全 文 ：2011年 1月 Vol.29 No.1January2011 ChineseJournalofChromatography 83 ～ 86
技术与应用 DOI:10.3724/SP.J.1123.2011.00083
＊通讯联系人:池玉梅 ,教授 ,主要研究方向为色谱及相关技术的应用 、中药质量控制标准.E-mail:ymchi@njutcm.edu.cn.
基金项目:国家 “十一五 ”支撑计划项目(2006BAI09806-10)和国家自然科学基金项目(30973939).
收稿日期:2010-09-08
高效液相色谱法同时测定中药材虎掌南星的核苷类成分
陆　丹 , 　罗　芬 , 　池玉梅＊ , 　吴　皓
(南京中医药大学 , 江苏 南京 210046)
摘要:建立了高效液相色谱同时测定中药材虎掌南星中核苷类活性成分(腺嘌呤 、次黄嘌呤 、黄嘌呤 、尿苷 、胸腺嘧
啶 、腺苷 、鸟苷)含量的方法。以 LichrospherC18色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)分离 , 以乙腈-水(含 0.1%甲
酸)为流动相 ,梯度洗脱 , 在 254 nm下检测 ,腺嘌呤 、次黄嘌呤 、黄嘌呤 、尿苷及鸟苷分别在 1.6 ～ 50mg/L范围内 、
胸腺嘧啶和腺苷分别在 1.2 ～ 40 mg/L范围内的线性关系良好 , 相关系数均大于 0.999 5, 加标回收率为 98.9%～
101.2%,相对标准偏差均小于 3%。方法学考察结果显示符合含量测定要求 , 并应用于不同产地虎掌南星的测定。
该方法操作简便 、快速 ,结果可靠 ,重现性好 , 可作为虎掌南星质量评价的参考依据。
关键词:高效液相色谱法;核苷;虎掌南星;中药材
中图分类号:O658　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-8713(2011)01-0083-04
DeterminationofnucleosidesinRhizomaPinelliaeby
highperformanceliquidchromatography
LUDan, LUOFen, CHIYumei＊ , WUHao
(NanjingUniversityofChineseMedicine, Nanjing210046 , China)
Abstract:Ahighperformanceliquidchromatographic(HPLC)methodwasestablishedto
determinenucleosidesinRhizomaPineliae, whichisadriedstemtuberofPineliapedatisecta
SchottinPineliaplantbelongingtoAraceaefamilyandhasmultipleefficienciesaboutdown-
bearcounterflowandcheckvomiting, eliminatingdampnessandphlegm, etc.Theseparation
ofadenine, hypoxanthine, xanthine, uridine, thymine, adenosineandguanosinewasachieved
onaLichrospherC18 column(150mm×4.6mm, 5 μm)withthedetectionat254 nmandgra-
dientelutionbyacetonitrile-watercontaining0.1%formicacidasthemobilephase.Thelinear
rangeswerefrom 1.6 mg/Lto50 mg/Lforadenine, hypoxanthine, xanthine, uridineand
guanosine, whilefrom1.2 mg/Lto40mg/Lforthymineandadenosinewithcorrelationcoefi-
cientsabove0.999 5.Theaveragerecoverieswerebetween98.9% and101.2% withtherela-
tivestandarddeviationsbelow 3%.Theresultsofmethodologicalstudydemonstratedthatthe
methodmettherequirementsofthedetermination.ThenucleosidesinRhizomaPineliaefrom
diferentdistrictsweredetermined.Themethodisconvenientandaccuratewithgoodrepro-
ducibilityandcanbeusedtoevaluatethequalityofRhizomaPineliae.
Keywords:highperformanceliquidchromatography(HPLC);nucleosides;RhizomaPineli-
ae;traditionalChinesemedicinalmaterials
　　虎掌南星又名掌叶半夏 ,为天南星科半夏属植
物掌叶半夏(PineliapedatisectaSchot)的干燥块
茎 ,味苦 、辛 ,性温 ,有毒 ,归肺 、肝 、脾经 [ 1] ,具有降
逆止呕 、燥湿化痰 、祛风定惊 、消痞散结的功效 [ 2] ,
含有生物碱类 、苷类 、二肽类 、氨基酸 、凝集素 、甾醇
类 、脂肪酸 、糖 、微量元素 、核苷等成分 [ 3] ,始载于
《神农本草经》 ,尚未收载于《中国药典 》,但在安徽 、
河北 、四川等地有大面积的种植 ,个小者常被当作天
南星 科 半 夏 属 植 物 半 夏 (Pinelia ternate
(Thunb.)Breit.),而大多被作为天南星科天南星
属植物天南星(RhizomaArisaematis)的主流商品
使用 ,自古使用多混乱。核苷类成分大多具有抗菌 、
色 谱 第 29卷
抗病毒 、抗肿瘤活性 [ 4] ,迄今 ,就虎掌南星质量的研
究报道尚少 ,尚未见有测定有关核苷类活性成分含
量的报道。目前 ,核苷类成分含量的测定方法有高
效液相色谱法 (HPLC)[ 5-11] 和毛细管电泳法
(CE)[ 12 -14] 。本课题组研究前期以超高效液相色
谱 -电喷雾四极杆 -飞行时间串联质谱 (UPLC-ESI-
Q/TOFMS)对虎掌南星进行定性分析 ,结果显示其
含有嘌呤 、嘧啶碱基与腺苷 、鸟苷等多个核苷成分 。
本文以 HPLC建立同时测定 7个嘌呤 、嘧啶 、核苷成
分的方法 ,测定虎掌南星的核苷类成分含量 ,以期为
药材水溶性成分的进一步研究奠定基础 ,同时为其
质量评价提供参考依据。
1　实验部分
1.1　仪器 、试剂与材料
　　WatersAliance2695 HPLC仪 (美国 Waters
公司 ), 配 Waters2996光电二极管阵列检测器
(PDA)和 WatersEmpower色谱工作站。
　　乙腈 、甲酸为色谱纯(MERCK公司),水为超纯
水(由 Milipore纯水器制备)。对照品:腺嘌呤 、次
黄嘌呤 、黄嘌呤 、尿苷 、胸腺嘧啶 、腺苷 、鸟苷为分析
纯(含量均大于 99.5%,美国 Sigma公司)。
　　虎掌南星(10批次 ,产地为河北 、河南 、安徽 、四
川 、山东 、陕西 、吉林 ,经南京中医药大学药植专家谈
献和教授鉴定为天南星科半夏属植物掌叶半夏的块
茎)。
1.2　实验方法
1.2.1　对照品储备液的配制
　　取置干燥器中 48 h以上的各对照品 10 mg,精
密称定 ,分别置于 10 mL容量瓶中 ,加水溶解并定
容 ,摇匀 ,得各对照品储备液。
1.2.2　供试品溶液的制备
　　取虎掌南星药材粉末(过 60目筛)约 0.6g,精
密称定 ,置于 50 mL具塞锥形瓶中 ,精密加入 10mL
水 ,称定质量 ,超声处理(频率 40 kHz,功率 250 W)
45 min,放冷 ,再称定质量 ,用水补足减失的质量 ,摇
匀 。取适量溶液离心 5 min(15 000 r/min),取上清
液 ,供 HPLC测定。
1.2.3　色谱条件
　　色谱柱:LichrospherC18柱 (150 mm×4.6
mm, 5 μm);流动相:乙腈(含 0.1%甲酸)(A)和
水(含 0.1%甲酸)(B)体系。梯度洗脱:0 ～ 6 min,
100%B;6 ～ 25 min, 100%B～ 90%B;25 ～ 29
min, 90%B～ 75%B;流速:1.0 mL/min;检测波
长:254 nm;柱温:30 ℃;进样量:20 μL。
2　结果与讨论
2.1　方法的建立
2.1.1　色谱条件的选择
　　分析 7个成分的紫外光谱(图 1),综合考虑检
测时各色谱峰的响应和干扰因素 ,选择 254 nm为
检测波长 。
图 1　(a)对照品和(b)样品的高效液相色谱图与紫外光谱图
Fig.1　HPLCchromatogramsandUVspectraof(a)
referencesubstancesand(b)asample
　Peaks: 1.adenine;2.hypoxanthine;3.xanthine;4.uri-
dine;5.thymine;6.adenosine;7.guanosine.
　　分别试验以甲醇和水 、乙腈和水体系为流动相 ,
结果显示 ,乙腈和水体系较佳。试验显示在体系中
加酸可改善峰形 , 通过条件优化 , 以甲酸加入量
0.1%时为宜。优化梯度程序 ,显示在 6min内维持
100%的水相 ,可使腺嘌呤 、次黄嘌呤 、黄嘌呤 、尿苷
达到基线分离;在 19 min内水相比例匀速降至
90%,可使腺苷 、鸟苷在 15 min内出峰并基线分离;
随后在 4 min内将乙腈比例升至 25%,以使溶液中
极性稍小的组分尽快流出。分别试验流速大小和柱
温高低对峰形和分离度的影响 ,结果显示以流速为
1mL/min、柱温为 30 ℃的条件为宜。对照品与样
品色谱图见图 1,理论塔板数均大于 3 000,与相邻
·84·
　第 1期 陆　丹 ,等:高效液相色谱法同时测定中药材虎掌南星的核苷类成分
色谱峰的分离度均大于 1.5。样品的色谱图显示腺
苷峰较小 ,胸腺嘧啶低于检出限 。
2.1.2　供试品前处理方法的优化
　　试验用水 、30%乙醇 、50%乙醇 、70%乙醇提取 ,
结果显示水的提取效率最高 ,因此选择水作为提取
溶剂。试验比较了超声提取法与回流提取法 ,结果
显示前者更为适宜。分别分析药材与水的质量比为
1∶50、1∶25、1∶10时的提取液 ,结果显示 3种料液比
的提取液中各成分提取率的相对标准偏差 (RSD)
均在 3%以内 ,考虑各色谱峰面积大小的适宜性及
操作的方便性 ,本法采用在 0.6 g药材中精密加入
10 mL水的方法。通过对超声时间的考察 ,确定超
声提取时间为 45 min。
2.2　方法学考察
2.2.1　线性范围和检出限
　　分别精密量取各对照品储备液适量 ,置于 10
mL容量瓶中 ,加水定容 ,摇匀 ,得对照品混合溶液 ,
腺嘌呤 、次黄嘌呤 、黄嘌呤 、尿苷 、胸腺嘧啶 、腺苷 、鸟
苷的质量浓度依次为 50.23、50.75、50.30、51.50、
36.69、39.84、50.70 mg/L;采用二倍稀释法连续稀
释 5次 ,分别得 B1、B2、B3、B4、B5、B6系列对照品
溶液 。以 1.2.3节条件对其进行分析 , 以峰面积
(y)对对照品质量浓度(x, mg/L)用最小二乘法进
行线性回归。对质量浓度最低的溶液(B1)逐步稀
释 ,以信噪比(S/N)约为 10计定量限(LOQ),以 S/
N约为 3计检出限(LOD),结果见表 1。
表 1　 7种核苷类成分的回归方程 、相关系数 、线性范围 、定量限和检出限
Table1　Regressionequations, correlationcoefficients(r2), linearranges, limitsofquantification(LOQ)
andlimitsofdetection(LOD)ofsevennucleosides
Compound Regressionequation r2 Linearrange/(mg/L) LOQ/(mg/L) LOD/(mg/L)
Adenine y=96660x-2121.6 0.9999 1.6-50.2 0.15 0.05
Hypoxanthine y=55764x-1396.6 0.9999 1.6-50.8 0.3 0.1
Xanthine y=37356x-1685.6 0.9999 1.6-50.3 0.3 0.1
Uridine y=42017x-1639.8 0.9999 1.6-51.5 0.3 0.1
Thymine y=56539x-2001.8 0.9998 1.2-39.7 0.3 0.1
Adenosine y=57832x-1550.4 0.9999 1.2-39.8 0.3 0.1
Guanosine y=49924x-1979.6 0.9999 1.6-50.7 0.3 0.1
y:peakarea;x:massconcentration, mg/L.
2.2.2　重复性
　　取 2.2.1节配制的 B4溶液 ,连续进样 6次分
析 ,计算各成分对应的色谱峰面积的 RSD,结果显
示 RSD均小于 1.0%(见表 2),说明色谱系统重复
性良好 。
表 2　方法的重复性和稳定性
Table2　Repeatabilityandstabilityofthemethod %
Compound Repeatability(n=6)System Method
Stability
(n=7)
Adenine 1.0 2.2 0.8
Hypoxanthine 0.7 2.9 2.5
Xanthine 0.6 1.1 2.3
Uridine 0.9 1.6 1.2
Thymine 0.7 ＊ ＊
Adenosine 0.7 ＊ ＊
Guanosine 0.5 1.0 1.0
＊ belowthelimitofquantification.
　　将同一份药材以 1.2.2节的方法平行处理 6
份 ,以 1.2.3节条件进行分析 , 计算各组分含量的
RSD,考察方法的重复性 ,结果见表 2,可见 RSD均
小于 3.0%,符合测定要求。
2.2.3　稳定性
　　取重复性试验的同一份供试品溶液 ,常温下放
置 ,在 24 h内每隔 4 h进样分析 ,计算各组分含量
的 RSD,结果显示 RSD均小于 3.0%(见表 2),表
明供试品溶液稳定性良好。
2.2.4　准确性
　　以加标回收率试验考察方法的准确性。分别精
密吸取 1.2.1节的腺嘌呤 、次黄嘌呤 、黄嘌呤 、尿苷 、
胸腺嘧啶 、腺苷 、鸟苷的对照品储备液适量 , 置于
100 mL容量瓶中 ,用水定容至刻度 ,摇匀 ,得对照品
混合溶液 。取已知含量的药材(过 60目筛)0.3 g,
精密称定 ,置于 50 mL具塞锥形瓶中 ,精密加入 10
mL上述对照品混合溶液 ,余下操作同供试品溶液
制备相应步骤 ,平行制作样品 6份 ,以 1.2.3节的方
法进行分析 ,用外标法以表 1的回归方程计算各相
应成分的含量 ,并计算回收率和 RSD,结果显示回
收率为 98.9%～ 101.2%, RSD均小于 3.0%(见表
3),符合含量测定的准确性要求。
2.3　样品测定
　　以建立的方法测定 10批次虎掌南星药材的核
苷类成分含量 ,结果见表 4。统计 10批次药材中各
核苷含量的 RSD为 31.8%～ 53.1%,显示各产地虎
掌南星的核苷类成分差异较大。分析结果同时显示
实验用批次的虎掌南星中胸腺嘧啶含量和腺苷含量
低于定量限 , 由于前期在使用 UPLC-ESI-Q/TOF
MS对虎掌南星的化学成分进行定性分析时检测到
有胸腺嘧啶和腺苷 ,因此在建立方法时也对这两个
·85·
色 谱 第 29卷
表 3　7种核苷类成分的加标回收率(n=6)
Table3　Recoveriesofsevennucleosides(n=6)
Compound Found/(mg/L) Background/(mg/L) Added/(mg/L) Recovery/% RSD/%
Adenine 13.95 7.010 6.955 99.8 2.4
Hypoxanthine 4.057 2.050 2.030 98.9 2.5
Xanthine 5.033 2.506 2.515 100.5 2.9
Uridine 16.29 8.296 7.931 100.9 2.4
Thymine 7.055 ＊ 7.031 100.3 0.9
Adenosine 6.936 ＊ 6.972 99.5 1.5
Guanosine 14.82 7.431 7.301 101.2 2.7
＊ belowthelimitofquantification.
表 4　不同产地虎掌南星药材中核苷类成分的含量(n=3)
Table4　NucleosidecontentsofRhizomaPineliaefromdifferentdistricts(n=3) mg/g
No. District Adenine Hypoxanthine Xanthine Uridine Guanosine Total
1 　Henan 0.27 0.044 0.041 0.28 0.16 0.80
2 　Sichuan 0.19 0.059 0.075 0.23 0.19 0.74
3 　Shandong 0.23 0.058 0.052 0.37 0.23 0.94
4 　Hebei 0.23 0.067 0.056 0.28 0.24 0.87
5 　Shaanxi 0.20 0.079 0.070 0.32 0.20 0.87
6 　Hebei 0.35 0.11 0.11 0.55 0.40 1.52
7 　Hebei 0.11 0.061 0.013 0.34 0.50 1.02
8 　Jilin 0.12 0.080 0.014 0.54 0.23 0.98
9 　Sichuan 0.25 0.070 0.068 0.26 0.18 0.83
10 　Anhui 0.20 0.033 0.042 0.45 0.40 1.12
Mean 0.21 0.066 0.054 0.36 0.27 0.96
RSD/% 30.9 30.4 51.1 30.1 40.5 21.9
成分进行了分析 ,是否虎掌南星药材中这两个成分
含量确实低于定量限 ,尚有待测试更多批次不同产
地的样本。
3　结论
　　建立了高效液相色谱同时测定中药材虎掌南星
中的 7个核苷类成分 。方法简便 、快速 ,结果可靠 ,
重现性好 ,可应用于测定中药材虎掌南星的多种核
苷类成分。样品测定结果显示 ,药材中核苷类成分
含量差异较大 ,提示药材质量有待规范。
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