全 文 ：基金项目:甘肃省自然科学中青年基金项目(NOYS031-A21-015)作者简介:陈彻(1972-),男 ,讲师 ,甘肃中医学院科研中心细胞生物实验室主任 , E-mail:chen72123@163.com。
红芪总黄酮对过氧化氢致脐静脉内皮
细胞损伤的抗氧化作用
陈 彻 1 ,董建勇 2 ,刘 凯1 ,刘永琦 1 ,王雅丽 1
(1.甘肃中医学院 ,甘肃兰州 730000;2.温州医学院药学院 ,浙江温州 325035)
摘要 目的:研究红芪总黄酮对过氧化氢(H2O2)诱导脐静脉内皮细胞损伤的保护作用。方法:化学发光法检
测红芪总黄酮对氧自由基的清除能力 。建立 H2O2 致脐静脉内皮细胞损伤模型 , 化学比色法检测乳酸脱氢酶
(LDH), 丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性 , 单细胞凝胶电泳法检测对细胞 DNA损伤的影响。结
果:红芪总黄酮可清除氧自由基。 100 μmol/LH2O2诱导脐静脉内皮细胞 4 h, 细胞液 LDH、细胞内 MDA含量升高
SOD活性降低 , DNA损伤明显。红芪总黄酮可明显抑制 MDA损伤 , 显著降低 LDH释放及细胞内 MDA含量 , 提高
SOD活性。结论:红芪总黄酮对 H2O2诱导脐静脉内皮细胞损伤具有保护作用 ,其作用机制可能与提高脐静脉内皮
细胞的抗氧化能力有关 。
关键词 红芪总黄酮;脐静脉内皮细胞;过氧化氢;抗氧化
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2007)09-1099-04
AntioxidantEfectofTotalFlavonoidsofHedysarumpolybotryonHuman
UmbilicalVeinEndothelialCelsInjuryInducedbyHydrogenPeroxide
CHENChe1 , DONGJian-yong2 , LIUKai1 , LIUYong-qi1 , WANGYa-li1
(1.GansuColegeofTraditionalChineseMedicine, Lanzhou730000, China; 2.SchoolofPharmacology, WenzhouMedicalCollege,
Wenzhou325035, China)
Abstract Objective:ToinvestigateprotectiveeffectoftotalflavonoidsofHedysarumpolybotryonhumanumbilicalveinendotheli-
alcellsinjuryinducedbyhydrogenperoxide.Methods:Chemicallightassaywasusedtodetecttheoxygenradicalsscavengingcapacity
oftotalflavonoidsofHedysarumpolybotry.Lactatedehydrogenase(LDH)intheculturemedium, malondialdelyde(MDA)andsuperox-
idedismutase(SOD)inthecellweremeasuredbyspectroscopy, respectively.ThedegressofDNAdamagewasevaluatedwithsingle
celgelelectrophoresis(SCGE)technique.Results:TotalflavonoidsofHedysarumpolybortrycouldscavengeoxygenradicals.Afterbe-
ingexposedto100 μmol/LH
2
O
2
for4 hours, thelevelofLDH andMDAwasincreasedsignificantlywhileSOD levelwas
decreased.However, totalflavonoidsofHedysarumpolybotrycoulddecreasethecontentofLDH, MDAandincreaseSODactivitysignifi-
cantlyandinhibitthedamageofDNA.Conclusion:TotalflavonoidsofHedysarumpolybotryhasprotectiveefectonhumanumbilicalvein
endothelialcellsinjuryinducedbyhydrogenperoxide, whichmayberelatedtoincreasingtheantioxidantcapacityofhumanumbilical
veinendothelialcells.
Keywords TotalflavonoidsofHedysarumpolybotry;Umbilicalveinendothelialcells;H2O2;Antioxdation
发生在机体的氧化反应可导致高反应性的自由
基形成 ,而这些自由基可与多种生物大分子发生反
应 ,导致大分子变性 ,脂质过氧化 ,生物膜损伤 〔1〕 、
加速活体细胞衰老和增加癌症发生的风险〔2〕。抗
氧化剂 ,作为可终止自由基产生的一类化学物质 ,被
认为在预防心脑血管疾病及癌症的发生扮演着极其
重要的作用 〔3、 4〕。因此 ,天然的抗氧化剂在生物学 、
医学 、药理学及食品科学研究领域引起了极大的关
注 〔5〕。
血管内皮处于血液细胞与血管壁的分界面 ,是
具有选择功能的屏障 。内皮细胞的损伤会破坏血管
内皮的完整性 ,继而导致其功能紊乱 。早期的研究
表明血管内皮的功能失衡在动脉粥样硬化 ,高血压
等心脑血管病的发生中扮演关键的角色 〔6、7〕。
本实验采用人脐静脉内皮细胞体外培养 , 以
H2O2作为损伤因素 ,观察红芪总黄酮对 H2O2致内
皮细胞损伤的拮抗作用 ,探讨红芪总黄酮在疾病防
治中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料 红芪为甘肃陇西产道地药材 ,由
陇西精萃植物有限责任公司提供 ,经我院中药鉴定
教研室张西玲教授鉴定为正品 ,其总黄酮由本研究
·1099·中药材 JournalofChineseMedicinalMaterials 第 30卷第 9期 2007年 9月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2007.09.020
室分离和纯化 ,含量经测定 88.3%。RPMI1640为
Sigma公司产品 。新生牛血清购自杭州四季青生物
工程材料研究所 。乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒 ,
超氧化物歧化酶 (SOD)活性测定试剂盒 、丙二醛
(MDA)测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所 。
其它均为市售分析纯试剂 。
1.2 实验方法
1.2.1 化学发光法检测红芪总黄酮对氧自由基的
清除能力:碱性条件下二甲基亚砜自氧化产生氧自
由基使鲁米诺发光〔8〕 ,加入不同浓度的红芪总黄酮
(20、40、60、80、100 mg/L)检测其发光强度。通过
计算对本底发光强度抑制率 ,观察红芪总黄酮对氧
自由基的清除能力。
抑制本底发光率(%)=(本底管发光值 -红芪总黄酮
管发光值)/本底管发光值 ×100%
1.2.2 人脐静脉内皮细胞培养:参照文献方法 〔9〕 ,
略加改动 ,无菌条件下取健康新生儿脐带 25-30cm,
PBS冲洗干净后 ,灌入 0.1% Ⅱ型胶原酶 12 ～ 15
ml, 37℃孵育 15 min,分离 ,调节细胞数在 3 ×105 /
ml, 用 RPMI1640培养液 (含 20%胎牛血清 、 2
mmol/LL-谷氨酰胺 100 U/ml青霉素和 100 g/L链
霉素)接种于 6孔培养 2 ～ 3 d后细胞呈单层铺路石
样排列 ,换液后用于实验 ,内皮细胞鉴定采用Ⅷ因子
相关抗原免疫组化染色鉴定。
1.2.3 实验分组:处于对数生长期的脐静脉内皮
细胞 ,随机分为 3组:正常组 、H2O2损伤组和 H2O2
+红芪总黄酮组(20、40、 60、80、100 mg/L)。各用
药组给予相应浓度的药物 ,继续培养 24 h。药物作
用 20h后 ,给药组与损伤组一起分别加入终浓度为
100μmol/LH2O2继续培养 24 h,然后进行相应指
标测定 。
1.2.4 脐静脉内皮细胞 LDH释放量的检测:取细
胞上清液 10 μl,按照 LDH测定试剂盒说明书操作 ,
检测脐静脉内皮细胞培养液中 LDH含量 。
1.2.5 SOD活性及 MDA含量测定:按南京建成生
物工程研究所提供试剂盒操作说明 ,以 TBA法检测
MDA含量;采用黄嘌呤氧化酶法测定 SOD活性 ,实
验重复 3次 ,每次 6个复孔 ,取均值。
1.2.6 单细胞凝胶电泳检测红芪总黄酮对 H2O2
诱导的脐静脉内皮细胞 DNA损伤的防护作用:用单
细胞电泳法 〔10、11〕。吸取 80 μl1%正常溶点琼脂糖
均匀涂于磨毛的载玻片上 ,水平置于冰上成胶 5 ～
10 min,吸取 50 μl细胞液(约含 104 ～ 105个)与等
体积 1%低溶点琼脂糖混匀 ,迅速涂布于底胶上 ,水
平置冰上成胶 5 min。将凝固好的微凝胶玻片放于
盛有 裂解液 (含 2.5 mol/LNaCl, 100 mmol/L
Na2EDTA, 10mmol/LTris,临用前加 10%的 DMSO,
1% TritoxX-100)的电泳槽中 ,静置 40 min使 DNA
旋转 , 300 mA电泳 1h,停止电泳后将玻片转移至中
和缓冲液中 ,作用 10 min后用蒸馏水冲洗 ,略干后
滴加溴化乙啶染色 ,盖上盖玻片 ,以上操作均在 4℃
下进行。在荧光显微镜下测量总慧星长度(放大倍
数为目镜 10×,物镜 20×),计算细胞慧星出现率和
DNA损伤抑制率 。
1.2.7 统计学处理:实验结果用 x±s表示 , 用
SPSS11.0软件做 t检验分析 。
2 研究结果
2.1 红芪总黄酮对氧自由基的清除能力 实验结
果显示 ,红芪总黄酮具有一定的氧自由基清除作用 ,
且呈一定的量效关系(表 1)。
表 1 红芪总黄酮对氧自由基的清除作用( x±s, n=6)
组别 剂量(mg/l) 发光值 抑制率(%)
本底组 298.89±30.08
H2O2 +红芪总黄酮组 20 205.97±18.69＊＊ 31.09
40 165.93±15.40＊＊ 44.48
60 140.21±10.72＊＊ 53.09
80 117.98±15.70＊＊ 60.53
100 106.55±7.90＊＊ 64.35
注:与本底组比较 , ＊＊P<0.01
2.2 红芪总黄酮对 LDH释放 、SOD活性及 MDA
含量的影响 表 2所示 ,与正常组比较 , H2O2损伤
组细胞培养液中 LDH水平显著升高 ,细胞内 MDA
含量增高 , SOD活性降低 ,其差异具有显著性 。而
H2O2 +红芪总黄酮各浓度组 LDH水平明显降低 ,
红芪总黄酮各浓度组细胞的抗氧化能力均增强 ,抑
制 H2O2所致细胞的脂质过氧化损伤 ,表现为细胞
内 SOD活性升高 , MDA生成减少 。与 H2O2损伤组
比较 ,有显著性差异(P<0.01)。
表 2 红芪总黄酮对 H2O2诱导脐静脉内皮细胞 LDH、
SOD活性及 MDA含量的影响( x±s, n=6)
组别 剂量(mg/l) LDH(U/L) MDA(nmol/L) SOD(U/mg)
正常组 58.87±7.13 7.65±1.11 95.92±8.59
H2O2组 147.16±15.11■ 19.15±2.09■ 70.56±9.38■
H2O2+红芪总黄酮组 20 130.99±10.84 16.47±1.10＊ 73.05±6.39
40 98.64±8.57＊＊ 12.79±1.28＊＊ 78.26±7.77
60 93.38±10.54＊＊ 10.03±1.46＊＊ 85.25±6.09＊＊
80 80.32±9.06＊＊ 8.62±0.80＊＊ 89.39±7.22＊＊
100 73.95±5.51＊＊ 8.37±1.01＊＊ 89.45±6.29＊＊
注:与正常组比较 , ■P<0.01;与 H2O2 组比较 , ＊P<0.05,
＊＊P<0.01,下表同
·1100· 中药材 JournalofChineseMedicinalMaterials 第 30卷第 9期 2007年 9月
2.3 对脐静脉内皮细胞 DNA损伤的影响 由表 3
可见 , H2O2组 DNA损伤率明显高于正常对照组(P
<0.01);给予不同剂量红芪总黄酮后 ,由 H2O2诱
发的 DNA损伤率明显降低 ,与相应的 H2O2组比较
差异有显著性(P<0.05-0.01),说明红芪总黄酮对
H2O2诱导的 DNA损伤有一定的保护作用 ,且呈量
效关系 。
表 3 脐静脉内皮细胞慧星出现率及抑制率( x±s)
组别 剂量(mg/l) 慧星出现率 抑制率(%)
正常组 5.83±1.05
H2O2组 64.51±6.96■
H2O2 +红芪总黄酮组 20 52.07±3.34＊ 19.28
40 38.87±6.79＊＊ 39.75
60 36.24±4.57＊＊ 43.82
80 30.97±5.86＊＊ 51.99
100 29.27±6.54＊＊ 54.62
3 讨论
黄酮类化合物作为天然产物抗氧化剂已有较多
研究〔12 ～ 14〕。黄酮类化合物能有效地清除自由基 ,抑
制脂质过氧化。红芪为豆科植物多序岩黄芪
(HedysarumpolybotrysHand.-Maz)的干燥根 ,是黄
芪中的上品 。具有补气固表 、利尿排毒 、排脓 、敛疮
生肌等多种功效 。然而对其所含黄酮的抗氧化作用
笔者尚未见相关文献报道 。
本实验结果表明 ,红芪总黄酮具有清除氧自由
基的能力 。 H2O2作为一种化学性 DNA损伤诱导
剂 ,能很容易地穿透细胞膜自由进入细胞 ,在细胞核
内的 H2O2可转变成具有高活性羟自由基 ,从而造
成 DNA链断裂 。红芪总黄酮对 H2O2诱导的 DNA
的损伤有一定的保护作用 。说明红芪总黄酮亦具有
清除羟自由基的能力 。
LDH水平的升高是细胞受损的一个敏感指标 ,
细胞释放 LDH增加 ,通常反映细胞损伤 ,细胞膜通
透性增加。本研究结果提示 , H2O2(100 μmol/L)诱
导 4 h,脐静脉内皮细胞培养液中 LDH含量较正常
组明显升高 ,红芪总黄酮各剂量组均可降低 H2O2
所致脐静脉内皮细胞 LDH释放 ,提示红芪总黄酮对
H2O2所致脐静脉内皮细胞损伤具有一定的保护作
用 。
MDA可使磷脂 、蛋白质发生交链 、变性 ,同时其
含量的变化间接反映了组织中氧自由基含量的变
化 〔15〕 ,常用来反映组织脂质过氧化损伤的程度 。而
SOD可催化歧化反应 ,清除引发自由基连锁反应的
起始基-超氧阴离子 ,其活性高低可间接反映组织自
由基的含量和脂质过氧化程度。因此 ,测定 MDA、
SOD活性不仅可反映脐静脉内皮细胞损伤的原因 ,
而且还可以判断细胞损伤的程度 。本研究显示
H2O2(100 μmol/L)诱导脐静脉内皮细胞 4 h时 ,与
正常组相比 ,损伤组脐静脉内皮细胞内 MDA含量
明显升高 ,而 SOD活性显著降低 ,提示 H2O2 (100
μmol/L)所致脐静脉内皮细胞损伤与脂质过氧化损
伤有关。红芪总黄酮各剂量均可提高脐静脉内皮细
胞内 SOD活性并显著降低细胞内 MDA水平 ,表明
红芪总黄酮可能是通过抗过氧化损伤作用保护
H2O2诱导的脐静脉内皮细胞损伤 。
参 考 文 献
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(2007-02-08收稿)
基金项目:教育部资助项目(编号 2004-20);上海市科委资助项目(DZ19713)作者简介:卢毅(1977-),男 ,博士研究生 ,专业方向:中药新药研究 , Tel:021-51322324。＊通讯作者:张彤 ,男 ,博士 ,副教授 , E-mail:zhangtdmj@sohu.com, Tel:021-51322318。
葛根经鼻给药喷雾剂在兔体内药代动力学研究
卢 毅 ,张 彤＊ ,陶建生 ,徐莲英
(上海中医药大学 ,上海 201203)
摘要 目的:研究葛根喷雾剂中葛根素在兔体内的药代动力学规律 , 绘制药-时曲线 ,据此计算其在兔体内的
药代动力学参数。方法:用高效液相色谱法(HPLC)测定葛根素在兔血浆中的浓度 , 以甲醇沉淀血浆蛋白质 , 用
3P87程序软件计算药代动力学的各参数和生物利用度。结果:葛根经鼻给药喷雾剂在兔体内的过程为二室模型 ,
主要药代动力学参数是 t1/2(β )=0.93 h, CL=44.23 mg· L-1 , AUC=16.28 mg· h· L-1 , Cmax=5.9 mg· L-1和 tmax=
0.975 h。结论:本研究可以为葛根经鼻给药质量评价和剂型改革提供一些科学依据。
关键词 葛根经鼻给药;生物利用度;药代动力学;喷雾剂
中图分类号:R285 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2007)09-1102-04
PharmacokineticsofPuerariaforIntranasalonSprayinRabbits
LUYi, ZHANGTong, TAOJian-sheng, XULian-ying
(ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine, Shanghai201203, China)
Abstract Objective:Toexplorepharmacokineticfeaturesofpuerarininpuerariasprayandcalculatepharmacokineticparameters
accordingtopuerarinofdrug-timecurveinrabbits.Methods:TheconcentrationofpuerarininplamsawasdeterminedbyHPLC.The
methanolwasusedtosedimentprotine.The3P87 programwasusedtocalculatethepharmacokineticparameters.Results:Thevivo
courseofpuerariainspraycouldbedescribedbythetwocompartmentmodel.ThemainpharmacokineticparametersofPuerariaspray
were:t1/2(β )=0.93 h, CL=44.23mg· L-1 , AUC=16.28 mg· h· L-1 , Cmax=5.9 mg· L-1andtmax=0.975h.Conclusion:Thestudy
wilprovidesomescientificbasisesforthequalityevaluationandpharmaceuticsreformationofpuerariaforintranasal.
Keywords Puerariaforintranasal;Bioavailability;Pharmacokinetics;Spray
采用新工艺制备的葛根黄酮 (puerariafla-
vanoids, PF)纯度在 65%以上 ,而葛根素(puerarin,
PU)纯度为 34%。临床报道 ,葛根可用于预防和治
疗缺血性脑血管方面疾病〔1 ～ 5〕。研究表明口服给
药 ,葛根有效成分葛根素胃肠道吸收很差 〔6〕 ,正常
人口服后 72h从粪内排除 73.3%,而注射给药不方
便 ,易出现多种不良反应 〔7 ～ 9〕。课题前期研究工作
表明 ,葛根经鼻给药与口服给药相比 ,吸收快 ,可以
显著提高生物利用度 。那么 ,将葛根的有效成分制
备成经鼻给药的制剂 ,在机体吸收的规律如何 ,以何
种形式分布 ,有何代谢特点 ,研究上述问题 ,可以更
好地探讨葛根经鼻给药制剂 ,为临床应用提供可靠
的依据有重要意义 。
1 材料与仪器
1.1 动物 新西兰大白兔 ,体重为(2.5±0.7)kg,
上海中医药大学试验动物中心提供。
1.2 药品与试剂 葛根素对照品(中国药品生物
制品检定所),葛根黄酮(自制产品 ,纯度 65%,批号
为 050606), 葛根喷雾剂 (自制产品:批号为
051018);甲醇等试剂均为 AR。
·1102· 中药材 JournalofChineseMedicinalMaterials 第 30卷第 9期 2007年 9月