全 文 ：ChineseJournalofNewDrugs2011, 20(2)
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中国新药杂志 2011年第 20卷第 2期
[基金项目 ] 　广西教育厅自然科学基金项目(200710MS014);广西
科学研究与技术开发计划项目(桂科攻 0322024-5E);广西自然科学
基金(2010GXNSFB013065)
[作者简介 ] 　丁华 , 女 ,博士研究生 ,主治医师。联系电话:(0771)
3276313, E-mail:huahua2211@yahoo.cn。
[通讯作者 ] 　林兴 ,男 ,副教授 ,主要从事抗乙肝 、肝纤维化及心血管
疾病研究。联系电话:(0771)5358342, E-mail:gxLx60@ 163.com。
·实验研究·
六月青皂苷抗鸭乙型肝炎病毒及保护肝细胞的研究
丁　华 1 ,林　兴2 ,黄权芳 3 ,张士军 2 ,黄仁彬2
(1广西医科大学第一附属医院 ,南宁 530021;2广西医科大学 ,南宁 530021;
3广西中医学院第一附属医院 ,南宁 530023)
　　[摘要 ] 　目的:观察六月青皂苷(thesaponinsofLiuyueqing, TLYQ)抗鸭乙型肝炎病毒(duckhepatitisB
virus, DHBV)与保护肝细胞的作用 。方法:将 DHBV-DNA阳性麻鸭随机分为 TLYQ高 、中 、低剂量治疗组 、
拉米夫定组和模型组 ,分别给予相应药物进行干预。用药前 、后 7d, 14 d及停药后 7 d,取静脉血 ,检测 DH-
BV-DNA拷贝量和 ALT/AST变化情况 。结果:TLYQ大剂量组给药后 d7, d14即能明显抑制 DHBV-DNA,
停药后仍有一定的抑制作用 。中 、低剂量组与模型组比较 ,有一定的病毒抑制作用。在用药后 d14 ,停药后
d7, ALT/AST较模型组明显下降 ,有显著性差异 。结论:TLYQ具有有效抑制 DHBV-DNA和保护肝细胞的
作用。
[关键词 ] 　六月青皂苷;鸭乙型肝炎病毒;实时荧光定量聚合酶链反应
[中图分类号 ] R978.7　　[文献标志码 ] A　　[文章编号 ] 1003-3734(2011)-02-0167-04
SaponinsofLiuyueqinginhibitsduckhepatitisBvirusandprotectshepatocytes
DINGHua1 , LINXing2 , HUANGQuan-fang3 , ZHANGShi-jun2 , HUANGRen-bin2
(1 TheFirstAfiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity, Nanning530021, China;2GuangxiMedical
University, Nanning530021, China;3 TheFirstAfiliatedHospitalofGuangxiTraditionalChinese
MedicineUniversity, Nanning530023, China)
[ Abstract] 　Objective:ToobservetheinhibitoryefectsofthesaponinsofLiuyueqing(TLYQ)onduck
hepatitisBvirus(DHBV)andtheprotectingefectonhepatocytes.Methods:DucklingswereinfectedwithDH-
BVandrandomlydividedinto3TLYQdosegroups, lamivudineanduntreatedgroups.Bloodsamplesweretaken
beforeand7 , 14 daysaftertreatment, and7daysafterdrugwithdrawal.BloodlevelsofDHBV-DNAandALT/
ASTweredetected.Results:ThelevelofDHBV-DNAmarkedlydropped7 and14 daysaftertreatmentwith
high-doseTLYQ.Low-andmoderate-dosesofTLYQalsoshowedsomewhatinhibitingefectsonDHBV-DNA.
ThelevelsofALT/AST14 daysaftertreatmentand7 daysafterdrugwithdrawalwereobviouslylowerinTLYQ
highdosegroupsthaninhepatitiscontrolgroup.Conclusion:TLYQcaninhibitreplicationofDHBVandprotect
hepatocytes.
[ Keywords] 　thesaponinsofLiuyueqing(TLYQ);duckhepatitisBvirus;realtimefluorescentquantity
polymerasechainreaction(FQ-PCR)
　　乙型肝炎是一类严重危害人类健康的传染疾
病。研究表明 [ 1] ,乙型肝炎的发病主要与免疫力低
下 、病毒持续感染和进行性肝细胞损伤有关 ,而中药
提取物兼顾这三方面 ,从而可提高疗效。六月青是
复方六月雪 (CLYX)的主要成分之一 ,本课题组前
期研究表明 [ 2-4] , CLYX具有明显的抗 HBV和保护
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急性化学性肝损伤的作用。本实验利用动物实验模
型 ,研究六月青皂苷 (thesaponinsofLiuyueqing,
TLYQ)的抗病毒及保护肝细胞作用 ,为分离寻找有
效成分 、研制抗乙肝病毒和保护肝细胞的新型药物
提供理论依据 。
材　　料
1　药物与试剂
六月青采于广西灵山县 ,经广西中医学院第一
附属医院黄权芳中药师鉴定为爵床科植物肖鸡笼
(顶花马兰)Taraphochlamysafinis(Gif)Bremekhu
(Strobilanthesafinis(Grif)Y.C.Tang)的干燥地上
部分;拉米夫定 ,中国苏州葛兰素史克制药有限公司
产品 ,规格:100mg·片 -1 ,批号:07090016;ALT, AST
试剂盒 ,南京建成生物工程研究所提供 。
2　动物
1日龄广西麻鸭 ,雌雄兼用 ,体重 40 ～ 50 g,购
自广西畜牧良种养殖场 。
3　引物
参照文献 [ 5]设计序列 ,上游引物:5-AACCAT-
TGAAGCAATCACTAGAC-3, 下游引物:5-ATCTAT-
GGTGGCTGCTCGAACTA-3, 目的片段大小为 218
bp,由上海基康生物技术有限公司合成。
方　　法
1　TLYQ的制备
TLYQ由广西医科大学药理学教研室和医学科
学实验中心自行提取 ,经常规化学定性试验证实为
皂苷类 ,纯度为 85.8%[ 6] 。
2　广西麻鸭乙肝动物模型的建立
1日龄雏鸭(健康成年广西麻鸭蛋孵化),经腹
腔注射 0.2 mLDHBV-DNA强阳性病毒血清 。接种
7 d后 ,分别从胫静脉采血约 0.2 ～ 0.3 mL左右 ,装
入一次性 Eppendof管中 ,整个过程注意不要交叉污
染 。 4 000 r·min-1离心 5 min,取血清。 -20 ℃保
存备用。采用 PCR法检测筛选出感染阳性鸭。
3　实验分组及用药
经 PCR法检测筛选出感染阳性鸭 ,饲养至 13
日龄作为实验动物进行药物治疗实验。将 50只广
西麻鸭随机分为 5组 ,每组 10只:①模型组:等量
生理盐水。 ②拉米夫定组:灌胃给予拉米夫定 0.05
g·kg-1·d-1。③ TLYQ低剂量组:灌胃给予 TLYQ
0.5g·kg-1·d-1 (相当于生药 12 g·kg-1·d-1 )。
④ TLYQ中剂量组:1.0 g·kg-1·d-1(相当于生药 24
g·kg-1·d-1)。 ⑤ TLYQ高剂量组:2.0 g·kg-1·d-1
(相当于生药 48g·kg-1·d-1)。每天早上 8 ～ 9点钟
左右灌胃(ig)给药 , qd,连续 14 d,实验期间动物自
由取食和饮水。并于用药前 0 d,用药 7 d和 14 d,
停药 7 d(P7)时 ,分别从胫静脉采血 ,每只 0.5 mL
左右 ,分离血清 ,于 -20℃保存备用。
4　荧光定量 PCR检测技术检测血清 DHBV-DNA
鸭乙型肝炎病毒(DHBV)-DNA的提取:采用直
接加热法 。每次取血清 100 μL, 沸水浴 10 min,
10 000r·min-1离心 5min。加样:2×SYBRPremix
ExTaqTM 12.5μL;10μmol·L-1上游引物 1.0μL;10
μmol·L-1下游引物 1.0μL;加无菌双蒸水至 23μL;
血清提取物 2.0μL。荧光定量 PCR检测技术(FQ-
PCR)反应条件:95℃变性 10s, 55℃退火 20s, 72℃
延伸 30s,共反应 45个循环 。FQ-PCR的结果判读:
扩增过程及数据的储存和分析均由仪器及自带软件
自动完成。
5　ALT与 AST检测
各组分别在用药前 、用药后 d7, d14,以及停药
d7,取静脉血 ,分离血清 ,用全自动生化分析仪检测 。
6　统计学处理
数据以 x±s表示 ,应用 SPSS13.0软件进行统
计分析 ,采用配对 t检验。
结　　果
1　治疗前后鸭血清 DHBV-DNA水平变化
TLYQ各剂量组 DHBV-DNA拷贝数下降程
度与用药剂量及用药时间相关 ,其中 , 低剂量组
DHBV-DNA拷贝数于 d7 , d14都有不同程度的
下降 ,但没有显著性差异 ,中剂量组于 d14 , 高
剂量组则于 d7 , d14明显下降 (P<0.05), 各
治疗组停药后 7 dDHBV-DNA拷贝数未见明显
增高 。
拉米夫定对照组用药后 ,血清 DHBV-DNA拷贝
数开始明显下降 , d14下降到最低值 ,停药 7 d后
DHBV-DNA拷贝数即回升至药前水平 ,病毒含量变
化总体表现为用药时持续下降 、停药即出现反跳的
规律。结果见表 1。
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表 1　治疗前后鸭血清 DHBV-DNA水平比较 x±s, n=10
组　别　 剂量 /g·kg-1·d-1 DHBV-DNA(拷贝数·mL
-1)
d0 d7 d14 P7
模型对照组 — 2.16±1.22 2.42±1.50 2.31±1.12 2.29±1.38
拉米夫定组 0.05 2.13±1.17 1.01±0.50b 0.50±0.56b 2.23±1.13
低剂量六月青皂苷组 0.5 2.15±1.01 1.68±0.98 1.48±0.85 1.74±1.07
中剂量六月青皂苷组 1.0 2.09±1.33 1.55±1.39 0.87±0.72b 1.66±0.97
高剂量六月青皂苷组 2.0 2.18±2.29 1.15±0.83a 0.79±0.41b 1.34±0.63a
　　与模型组比较 , a:P<0.05;b:P<0.01(下同)
2　各组不同时间 ALT与 AST变化情况
拉米夫定组及六月青皂苷各剂量组在给药后血清
ALT与 AST均较模型组下降 ,其中 ,高剂量组于 d14
和 P7下降更为显著(P<0.05)。结果见表 2和表 3。
表 2　治疗前后鸭血清 ALT水平变化情况 x±s, n=10
组　别　 剂量 /g·kg-1·d-1 ALT/IU·L
-1
d0 d7 d14 P7
模型对照组 — 59.57±15.61 62.82±14.15 66.52±14.34 65.91±13.16
拉米夫定组 0.05 56.93±17.28 51.64±11.76a 37.41±11.68b 46.55±12.96a
低剂量六月青皂苷组 0.5 57.61±13.43 56.49±15.18 51.47±16.71 55.88±14.62
中剂量六月青皂苷组 1.0 55.13±16.41 53.69±14.72 46.63±15.39 51.75±17.77
高剂量六月青皂苷组 2.0 62.15±18.25 56.15±15.93 43.11±10.87a 48.61±11.39a
表 3　治疗前后鸭血清 AST水平变化情况 x±s, n=10
组　别　 剂量 /g·kg-1·d-1 AST/IU·L
-1
d0 d7 d14 P7
模型对照组 — 42.05±12.38 44.96±13.62 45.76±13.98 44.51±12.86
拉米夫定组 0.05 40.72±17.86 35.43±9.55a 28.46±9.77b 30.31±8.75a
低剂量六月青皂苷组 0.5 45.38±11.21 41.83±10.11 37.16±12.36 41.74±11.06
中剂量六月青皂苷组 1.0 43.05±11.76 38.19±11.87 32.87±13.33 35.42±10.17
高剂量六月青皂苷组 2.0 44.62±12.98 36.19±8.56a 30.79±9.48a 31.55±8.56a
讨　　论
DHBV属嗜肝 DNA病毒科 ,与人 HBV的分子
结构 、生物学特性和发病机制存在诸多相似之处。
近年来 ,国内外学者多用 DHBV感染鸭作为乙型肝
炎动物模型 ,研究人类乙型肝炎发病机理 、病毒复制
过程及筛选有效的治疗药物。研究发现[ 7] , 1 ～ 3日
龄雏鸭感染 DHBV后 , 可长期维持血清病毒症阳
性 , DHBV-DNA水平于感染后两周左右达高峰。因
此 ,本实验采用 1日龄雏鸭经腹腔感染 DHBV的方
法建立鸭乙型肝炎动物模型 ,研究 TLYQ的体内抗
病毒作用 。
本实验结果表明 , TLYQ具有一定的体内抑制
DHBV的作用 ,起效较慢 ,疗效与用药剂量和时间相
关。高剂量 TLYQ组在治疗 d7显效 ,中剂量组在
治疗 d14显效 ,低剂量组在治疗期间未见明显的抑
制病毒作用 。高剂量 TLYQ组在停药后仍显示明显
的病毒抑制作用 。拉米夫定抑制 DHBV起效较早 ,
在治疗 d7,其病毒 DNA拷贝数已降至较低水平 ,但
停药后病毒含量又立即回升 。拉米夫定组比较 ,
TLYQ起效慢 ,但其抑制病毒复制的作用平稳而持
久 ,提示 TLYQ抑制体内 DHBV复制的机制与拉米
夫定存在差异。
在抗肝损伤方面 ,肝功能 ALT与 AST检测显
示 , TLYQ中 、低剂量组具有改善鸭肝功能的趋势 ,
(下转第 186页)
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3.6　耐用性试验
取重复性试验 4的 20060220-3批供试品溶液 ,
分别改变色谱柱品牌 ,或梯度洗脱条件 ,结果如下。
试验 1:即重复性试验 4, 色谱柱为 ZORBAX
SB-C18(250mm×4.6mm, 5μm);试验 2:色谱柱为
KromasilC18(250mm×4.6mm, 5μm);试验 3:色谱
柱为 AgilentExtend-C18(250mm×4.6 mm, 5μm);
试验 4:色谱柱为 KromasilKR-5 C18 (250 mm×4.6
mm, 5μm);并稍微调整流动相如下:以乙腈为流动
相 A,以 1%乙酸溶液为流动相 B,进行梯度洗脱 ,在
0 ～ 20min内 ,流动相 A从 20%渐升至 50%,流动相
B从 80%渐降至 50%。
分别按上述试验条件进行样品含量测定 ,测定结果
分别为 16.71, 16.91, 16.98, 16.99μg·mL-1;与改变条件前
测定结果 16.79μg·mL-1比较 ,相对偏差分别为 0.24%,
0.36%, 0.56%, 0.59%;平均相对偏差为 0.44%。
4　样品的测定
对 3个厂家的产品分别进行测定 ,结果见表 2。
表 2　样品含量测定结果
厂　家　 批号 哈巴俄苷含量/mg·瓶 -1 厂　家　 批号
哈巴俄苷含量
/mg·瓶 -1
内蒙古津新药业有限公司 20060220-1 1.68 湖南三九南开制药有限公司 20060402 1.43
内蒙古津新药业有限公司 20060220-3 1.68 吉林草还丹药业有限公司 060501 1.15
湖南三九南开制药有限公司 20060401 1.80 吉林草还丹药业有限公司 060502 1.14
讨　　论
1　检测波长的选择
根据哈巴俄苷 UV扫描图谱 ,并参照 《中华人民
共和国药典 》2005年版一部玄参项下含量测定项 ,
选择 278nm作为检测波长 。
2　提取条件的考察
生乳灵与生乳汁皆为黑棕色的黏稠液体 ,难以
直接进样测定 ,本研究选用水饱和正丁醇提取以除
去水溶性杂质 ,经考察 ,水饱和正丁醇第 6次提取液
中已检测不到哈巴俄苷 ,故确定用水饱和的正丁醇
振摇提取 5次 ,每次 10mL。
[ 　参　考　文　献　]
[ 1] 　谢丽华 ,刘洪宇 ,钱瑞琴 ,等.哈巴苷与哈巴俄苷对阴虚小鼠免
疫功能及血浆环化核苷酸的影响 [ J] .北京大学学报(医学
版), 2001, 33(3):26-27.
[ 2] 　孙业成.高效液相色谱法测定利咽灵片中哈巴俄苷的含量
[ J].中国药师 , 2007, 10(12):1223-1224.
编辑:周卓 /接受日期:2010-03-24
　(上接第 169页)
高剂量组作用显著 (P<0.05),提示皂苷还具有保
护鸭肝细胞 、抗肝损伤的作用。
综上所述 , TLYQ有抑制 DHBV复制 、护肝降
酶 、改善肝脏病理等作用 ,且呈量效关系 ,为临床上
用于治疗乙型肝炎提供了理论基础 ,但关于 TLYQ
抗病毒的作用机制尚有待进一步研究 。
[ 　参　考　文　献　]
[ 1] 　周艳萌 .抗乙型肝炎病毒的中药研究进展 [ J] .时珍国医国
药 , 2005, 16(10):1043-1045.
[ 2] 　张士军 ,林军 , 蒋伟哲 , 等 .复方六月雪对鸭乙型肝炎病毒
DNA的抑制作用 [ J].中药材 , 2007, 30(2):191-193.
[ 3] 　杨霞芳 ,张士军 ,黄春喜 ,等.复方六月雪体外抗 HBV的实验
研究 [ J].内科 , 2007, 2(3):317-319.
[ 4] 　苏洁寒 ,荣延平 ,蒋伟哲 , 等.复方六月雪对急性化学性肝损
伤的保护作用 [ J] .广西医科大学学报 , 2003, 20(4):497-
499.
[ 5] 　DUFLOTA, MEHROTRAR, YUSZ, etal.Spectrumofliverdis-
easeandduckhepatitisBvirusinfectioninalargeseriesofChi-
neseduckswithhepatocelularcarcinoma[ J].Hepatology, 1995,
21(6):1483-1491.
[ 6] 　林兴 ,黄权芳 ,张士军 ,等 .六月青总皂苷对四氯化碳诱导小
鼠脂质过氧化反应的影响 [ J] .中成药 , 2009, 31(12):133-
135.
[ 7] 　张士军 , 林军 , 蒋伟哲 , 等 .复方六月雪对鸭乙型肝炎病毒
DNA的抑制作用 [ J].中药材 , 2007, 30(2):191-193.
编辑:罗娟 /接受日期:2010-01-25