全 文 ：酶 解 核桃 仁 制 备 低 分 子 肽
胡 鑫 , 刘成柏 , 林相友 , 刘力东 , 丁天兵
(吉林大学生命科学学院 , 长春 130023)
提要: 以核桃仁为原料 , 采用酶解技术 ,经蛋白质提取、 酶解、分离等工序制备高质量低分子
肽制品 . 蛋白酶水解核桃仁的最佳条件为: 温度 40℃、 pH 9、 底物浓度 40 mg /mL、 酶量
150 U /g , 反应时间 2 h , 在此条件下核桃蛋白质的水解度约为 20% .
关键词: 核桃仁 ; 低分子肽 ; 酶解
中图分类号: Q95. 483 文献标识码: A 文章编号: 1671-5489( 2003) 04-0526-05
收稿日期: 2003-03-24.
作者简介: 胡 鑫 ( 1982～ ) , 女 , 本科生 , 从事生物化学与分子生物学研究 , E-m ail: xindongdream@ eyou. com. 联系人: 丁天兵
( 1973～ ) ,男 , 博士 ,讲师 , 从事生物化学与分子生物学研究 , E-mai l: tianbingding@ yeah. n et.
核桃仁富含 40%～ 65%油脂、 14% ～ 17%蛋白质及 5. 8%维生素等营养成分 [1 ] , 并具有健胃、 补
血、润肺、 益肾和补脑等多种功效 . 目前我国核桃栽培面积居世界首位 , 年产核桃 10万吨以上 , 但其
深加工产品较少 . 低分子肽的组成氨基酸并不一定是必需氨基酸 , 这为人类更为充分利用蛋白资源 [2 ]
提供了新的机遇 . 作为人体功能食品原料 , 低分子肽制品越来越受到专家及企业界的关注 [3 ] . 目前 ,
以大豆、乳制品为原料制备低分子肽的研究很多 , 而以核桃仁为原料制备低分子肽制品尚未见报道 .
本文以核桃仁为原料 , 采用酶解技术 , 经蛋白质提取、 酶解、 分离等工序制备高质量低分子肽制
品 , 为以核桃仁制备低分子肽的进一步研究和利用提供了依据 .
1 材料与方法
1. 1 主要材料与仪器
长白山山核桃仁 , 木瓜蛋白酶 ( 0. 6 U /mg ) , Sephadex G-25, 其它试剂均为国产分析纯 .
恒温磁力搅拌器 ( 85-2型 ) , 高速离心机 ( LG-2. 4 A型 ) , p H S-3C数字型 pH计 , 单光束紫外 /可
见分光光度仪 (W FZ 800-D3 B型 ) , 旋转蒸发仪 ( RE-52CS型 ) , 部分收集器 ( BSZ160型 ) .
1. 2 实验方法
1. 2. 1 核桃蛋白质含量的测定 经凯氏定氮法 ( GB /T14489. 2-1993)测得核桃粗蛋白含量为
24. 58% .
1. 2. 2 蛋白质的提取 实验工序为: 核桃仁精选 → 浸泡 → 均浆 → 调 pH 8～ 8. 5→ 室温搅拌
1 h→ 以 3 000 r /min离心 30 min→ 去油层和下层沉淀 → 调 pH 4. 5→搅拌 30 min→ 以 3 000 r /min
离心 30 min→ 取沉淀层→ 水洗 → 调 pH 7. 0→ 冷藏 .
1. 2. 3 酶解 配制核桃蛋白溶液 , 调整其 pH值 , 按比例加入蛋白酶 . 在反应过程中不断加入
0. 05 mol /L的 NaOH溶液 , 以维持溶液的 pH值不变 . 核桃蛋白的水解度 ( DH)根据消耗的 NaOH的
量表示 . 水解度的计算采用 pH-Stat方法 [4 ] , 按下式计算:
DH(% ) = V ( NaOH)× 1a × c( NaO H)MP × 1h tot× 100,
式中 , V ( NaO H)表示水解过程中消耗的 NaOH量 , 单位为 mL; M P为蛋白质总量 ; a为T氨基酸的解
离度 ; h tot为每克蛋白质中肽键物质的量 (取 2. 18) .
T氨基的解离度按下式计算:
Vol. 41 吉 林 大 学 学 报 (理 学 版 ) No. 4
2 0 0 3年 10月 JOU RNAL O F JILIN UNIV ERSITY ( SCIENCE EDITION) 526～ 530
¥
DOI : 10. 13413 /j . cnki . jdxbl xb. 2003. 04. 024
a=
10
pH- pK
1+ 10pH- pK
,
式中 pK为 T氨基的解离常数 , 一般以 7. 0为平均值进行计算 .
1. 2. 4 层析分离 参照文献 [5]方法 , 采用 Sephdex G-25, 0. 1 mol /L HAc为洗脱液 , 洗脱速度
为 0. 44 mL /min, 收集各管洗脱液 , 在 280 nm下检测各管吸光度 , 做洗脱曲线 .
2 结果与讨论
2. 1 蛋白质含量的差异
文献报道核桃仁的蛋白质量为 14%～ 17% , 我们测得的粗蛋白为 24. 58% , 差异较大 , 其原因可
能是核桃品种不同 , 由于地区差异而导致蛋白质含量不同 , 或是采用的核桃仁在出售前储存期较长 ,
水分损失较大 , 因此干物质含量相对较高 .
2. 2 pH值及温度对核桃蛋白酶解反应的影响
2. 2. 1 pH值对核桃蛋白酶解反应的影响 在底物浓度为 10 mg /mL, 酶量为 30 U /g, 温度为
40℃时 , 选择不同的 pH值反应 30 min, 得到不同的核桃蛋白水解度 (水解度以消耗的碱量表示 ) . 在
蛋白质酶解过程中 , p H值对反应速度有如下影响: ( 1)对底物中结合部位解离状态的影响 ; ( 2)对酶
活力的影响 ; ( 3)对酶稳定性的影响 . 后两者本质上是对酶活性中心的催化部位与结合部位侧链基团
解离形式的改变 , 具有特殊催化功能的离子基团在总酶量中所占比例发生变化 , 表现为催化能力的差
异 . 又由于蛋白质酶解过程具有由碱性至酸性的特点 , 所以保持 pH值恒定 , 对于酶解反应的控制与
优化至关重要 .
反应体系中作为底物的核桃蛋白随着 pH值的变化 , 表现出不同的解离状态 . 在 pH 7～ 9之间水
解度增长较快 , 当 pH升高到 9时 , 水解程度达到最大 , 当 pH继续增高时 , 水解度又开始下降 (见图
1) . 本实验条件下木瓜蛋白酶催化核桃蛋白水解的最适 pH为 9左右 .
2. 2. 2 温度对核桃蛋白酶解反应的影响 在 pH值为 9. 0、 底物浓度为 10 mg /mL、 酶量为
30 U /g时 , 选择不同的温度反应 1 h, 测定核桃蛋白的水解度 . 在核桃蛋白酶解过程中 , 温度是一个相
当复杂而重要的操作参数 , 其对反应速度的影响如下: ( 1)在低温段酶活力较小 , 酶解速度较低 ; ( 2)
在较高温度下 , 核桃蛋白适度变性 , 有利于折叠结构的舒展 (解聚 ) , 肽键更易与酶结合 , 酶解速度加
快 ; ( 3) 随着温度继续升高 , 酶蛋白变性 , 失活加快 , 酶解速度降低 . 温度对酶解反应的影响如图 2所
示 , 在 30～ 35℃ , 水解度较小 ; 35～ 40℃ , 随着温度的升高 , 核桃蛋白酶解速度加快 , 在 40～ 50℃趋
于平衡 ; 45℃水解度最高 , 50℃以后开始下降 ,而在 40～ 50℃水解度相差较小 . 因此 ,本实验条件下
木瓜蛋白酶催化核桃蛋白反应的最适温度为 40～ 50℃ , 反应域值较宽 , 有利于工业化生产 .
Fig. 1 Ef fect of pH on degree of hydrolysis Fig. 2 Ef fect of t ime on degree of hydrolysis
2. 3 核桃蛋白浓度及酶浓度对酶解反应的影响
2. 3. 1 核桃蛋白浓度对酶解反应的影响 在 pH值 9. 0, 温度 40℃ , 酶浓度 0. 3 U /mL条件下 ,
反应 30 min, 测定不同底物浓度下的核桃蛋白的水解度 . 在底物浓度较低时 , 水解度随底物浓度的增
加而增加 , 处于一级反应状态 ; 当底物浓度为 20 mg /mL时 , 水解度不再随底物浓度的增加明显增加 ,
开始向零级反应状态过渡 .
527 No. 4 胡 鑫等: 酶解核桃仁制备低分子肽
底物浓度对酶解反应的影响如图 3所示 , 当底物浓度在 10～ 20 mg /mL时 , 水解度增长较快 , 水
解度与底物浓度呈线性关系 ; 在 20～ 40 mg /mL, 水解度不再随底物浓度的增加按比例升高 ; 当底物
浓度大于 40 mg /mL时 , 水解度变化趋于平缓 ; 最适底物浓度为 20～ 40 mg /mL.
2. 3. 2 酶浓度对核桃蛋白酶解反应的影响 在底物浓度为 30 mg /mL, pH值 9. 0, 温度为 40℃
条件下反应 30 min,测定不同酶浓度作用下核桃蛋白的水解度 ,结果如图 4所示 . 当酶浓度 < 150 U /g
时 , 随着酶浓度的增大 , 水解度增高 ; 当酶浓度> 150 U /g时 , 水解度不再随酶量的增大而增大 . 这是
因为当酶浓度较低时 , 底物过量 , 酶与底物完全结合 ,水解程度增大 ; 当酶浓度较高时 ,蛋白质相对浓
度小 , 酶分子过饱和 , 有一部分分子没有机会与蛋白质结合 , 所以水解程度变化不大 , 最适酶浓度为
150 U /g (图 4) .
Fig. 3 Effect of substrate concentration on
degree of hydrolysis
Fig. 4 Ef fect of enzyme dose on degree of
hydrolysis
2. 4 反应时间对核桃蛋白酶解反应的影响
在 pH值为 9. 0、温度为 40℃、 底物浓度为 30 mg /mL和酶浓度为 150 U /g条件下 , 测定在不同
Fig. 5 Ef fect of hydrolysis time on degree of
hydrolysis
时间酶解反应核桃蛋白的水解度 . 底物的水解度随
酶解时间的延长而增加 ,并逐渐趋于平缓 (见图 5) ,
究其原因 , 随着酶解反应的进行: ( 1)底物浓度减
小 , 反应位点逐渐被酶分子饱和 , 可能被酶作用的
肽键数量减少 ; ( 2)产物浓度增加 , 其竞争性抑制
变强 ; ( 3) 酶活性随反应进行而降低 ; ( 4)中间复
合物 [ES ]经历了初始阶段后趋于恒定 . 上述因素综
合作用的结果使得酶解速度及平均肽链长度 ( PCL
≈ 100 /DH% )均随时间延长而逐渐减小 .
当反应时间未到 30 min时 , 水解度增长较快 ,
水解度与时间呈线性关系 ; 反应时间在 30～
100 min之间 , 水解度增长缓慢 , 水解度与时间呈非线性关系 ; 反应时间在 100～ 150 min之间 , 水解度
变化不大 , 150 min后趋于平缓 ; 最适反应时间为 100～ 150 min.
2. 5 最佳酶解工艺条件的确定
影响酶解反应的几个主要因素为 pH值、温度、 底物浓度、酶量和反应时间 . 根据以上单因素实验
分析 , 并考虑到节约能源 , 采用温度为 40℃ , 反应时间为 2 h , 做 pH值、底物浓度、 酶量三因素的正
交实验 , 正交实验的因素水平选取见表 1. 影响因素的主次关系见图 6, 极差分析见表 2.
Table 1 Factors and level of orthogonal test L9 ( 34 )
Facto r
A
( pH)
B
[c( substra te) /( mg· mL- 1 ) ]
C
[w ( enzyme) /( U· g- 1 ) ]
1 8. 5 25 100
2 9 30 120
3 9. 5 40 150
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Table 2 Results of orthogonal test
No. A B C
D
( Contro l)
V ( NaO H) /m L
RepeatⅠ RepeatⅡ Ti
1 1 1 1 1 6. 55 6. 45 13
2 1 2 2 2 9. 6 8. 42 18. 02
3 1 3 3 3 9. 95 10. 7 20. 65
4 2 1 2 3 6. 95 6. 3 13. 25
5 2 2 3 1 10. 35 11. 3 21. 65
6 2 3 1 2 9. 45 9. 95 19. 4
7 3 1 3 2 6. 3 6. 55 12. 85
8 3 2 1 3 8. 55 7. 2 15. 75
9 3 3 2 1 8. 4 8. 25 16. 65
T1 51. 67 39. 1 48. 15 51. 3 76. 1 75. 12 151. 22
T2 54. 3 55. 42 47. 92 50. 27
T3 45. 25 56. 7 55. 15 49. 65
X1 8. 61 6. 52 8. 025 8. 55
X2 9. 05 9. 24 7. 99 8. 38
X3 7. 54 9. 45 9. 19 8. 275
Rj 1. 51 2. 93 1. 2
上述结果表明 , p H值、 底物浓度和酶浓度对酶促反应影响极其显著 , 极差分析表明因素的主次关
系为: B> A> C, 3种因素的最佳反应条件分别为 A2, B3, C3, 即木瓜蛋白酶水解核桃蛋白质的最适
反应条件是: 温度 40℃ , p H 9, 底物浓度为 40 mg /mL、 酶浓度为 150 U /g , 反应时间为 2 h , 在此条
件下核桃蛋白质的水解度约为 20% .
在食品工业上 , 木瓜蛋白酶常常用于啤酒生产 ; 它能使肉质嫩化 , 也可以用于蛋白质水解产物的
生产 . 该酶的最佳 pH因底物而异 , 最佳温度的范围也很宽 , 一般为 25～ 40℃ . 木瓜蛋白酶的作用范
围较宽 , 但对以核桃蛋白为底物的酶促反应水解程度不高 , 说明单一酶种对特定蛋白质的水解作用的
局限性 .
2. 6 层析分离
采用 SephdexG-25, 0. 1 mol /L HAc为洗脱液 , 洗脱速度为 0. 44 mL /min, 收集各管洗脱液 , 在
280 nm下检测各管吸光度 , 做洗脱曲线 , 见图 7.
由于 SephdexG-25能分离的分子量范围为 100～ 5 000, 外水体积 V0为 26 mL, 则可断定峰Ⅰ 为
分子量大于 5 000的多肽 ; 铬酸钾分子量为 194. 19, 测得的内水体积 V1为 61 mL, 氨基酸的平均分子
量为 110, 则可断定峰Ⅱ为游离氨基酸的混合物 ; 中间各峰为分子量小于 5 000的低分子量肽混合物 .
Fig. 6 Trend analysis of factors Fig. 7 Elut ion curve
由平均肽链长度 PCL≈ 100 /DH%可知 , 水解产物经 Sephdex G-25分离纯化 , 得到分子量低于
5 000的小肽混合物 , 平均肽键长度约为 5, 分离效果较好 , 而且速度快 , 操作简单 , 成本也较低 , 适于
工业化生产 .
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参 考 文 献
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Preparation of Peptide with Low-molecular Weight from
Walnut by Enzymatic Hydrolysis
HU Xin, LIU Cheng-bai , LIN Xiang-you, LIU Li-dong , DIN G Tian-bing
(College of L ife Science , J ilin University , Changchun 130023, China )
Abstract: In this paper is studied the main technique of the enzymatic hydrolysis o f w alnut to prepare
the peptide wi th low-molecular w eights. A new technique of hydro lyzing w alnut pro tein wi th an en-
zyme has been w o rked out. This paper deals wi th the ef fects o f hydroly sis tempera ture, optimum pH,
subst ra te concentration, enzyme amount and hydroly sis dura tion carried out wi th the enzyme on the
hydroly sis proportion of the walnut protein. The resul ts show that increasing the enzyme concentra-
tion and hydroly sis duration, the hydrolysis propor tion raises signi ficant ly. The suitable hydroly sis
conditions o f this enzyme are hydrolysis temperature of 40℃ , optimum pH 9, subst rate concentration
o f 40 mg /mL, enzyme amount o f 150 U /g , hydroly sis dura tion of 2 h. Under such condi tions, the de-
g ree o f the hydroly sis o f the hydroly zed wa lnut pro tein is about 20% . It is a good w ay for the hydroly-
sis o f wa lnut.
Keywords: w alnut; low molecular w eigh t peptides; enzymatic hydro lysis
(责任编辑: 李桂英 )
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