细胞
中图分类号:R284　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2009)11-2728-02
TheInhibitoryEffectoftheTerpenoidsofLiuyueqingonHBVDNAintheHepG2.2.15
Cels
LINXing1 , HUANGQuan-fang2 , ZHANGShi-jun1 , LIUXi1 , HUANGRen-bin1＊
(1.GuangxiMedicalUniversity, Nanning530021, China;2.TheFirstAfiliatedHospitalofGuangxiTradition-
alChineseMedicalUniversity, Nanning530023, China)
Abstract:ObjectiveTostudyanti-HBVactivityoftheterpenoidsofLiuyueqing(TLYQ)invitro.MethodsTheHBVinvitro
celculturesystem(HepG2.2.15cel)wasusedforexaminingtheanti-HBVactivityofTLYQwithSerum-pharmacology.Re-
sultsTheserumcontainingTLYQcoulddecreasetheHBVDNAlevelinHepG2.2.15cell, anditsinhibitoryefectsweredose-
andtime-dependent.ConclusionTLYQcaninhibitHBVDNAinvitrosignificantly, anditmaybeoneofthemainactivecom-
ponentsofLiuyueqing.
Keywords:TheterpenoidsofLiuyueqing(TLYQ);　HBV;　HepG2.2.15 cell
　　六月青(Liuyueqing, TLYQ)系爵床科(Acanthaceae)植物肖鸡 笼(顶花马兰)Taraphochlamysafinis(Grif)Bremekhu[ Strobilan-
thesafinis(Grif)Y.C.Tang]的干燥地上部分 [ 1] 。六月青是复方
六月雪(CLYX)主要成分之一 , 本课题组前期研究表明 , CLYX具
有明显地抗 HBV[ 2, 3]和改善急性化学性肝损伤的作用 [ 4] 。本研
究以转染有 HBVDNA的 HepG2.2.15为模型 , 采用中药血清药
理学方法 , 观察 TLYQ对 HBV复制的影响 , 并初步探讨其作用机
制 , 为筛选出六月青中抗 HBV主要活性部位提供实验依据。
1　材料与仪器
1.1　药物 六月青总皂苷 , 由广西医科大学药理学教研室和广西
医学科学实验中心自行提取。
·2728·
时珍国医国药 2009年第 20卷第 11期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.11
1.2　动物 Wistar大鼠 , 雌雄各半 ,体质量(250
±10)g, 由广西医科大学实验动物中心提供。
1.3　细胞株 HepG2.2.15细胞株 , 购自北京医
科大学第一附属医院病毒研究所 , 本室自行传
代 , 定期用 G418筛选。
1.4　试剂 阿昔洛韦(AciclovirACV):湖南迪
诺制药有限公司医药工业研究所产品 , 批号:
20070518;RPMI1640培养基:美国 Gibco公司 ,
Cat№ 21202 -016;胎牛血清:美国 Gibco公司 ,
Cat№ 21607 -042;G418:美国 Sigma公司 , Cat
№ 228527-72;HBVDNA荧光定量 PCR试剂
盒:深圳匹基生物工程股份有限公司 , 批号:
20070613。
1.5　仪器 iCyclerFQ实时荧光定量 PCR仪:
美国 Bio-Rad公司;CO2 孵箱:美国 ThermoForma公司 , Model311。
2　方法
2.1　六月青总皂苷的制备 六月青粗粉 1.0
kg,加 10倍量 80%乙醇回流提取 3次 , 1.5 h/
次 , 减压回收乙醇至无醇味 , 分别用石油醚 、氯
仿 、醋酸乙酯萃取 , 弃去有机溶剂萃取液 , 最后
再用水饱和正丁醇萃取 ,取正丁醇萃取液减压
浓缩至干 , 得到 41.28 g浸膏 , 上处理好的 AB
-8型大孔树脂柱(40 mm×800 mm), 分别用
6BV的 30%乙醇和 50%乙醇洗脱 , 收集醇洗脱
液 , 减压回收乙醇 , 60℃的减压恒温干燥箱中
干燥得 4.28 g淡黄色化合物 , 经常规化学定性
试验证实为皂苷类 , 利用香草醛 -硫酸分光光
度法测定总皂苷含量 [ 5] , 纯度为 85.8%。
2.2　TLYQ含药血清的制备 3月龄 Wistar大
鼠 50只 , 随机分为 5组 ,每组 10只。 ①空白对
照组:予等量的生理盐水;②阳性对照组:ACV
0.1×10-3 g· kg-1· d-1;③TLYQH组:28.2×
10-3 g· kg-1· d-1(相当于生药 6.6 g.kg-1·
d-1);④TLYQM组:14.1 ×10-3 g· kg-1· d-1
(相当于生药 3.3 g· kg-1 · d-1);⑤TLYQL
组:7.1×10-3 g· kg-1· d-1(相当于生药 1.7 g
· kg-1· d-1)。各组动物在同样条件下饲养 ,
均以 2次 /d, 早晚各 1次空腹灌胃 , 连续给药 7
d。于末次灌胃(灌胃前禁食不禁水 12 h)后 2
h,乙醚吸入麻醉 , 腹主动脉抽血 ,低速离心分离
血清 , 并将每组动物的血清混合。经 56℃ 30
min灭活处理 , 经 0.45 μm的微孔滤膜 , 再经
0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后 , 置 -20℃冰箱
保存备用。
2.3　荧光定量 PCR(FQ-PCR)法检测 HBV
DNA 取 HepG2.2.15细胞 1瓶 , 用胰酶消化
后制备成单细胞悬液 , 计数后调整细胞浓度至
2×104 cel· ml-1 ,加入 24孔细胞培养板 , 每孔
900μl, 置 CO
2
孵箱(37℃, 5%CO
2
)中培养 24h
后 , 分别加入各组含药血清 100 μl, 每个浓度 3
个复孔。以等量的完全培养液为空白对照。连
续培养 72h后 , 分别吸出上清液于 1.5 ml灭菌
Eppendor管中 , -20℃保存 , 统一待检。再次
加入上述含药血清的培养液继续培养 72 h后 ,
分别吸出上清液于 1.5 ml灭菌 Eppendorf管
中 , -20℃保存 ,统一待检。
　　按试剂盒方法提取样品 HBVDNA。 HBVDNA定量标准品由深圳匹某公司直
接提供。各反应管放入 FQ-PCR仪 , 按以下条件进行扩增:94℃预变性 1 min,
95℃变性 5s, 60℃退火 、延伸 20 s。共反应 42个循环。扩增过程及荧光信号检查 、
数据的储存和分析均由仪器及其自带的软件自动完成。
2.4　统计学处理 采用 SPSS10.0统计软件分析数据 , 组间比较采用方差分析 , 各
均数两两比较。
3　结果
与空白对照组比较 , TLYQ中 、高剂量含药血清作用 72, 144 h后 , HepG2.2.15
细胞上清液中 HBVDNA的拷贝数明显降低(P<0.05或 P<0.01), 提示对 HBV
DNA具有显著的抑制作用 ,并且随着药物浓度和作用时间的增加 , 其抑制作用逐
渐增强 ,呈现一个明显的量效和时效反应关系。结果见表 1。
表 1　TYLQ含药血清对 HepG2.2.15细胞 HBVDNA的抑制作用( x±s)
组别 剂量C/g· kg-1· d-1
72 h
HBVDNA拷贝数 抑制率(%)
144h
HBVDNA拷贝数 抑制率(%)
空白对照 - 6.35±0.45 - 25.61±4.57 -
ACV 0.1×10-3 3.37±0.68＊ 46.9 8.56±3.79＊＊ 66.6
TLYQL 7.1×10-3 5.26±0.44 17.2 19.72±5.48 23.0
TLYQM 14.1×10-3 4.17±0.65＊ 34.3 15.34±4.19＊ 40.1
TLYQH 28.2×10-3 3.69±0.77＊ 41.9 12.66±5.13＊＊ 50.6
　　与空白对照组比较 , ＊P<0.05, ＊P<0.01;n=3
4　讨论
复方六月雪(CLYX)是通过长时期的民间临床观察而拟定的治疗急慢性乙型
肝炎和肝硬化的验方 ,主要由广西民间草药六月青 、白花蛇舌草 、栀子花根等组成 ,
本课题组前期大量的实验研究表明 , 该方可有效地抑制鸭乙型肝炎病毒 DNA和
HepG2.2.15细胞 HBVDNA的复制 [ 2 , 6 , 8];无毒浓度的 CLYX在 HepG2.2.15细胞
培养中可有效地抑制细胞 HBVDNA的复制及 HBsAg(乙型肝炎表面抗原)和
HBeAg(乙型肝炎 E抗原)的分泌 [ 3 , 7];此外 , CLYX对 CCl4、AP、D-Gal所致小鼠急
性化学性肝损伤均有明显的保护作用 , 并由此推测其保肝作用可能与诱导肝药酶
有关 [ 4] 。
中药复方成分非常复杂 ,其组方配伍多数是以某一味药为主其余为辅 ,诸药发
挥协同治疗作用。为了能更好地保证 CLYX疗效稳定性 , 本研究对该方中的君药
(六月青)进行研究 ,即从六月青提取分离出总皂苷活性部位 , 并对其进行抗 HBV
药效学研究 ,筛选出该方有效活性部位 ,进而为下一步分离纯化有效化学成分 , 建
立处方质控标准提供实验依据。本实验结果表明 , TLYQ中 、高剂量含药血清作用
72, 144 h后 , HepG2.2.15细胞上清液中 HBVDNA的拷贝数明显降低(与空白对
照组比较 , P<0.05或 P<0.01),提示对 HBVDNA具有明显的抑制作用 , 并且随
着药物浓度和作用时间的增加 ,其抑制作用逐渐增强 ,呈现一个明显的量效和时效
反应关系 ,鉴于此 , 认为总皂苷应是六月青主要活性部位之一。
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.11 时珍国医国药 2009年第 20卷第 11期