全 文 ： 2009, Vol. 30, No. 08 食品科学 ※分析检测218
蒽酮-硫酸法测定泰山灰树花中
海藻糖含量的研究
李艳玲，史仁玖，张显忠，苗 苗
(泰山医学院生物科学系，山东 泰安 271016)
　　　　　　　　
摘 要：对蒽酮 -硫酸法测定灰树花菌体海藻糖含量的条件进行了研究。结果表明，样液与蒽酮 -硫酸试剂加入量
的体积比为 1:2，加热显色 5min，625nm比色，测定灰树花菌体中海藻糖含量为 3.88mg/ml，平均回收率为 106.5%，
稳定性和重复性较好。该方法简便、快速、准确，适用于菌体海藻糖含量的测定。
关键词：灰树花；海藻糖；蒽酮 - 硫酸法
Determination of Trehalose Content of Grifola frondosa Mycelia by Anthrone-Sulfuric Acid Method
LI Yan-ling，SHI Ren-jiu，ZHANG Xian-zhong，MIAO Miao
(Department of Biological Sciences, Taishan Medical College, Taian 271016, China)
Abstract ：Abstract: The procedure of colorimetric analysis of mycelium trehalose of Grifola frondosa was investigated in the
present study. The results showed that when Grifola frondosa mycelium sample solution is added with anthrone-sulfuric acid
reagent at half of its volume, heated at 100 ℃ for 5 min and then analyzed at 625 nm, the trehalose content in Grifola frondosa
mycelium is determined as 3.88 mg/ml, and the average recovery is 106.5%. Also, the stability and repeatability of this method
are good. In conclusion, this method is convenient, rapid, accurate and suitable for the determination of rehalose content in
Grifola frondosa mycelium.
Key words：Grifola frondosa；trehalose；anthrone-sulfuric acid method
中图分类号：TS207.3 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)08-0218-03
收稿日期：2008-06-07
基金项目：泰山医学院青年科学基金项目(2007-2008)
作者简介：李艳玲(1977-)，女，讲师，硕士，研究方向为药用真菌生物技术。E-mail：ling l816@163 .com
海藻糖(t rehalose)是一种非还原性双糖，在蕈菌、
酵母、细菌以及动植物中广泛存在，近年来因它具有
在干燥、干旱、冷冻、高渗透压等恶劣环境下保护核
酸和蛋白质等生物大分子的特殊功效[1]，而被广泛用于
医药、保健品、酶、食品等制品的保存 [ 2 - 3 ]，已成为
国内外研究开发的热点之一。目前获取海藻糖的途径主
要从酵母和细菌中提取，对大型真菌研究甚少。据报
道某些食药用真菌，如灰树花(Grifola frondosa)是开发
海藻糖的重要菌物种子源，所含海藻糖比其他食用菌都
要高[4]。因此，从大型真菌中开发海藻糖等双糖是医药
界的一个重要课题。
由于液体深层发酵技术具有发酵周期短、工艺简
单、原料来源广泛、适于工业化大生产等优点，已成
为替代天然和人工栽培子实体生产灰树花菌丝体和生理
活性成分的重要途径。目前，灰树花液体深层发酵工
艺己经成熟[5-7]。本研究采用改良蒽酮 -硫酸法首次对泰
山灰树花液体深层发酵收获的菌丝体进行海藻糖含量测
定，希望能为多途径开发灰树花资源以及海藻糖的生产
提供一种新途径。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
灰树花 泰安农科院食用菌研究所。
海藻糖标准品 广西南宁杰沃利生物制品有限公司；
三氯乙酸 天津市凯通化学试剂有限公司；蒽酮 上海
化学试剂采购供应五联化工厂；浓硫酸 淄博化学试剂
厂有限公司。以上试剂均为分析纯。
FA1004N电子天平、UV-757紫外可见光分光光度计
上海精密科学仪器有限公司；752可见光分光光度计 上
海光谱仪器有限公司。
219※分析检测 食品科学 2009, Vol. 30, No. 08
1.2 方法
1.2.1 标准曲线的绘制
1.2.1.1 标准溶液制备
精确称取干燥至恒重的海藻糖 0.1g，于 100ml容量
瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，得到 1.0mg/ml的
海藻糖母液，再移取其中 10ml到 100ml容量瓶中，以
蒸馏水稀释到刻度线，摇匀配成标准海藻糖溶液，浓
度为 0.1mg/ml。
1.2.1.2 0.2%蒽酮 -硫酸试剂配制
称取 0.2g蒽酮，加入 100ml浓硫酸，摇匀，置于
棕色瓶(现配现用)。
1.2.1.3 最大吸收波长和蒽酮试剂用量的选择
精密吸取海藻糖标准溶液 2.0ml于 2支具塞试管中，
分别加入新配制的0.2%蒽酮试剂，依次为4.0ml和8.0ml，
摇匀，置冰水浴中冷却后浸于沸水浴中。自水浴重新
煮沸起，准确煮沸 5min，取出，用流动水冷却并放至
室温，以同样方法处理的重蒸馏水为参照，用紫外可
见分光光度计于 460～800nm范围内扫描。精密吸取样
品溶液和海藻糖标准溶液各 2.0ml于具塞试管中，迅速
加入新配的 0.2%蒽酮 -硫酸试剂 4.0ml，其他操作同上，
分别确定蒽酮试剂用量和最大吸收波长。
1.2.1.4 水解显色时间的选择
精密吸取海藻糖标准溶液 2.0ml，加入4.0ml 0.2%蒽
酮试剂，摇匀，置冰水浴中冷却后浸于沸水浴中。沸
水浴中加热时间为 1～10min(从水浴重新沸腾算起)，其
他操作同 1.2.1.3，于 625nm下测定其吸光度。
1.2.1.5 标准曲线的制作
用移液管分别精密吸取标准海藻糖溶液 0、0 . 2、
0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml于 7支具塞试管中，加水
至 2.0ml，各管分别加入 0.2%蒽酮 -硫酸试剂 4.0ml，摇
匀，置冰水浴中冷却后浸于沸水浴中。自水浴重新煮
沸起，准确煮沸 5min，取出，用流动水冷却并放至室
温，以同样方法处理的重蒸馏水为参照，在 625nm处
以首管作空白，测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，
海藻糖的浓度为横坐标绘制标准曲线，回归方程为：y =
0.2464x－ 0.0781，R2=0. 9996，结果表明，海藻糖含量
在 10～100 μg/ml范围内与吸光度呈良好的线性关系。
1.2.2 灰树花样品中海藻糖含量的测定
1.2.2.1 样品溶液的制备
用棉纱布过滤收集灰树花发酵液中的菌丝体，蒸馏
水将菌体表面冲洗干净，按1:20(W/V)的比例加入0.5mol/L
的三氯乙酸(TCA)，在冰水中冷浸 20min收集浸提液，
重复 3 次，合并浸提液，作为供试品溶液。
1.2.2.2 样品中海藻糖含量的测定
取 2.0ml样品溶液，按照 1.2.1.5方法进行海藻糖含
量的测定。
1.2.3 稳定性实验
取供试品溶液 2.0ml，按线性关系考察项下操作，
每隔 15min测定 1次吸光度，连续 1h，考察生成物颜
色的稳定性。
1.2.4 重现性实验
取同一批灰树花菌丝体 6份，按照 1.2.2.1制备供试
品溶液，按线性关系考察项下操作测定吸光度。
1.2.5 回收率实验
取同一处理的样品溶液 6份，每份 2.0ml，各加入
0.020mg海藻糖标准品，测定吸光度。计算海藻糖的回
收率。
2 结果与分析
2.1 最大吸收波长和蒽酮试剂用量的确定
图1 蒽酮试剂用量对海藻糖测定的影响
Fig.1 Effects of additions volume of anthrone-sulfuric acid
reagent on determination result of trehalose content
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
1
吸
光
度
波长(nm)
460 500 540 580 620 660 700 740 780
2
1.海藻糖与蒽酮试剂加入量的体积比为 1:4；
2.海藻糖与蒽酮试剂加入量的体积比为 1:2。
图2 海藻糖和灰树花提取液的吸收光谱
Fig.2 Visible absorpyion spectra of standart trehalose and extract
of Grifola frondosa
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
1
吸
光
度
波长(nm)
460 500 540 580 620 660 700 740 780
2
1 .海藻糖标准溶液；2 .灰树花提取液。
通过对扫描图 1的分析发现，当海藻糖溶液与蒽酮 -
硫酸试剂加入量的体积比为 1:4时，其最大吸收波长为
595nm，溶液呈棕绿色；而当海藻糖溶液与蒽酮 -硫酸
试剂加入量的体积比为 1 : 2 时，其最大吸收波长为
625nm，溶液呈蓝绿色，且此时的吸光度也比传统方法
2009, Vol. 30, No. 08 食品科学 ※分析检测220
大。因此，选择海藻糖溶液与蒽酮 -硫酸试剂加入量的
体积比为 1:2。
扫描图 2表明：灰树花用 0.5mol/L的三氯乙酸提取
后，所得溶液最大吸收波长与海藻糖标准溶液的最大吸
收波长一致，均为 625nm。因此，选择 625nm作为测
定波长。
2.2 水解显色时间的确定
由图 3 可知，随着煮沸时间的延长，海藻糖的吸
光度呈现一个变化趋势，在 1～5min的煮沸时间内，海
藻糖与蒽酮逐渐反应完全，吸光度也逐渐增大，到第
5min，由于海藻糖与蒽酮己完全反应，故而吸光度最
大；在 5～10min内，吸光度随煮沸时间的延长而下降，
说明产物在此时间内发生了变化，这是由于水解时间过
长，浓硫酸破坏了产物的结构。所以煮沸 5min是较为
合适的海藻糖测定条件。
2.3 稳定性实验
表 1表明供试品溶液在 1h内稳定， RSD为 0.95%。
时间(min) 0 15 30 45 60 平均值 SD RSD(%)
吸光度 0.435 0.433 0.428 0.425 0.429 0.430 0.0041 0.95
表1 稳定性实验
Table 1 Results of stability experiment
样品号 1 2 3 4 5 6 平均值 SD RSD(%)
吸光度 0.446 0.439 0.441 0.434 0.428 0.451 0.4398 0.0082 1.87
表2 重现性实验
Table 2 Results of repeatability experiments
样品号 海藻糖含量(mg/ml) 平均含量(mg/ml) RSD(%)
1 3.93
2 3.88 3.88 1.42
3 3.82
表4 灰树花中海藻糖含量测定结果(n=3)
Table 4 Determination results of trehalose in Grifola frondosa
mycelium (n=3)
2.4 重现性实验
由表 2可见，同一批 6份灰树花菌丝体海藻糖吸光
度的 RSD为 1.87%。
2.5 回收率实验
结果见表3，平均回收率为93.9%，RSD为1.70% (n=6)。
2.6 样品测定
精密吸取同一供试品溶液 3份，按上述标准曲线条
件进行海藻糖含量测定，结果见表 4。结果测得灰树花
中海藻糖含量为 3.88mg/ml。
3 结 论
采用蒽酮 -硫酸法测定灰树花中海藻糖含量时，用
0.2%蒽酮 -硫酸试剂，样液与蒽酮 -硫酸试剂加入量的
体积比为 1:2，100℃反应 5min，625nm比色，可提高
样品中海藻糖测定的准确度，测定灰树花菌体中海藻糖
含量为 3.88mg/ml，其平均回收率为 106.5%。该方法稳
定性和重复性较好，简便快速，测试费用低，适用于
菌体海藻糖含量的定量测定。
参考文献：
[1] NEWMAN Y M, RING S G, COLACO C. The role of trehalose and
other carbohydrates in biopreservation[J]. Biotechnology and Genetic
Engineering Reviews, 1993, 11: 263-294.
[2] 卢发强, 刘景汉, 欧阳锡林, 等. 人血小板冻干前负载海藻糖技术的
研究[J].中国实验血液学杂志, 2006, 14(4): 156-161.
[3] 庄远, 刘景汉. 生物膜的保护剂海藻糖在冻干红细胞中的应用[J]. 中
国实验血液学杂志, 2006, 14(5): 1061-1064.
[4] 罗明典. 微生物生产海藻糖及其应用前景[J]. 微生物学通报, 1996,
23(4): 252-254.
[5] 汪维云, 王继先. 灰树花液体发酵及多糖提取工艺的优化研究[J]. 农
业工程学报, 2007, 23(4): 276-279.
[6] 刘伟民, 黄达明, 陈庶来, 等. 灰树花深层发酵培养基优化研究[J].
食品科学, 2003, 24(37): 99-102.
[7] 裘娟萍, 孙培龙, 朱家荣, 等. 灰树花深层发酵工艺条件的研究[J].
微生物学通报, 2001, 28(3): 33-35.
图3 煮沸时间对海藻糖含量测定的影响
Fig.3 Effects of heating time on trehalose determination result of
conten t
反应时间(min)
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
吸
光
度
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
样品号 1 2 3 4 5 6 平均回收率(%) SD RSD(%)
取样量(ml) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
加海藻糖量(mg) 0.020 0.020 0.020 0.020 0.020 0.020
海藻糖总含量(mg) 0.092 0.077 0.087 0.085 0.090 0.083
106.5 0.019 1.80
测得吸光度 0.541 0.512 0.537 0.531 0.537 0.521
测得海藻糖量(mg) 0.112 0.097 0.107 0.105 0.110 0.103
回收率(%) 105.5 108.7 107.4 103.8 105.7 107.8
表3 回收率实验
Table 3 Average spike recovery of trehalose
注：海藻糖量本底值为 0.066mg.