全 文 ：２０ １ ６ 第十八卷 第二期 ★Ｖｏｌ ． ｌ８ Ｎｏ ．２
基于 ＩＴＳ２ 厚 列签走紅 合 二丸药材
及其逯缘 易 混品 ＊
郑丽慧 ｕ ，徐 江 ３ ， 李西文 ３ ， 丁晓萍 ２ ， 肖 凌 ２ ， 汪 波 ２ ， 李丹平
（ １ ． 湖北中医药大学 武汉 ４３００６ ５ ；２ ． 湖北省食品药品监督检验研究院 武汉 ４３００７ ５ ；
３ ． 中国 中医科学院中药研究所 北京 １ ００７００ ）
摘 要 ： 目 的 ： 基 于 ＩＴＳ２ 序 列 建立红 白 二丸 药 材及其近缘 易 混品 的 分子鉴定方 法。 方 法 ： 共 收集 ６７
份红 白二丸药材 （ 中 华秋海 裳 ） 及其近缘 易 混品 （秋海裳 、 掌裂叶秋海 裳和柔毛秋海裳 ） ，提取总 ＤＮＡ 、 ＰＣＲ
扩增 ＩＴＳ２ 序 列并进行双 向 测 序 ， 通过 Ｃｏｄ ｏｎＣｏｄ ｅＡ ｌ ｉｇｎｅ ｒＶ４ ． ２ ． １ 对测序序 列 进行质量分析和拼接 ， 采 用
ＭＥＧＡ６ ． ０ 进行 多 序列 比对分析 ，并基于最近距 离 法和建树法 （ ＮＪ 树和 ＵＰＧＭＡ 树 ） 对红 白 二丸药材及其近
缘 易混品进行物种鉴定 。 结果 ： 最近距 离 法和建树法的结果均表明 中 华秋海 裳与 其近缘 易 混品掌裂叶秋海
裳 、 柔毛秋海裳能有效 区分 ， 但其与 秋海 裳 未能 区分开 （秋海 裳与 中华秋海裳 为原 亚种与 亚种的 关 系 ） 。 结
论 ： ＩＴＳ２ 序 列 可 以有效 区分红 白 二丸药材及其近缘易 混品的 物种基原 ， 可以作为 红 白二 丸药材的 分子鉴定
方 法 ， 为红 白二丸药材的 真伪鉴别和保证临床用 药安全提供有效的技术 支持 。
关键词 ： ＤＮＡ 条形码 ＩＴＳ２ 序列 红 白 二丸 近缘 易 混品
ｄ ｏ ｉ： １０ ． １ １ ８４２ ／ｗｓ ｔ ． ２０ １６ ． ０２ ．０ １４中 图 分类号 ： Ｒ２８２ ． ５文献标识码 ：Ａ
秋海棠属 药用历史始载于公元 １ ７ ６ ５ 年的 《本ｐｄ ｃｍ／ＷａＬ ｅｖ ｉ ． 的 根状茎 （水八 角 ） 和柔 毛秋海棠
草纲 目拾遗 》 ，历史悠久 ， 疗效确切 ， 在 １ ０ 多个 民族ｊＢｅｇｏｒａ ｉａＡｅ／ ｉｒｙ ｉＨ ｅｍ ｓ ｌ ． 的块垄 （岩丸子 ） 都作为红 白
被广泛使用 ⑴ 。 红 白二丸为秋海棠科 Ｂ ｅｇｏｎ ｉａ ｃ ｅａｅ二丸药材使用 ［ ６＿ ９］ ， 但它们的功能主治并不完全相
植物 中华秋海棠 Ａ ． ＤＣ ． 的块茎或同 ？ ， 造成了 红 白 二丸药材的误用 和混用 。 目 前 ，
全草 ， 又称红黑二丸 、岩丸子 、鸳鸯七 、 一点血 、 山海秋海棠属药材的鉴定多集 中在传统的性状 、 显微鉴
棠 ， 其性味苦 、 酸 、 平 ， 在 土家族 、 苗族 、 白 族 、 傣族 、 别等方面 ［ １ １ ＿ １ ５ ］ 。 这些方法的主观性较大 、 特异性不
拉祜族、 仡佬族等少数 民族 常被用来治疗 月 经不强 ， 无法满足 中草药去伪存真的需求 。 因此 ， 急需
调 、跌打损伤和痢疾等症 ［ ２＿５ ］ 。一种快速 、稳定 的方法来准确鉴别红 白二丸药材及
部分 中草药的 “ 同 名异物 ” 现象给 中草药安全其近缘易混品 。
有效使用带来极大的隐患 。 由于历代本草记载不一 ＤＮＡ 条形码技术具有准确 、稳定 、重现性好 、操
致 ， 各地 民 间的用药 习惯不 同 ， 以及秋海棠属药材作简便等特点 ， 是 当前物种鉴定的研究热点 ［ １ ６— ２ １ ］ 。
原植物 、 药用部位形态非常相似等原 因 ， 民 间常将目 前 ， 中药材 ＤＮＡ 条形码分子鉴定法指导原则 已
中 华秋海棠与 同 属植物秋海棠 ｆｉｅ贫ｏ ｎｉ ａｅｍｒａｓ ｉ ａｎａ纳人 《 中 国 药典 》 ２０ １ ０ 年版第三增补本附录及 《 中
Ａｎｄｉ ？？ 的块茎或全草 （秋海棠 ） 、掌裂叶秋海棠 国 药典 》 ２０ １ ５ 年版指导原则 ［２２ ’ ２３ １ ， 已在多种动植物
药材及其混伪品的鉴定 中得到 了广泛 的应用 ［ ２３ － ３° ］ 。
收稿 日 期 ： ２０ １ ５－ １ １ －２９本研究利用 ＩＴＳ２ 序列对红 白 一？ 丸药材及其近缘易
修回 日 期 ： ２０ １ ５－ １ ２－０７
＊湖北 省 自 然科学基金委重点项 目 （ ２ ０１ ５ＣＦＡ０９ ８ ） ： 湖北常用秋海裳科药 用植物 ＤＮＡ 条形码鉴定及亲缘关系分析 ， 负 责人 ： 李丹平 。
＊＊通讯作 者 ： 李丹 平 ， 主任药师 ， 硕士生导师 ， 主要研究方向 ： 中药 资源及其品质研究 。
２３０［ＷｏｒｌｄＳｃｉ ｅｎｃｅａｎｄ Ｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｍｏｄｅｒｎ ｉｚａ ｔｉｏｎｏｆ Ｔｒａｄｉｔ ｉｏｎａ ｌＣｈｉｎｅ ｓｅＭ ｅｄｉｃ ｉｎｅａｎｄ Ｍａｔ ｅｒ ｉａＭｅｄｉｃａ ］
世界科学技术一中医药现代化★专题讨论 ： Ｄ ＮＡ条形码技术在中药材及其种源鉴定中的应用
混 品进行 ＤＮ Ａ 条形码鉴定研究 ， 可 为 红 白 二丸药 １ ． ２ ． ２ＰＣ Ｒ 扩增及测 序
材 的快速 、 准确鉴定及其安全用药提供技术 保障和 ＩＴＳ２ 序列扩增及测序 的通用 引物 １ＴＳ ２Ｆ 为 ： ５ ＇－
科学依据 。 ＡＴＧＣＧＡＴＡ ＣＴＴＧＧＴＧ ＴＧ ＡＡＴ－３ ， ， ＩＴＳ ３ Ｒ为 ： ５ ， － ＧＡ
， 卜 ． ＣＧＣ ＴＴＣＴＣ ＣＡＧＡ ＣＴＡ ＣＡＡＴ－３
，
。 ＰＣＲ反 应 体 积
１材料与万法 为 ２ ５ 叫 ， 体系 内 含 ２ ｘ Ｔ ａ ｇＰＣ ＲＭ ａ ｓ ｔ ｅ ｒＭ ｉ ｘ（批号 ：
１ ． １ 材料２６ １ ７４２ＡＸ ， 北京艾德莱生物科技有限公司 ） １ ２ ．５ 吣 、
本实验共收 集了 红 白二丸药材 （ 中 华秋海棠 引 物各 １ ． ０ 卟 （ ２ ． ５ｎｍ ｏ ｌｆ ） 、模板 ＤＮ Ａ 为 ２ 叫 ，
的块茎 、 全草 ） 及其近缘易混品 （ 秋海棠 ｆｉ ．加 灭 菌 双蒸水至 ２ ５ｈ Ｌ 。 扩 增 程序 ： ９ ４ ｔ 预变性
ｅｍＷａｎ ａ 的块茎 、全草 ， 掌裂叶秋海棠 ｆｉ ．５ １１１ 丨 １１ ， ９４＾变性 ３〇 ３ ， ５６ ￡£ 退火 ３〇 ３ ， ７２ ＜１：延伸 ４５３ ， ４０
的根状茎 ，柔毛秋海棠 的块茎 ） 共 ４ 个物个循环 ， ７ ２ 丈 延伸 １ ０ｍ ｉ ｎ ［ ３ ２ １ 。 ＰＣ Ｒ 扩增产物使用琼
种 ６ ７ 份样品 ， 以 上样 品 均经中 南 民族大学万定荣脂糖凝胶电 泳进行检测 ， 将条带单一且清晰 的 ＰＣ Ｒ
教授鉴定 ， 样 品信息详见表 １ 。产 物 用 全 自 动 ＤＮ Ａ 测 序 仪 （ 型 号 ： ２ ７ ２ ０Ｘ Ｌ ， 美 国
１ ． ２方 法Ａｐ ｐ ｌ ｉ ｅｄＢ ｉ ｏｓ ｙｓ ｔｅｍ ｓ 公司 ） 进行双向 测序 。
１ ． ２ ． １ＤＮ Ａ 提取 １ ． ２ ． ３数据处理
取干燥药材经 ７ ５％ 乙醇擦拭药材表面后称取将测序后 的 序列使用 Ｃｏｄ ｏｎＣ ｏ ｃｌ ｅＡｌｉ ｇｎ ｅ ｒＶ４ ． ２ ．４
５０ｍｇ（ 原植物 干 燥 叶片称 取 ３０ －４０ｍ ｇ ） ， 高 通量 （ 美 国 Ｃｏｄ ｏｎＣ ｏｄ ｅ 公 司 ） 校 对拼 接 ， 去 除 引 物 区 ，
组织球磨仪研磨 ２ｍ ｉ ｎ （ ５ ０Ｈ ｚ ） ， 利用植物 ＤＮＡ 提同 时 基于 隐 马尔 可 夫模 型 Ｈ ＭＭ ｅ ｒ 注释除去 ５ ． ８ Ｓ
取试剂盒 （ 批号 ： ０ ３４２ ８ ， 北京天 根生化科技有限公和 ２ ８ Ｓ ， 从 而 获 得 ＩＴ Ｓ２ 序 列 ［ ３４］ 。 所 有 序 列 用 软
司公司 ） 提取总Ｄ ＮＡ ， 叶 片样 品６５ ｔ 水 浴３ ０ｍ ｉ ｎ  ， 件Ｍ ＥＧＡ６ ． ０（Ｍ ｏ ｌｅ ｃｕ ｌ ａｒＥ ｖ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏｎ ａ ｒｙＧ ｅｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｓ
块茎 样 品 加 核 分离 液 （ １ ００ｍｍ ｏ ｌ ． Ｌ／ １ ，Ｔｒ ｉ ｓ － Ｈ Ｃ Ｌ ，Ａ ｎａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ） 进 行 比 对 分 析 １ ３ ５ ］ ， 并 基 于 Ｋ ｉ ｍ ｕｒ ａ２
ｐＨ＝ ８ ． ０ ；２ ０ｍｍ ｏ ｌ ． Ｌ
１Ｅ ＤＴＡ ， ｐＨ ＝ ８ ． ０ ；０ ． ７ｍｍｏ ｌ ． Ｌ
－
１
，Ｐａ ｒａ ｍ ｅ ｔｅ（Ｋ２ Ｐ） 双 参 数模 型 计 算 种 内 、 种 间 遗
Ｎ ａＣ Ｉ ， ２％ＰＶ Ｐ４０ ， ０ ．４％ Ｐ－ 巯基 乙醇 ） 【３ １ ］ 洗涤 ， 每次传 距 离 分 析 ， 用 邻 接 （ Ｎ ｅ ｉ ｇ ｈｂ ｏ ｒＪ ｏ ｉ ｎ ｉ ｎ ｇ ，Ｎ Ｊ） 法 、
８０ ０ 叫 ， 洗涤 ３ 次后 ， ６ ５ １水浴 ３ｈ ， 其余步骤按照 （ ＵＰＧＭ Ａ） 构建系统发育树 ， 利用 Ｂｏ ｏ ｔｓ ｔ ｒａ ｐ（１００ ０
试剂盒说明进行 。次 ） 检验各分支的支持率 。

表 １ 红白二丸药材及其近缘易混品

药材名原植物名拉丁名样品数样品 来源ＧｅｎＢａｎｋ 号功效
红 白二丸中 华秋海裳Ｂｅｇｏｎｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ２湖北恩施ＫＴ９８９４５０ 、 ＫＴ９８９４６８ 活血调经 、镇痛
６湖 化荆 门ＫＴ９８９４５ １ －ＫＴ９８９４５４ 、Ｍ＾１ ＫＴ９８９４４５ ． ＫＴ９８ ９４６７
７湖北神农架ＫＴ９８９４５ ５－ＫＴ９８９４６ １
５湖北咸宁ＫＴ９８９４６２－ＫＴ９８９４６６
２江西九江ＫＴ９８９４６９ 、 ＫＴ９ ８９４７ ０
秋海裳 秋海裳Ｂ． ｅｖａｍｍｍ６湖北恩施 解毒散痒 、止痛杀虫
Ｋ ．  １ ＶｏＶ４４Ｊ ＞ Ｋ． １ Ｖ〇ｙ４４４
５湖北 宜 昌ＫＴ９８９４３５－ＫＴ９８９４３ ８ 、 ＫＴ９８９４４９
３江西九江ＫＴ９８９４４６－ＫＴ９８９４４８
水八角 ＩＳ６ 湖北恩施＝＝＝＿＿ 触止血 、利湿消肿
４湖北神农架ＫＴ９８９４７４－ＫＴ９８９４７ ７
” 、上。— 曰ＫＴ９８９４７８－ＫＴ９８９４８ １ 、
１ １湖北宜 昌 ＿ＫＴ９８９４８４－ＫＴ９８９４９０
岩丸子柔毛秋海裳Ｒ ｈｅｍｙｉ１ ０湖北宜 昌ＫＴ９８９４９３－ＫＴ９８９５０２活血消肿 、解毒利湿
［ ＷｏｒｌｄＳｃ ｉｅｎｃ ｅａｎｄＴｅｃ ｈｎ ｏｌｏｇｙ／Ｍｏｄｅ ｒｎｉｚａｔ ｉ ｏｎｏｆＴｒａｄｉ ｔｉｏｎａ ｌＣｈ ｉ ｎｅｓ ｅＭｅｄｉｃ ｉｎ ｅａｎｄ Ｍａ ｔ ｅｒｉａＭｅｄｉｃａ］２３  Ｊ
２ ０ １６ 第十八卷 第二期 ★ Ｖ〇１ ． １ ８ Ｎ〇 ． ２
２ 结果与分析Ａ－Ｔ 变 异 、 ２ ０ １ 位点 Ｇ－Ｔ 变 异 ， ２ １ ０ 位 点 、 ２ １ ３ 位点
＿Ｌ＾，Ｇ－ Ｃ 变异 ， ２ １ ７ 位 点 、 ２ １ ９ 位点 Ａ－ Ｃ 变异 ， ２ ２ １ 位点２ ． １ 红 白二 丸 约材 及其近缘 ％ 混品序 列 变＇为 析Ｔ＿Ｇ 变异 ， ２ ３０ 位点 Ｇ ＿Ａ 变异 ， ５ 个单倍型 。红 白 一丸药材及 其近缘易混 ｕ 口 的 序 列 长 度 ＾＆２ ． ２ 红 白二丸 药材及其近缘 易 混品遗传距 离 分析
２ ２ ６－ ３ １ ０ｂ ｐ ’ ＾ＩＴ Ｓ２ 序列特征及遗传距离见表 ２ 。 基于 ＩＴＳ ２ 序列 的 Ｋ２ Ｐ遗传距离分析结果表明 ，中华秋海棠 （ Ｂ ．— ）的 ＩＴＳ２ 序列共 ２ ２ 条 ， 中 华秋海棠的最大种 内距离为 〇 ． 〇４０３ ； 在 中华秋海序列 平均长 度 ３ ０９ｂ ｐ ， 平 均 Ｇ Ｃ 含量为 ６ ０ ．２％ ， 有 棠与 ３ 种近缘易混 品 的种 间最小遗传距离 中 ， 中华
１ ２ 个变异位点 ， ９ 个单倍型 ， Ａ２ 和 Ａ６ 是 中 华秋海 秋海棠与柔毛秋海棠的距离最远 ， 为 〇 ＿ １ ４４６ ； 其次棠主要的单倍型 。 红 白二丸药材 ＩＴＳ ２ 序列种 内变 是 中 华秋海棠与掌裂叶秋海棠 ， 为 〇 ． 〇 ９ ５６ ； 中 华秋
异位点见表 ３ 。海棠与秋海棠的最近 ， 为 ０ ． ０ ０００ 。 红 白二丸药材及
秋海棠 （ Ｂ ．ｅ 〃ａ ／＾ａ ｒｍ ） ＩＴＳ ２ 序列共 １ ４ 条 ， 序列 其近缘 易混品 的种 内种间 Ｋ２Ｐ 遗传距离见表 ２ 。 红
平均长度 ３ ０ ８ｂ Ｐ ， 平均 ＧＣ 含量为 ６０ ． １ ％ ， 有 ３ｔ变白二丸药材 的种 内 Ｋ２ Ｐ 遗传距离及其与 各近缘易
异位 点 ， 分别是 １ ９７ 位点 Ｃ －Ｔ 变异 、 ２ ６ ５ 位点 Ｔ －Ｃ混品的种间 Ｋ２Ｐ 遗传距离见表 ４ 。
或 Ｔ－ Ｙ 变异 、 ２８ ９ 位点 Ｇ－Ａ 变异 ， ５ 个单倍型 。２ ．３ 红白 二丸 药村及其近缘易混品 ＩＴＳ２ 序 列聚类分析
掌 裂 叶 秋海棠 （ 及 ｐｅＡｍ／Ｗａ ｎＴＳ２ 序 列 共 ２ １基于 Ｉ ＴＳ ２ 序 列构建红 白二丸药材及其近缘易
条 ， 序 列平均长度 ３ ］ ０ｂ Ｐ ， 平均 Ｇ Ｃ 含量为 ５ ８ ． ６％ ，混品 ＵＰ ＧＭ Ａ 树 （ 图 １ ） 和 Ｎ Ｊ 树 （ 图 ２ ） ， ２ 种方法均
有 ５ 个变异位 点 ， 分别是 １ ８ 位 点 Ｃ－Ｔ 变异 ， ４ ５ 位采 用 Ｋ２Ｐ 距离 ， 并 以 Ｂｏｏ ｔ ｓｔ ｒａｐ 作 １０００ 次可 信度
点 Ｔ－Ａ 变 异 ， ４７ 位点 、９ ３ 位点 Ｃ －Ｇ 变异 ， １ ２ ０ 位点分析 ， 以评价分支 的统计学意 义 和可靠性 。 由 图 １
Ｇ－Ａ 变异 ， ６ 个单倍型。所示结果 可 以看 出 ， 柔毛秋海棠 １ ０ 个样本聚 为一
柔毛 秋海 棠 （ Ｓ ．Ｚｉｅ ｎ ｒｙ ｉ） ＩＴＳ ２ 序列 共 １ ０ 条 ， 序支 ， 其单 系 分支支持率为 １ ０ ０％ ； 掌 裂 叶秋海棠 ２ １
列平均 长 度 ２４ ６ｂ ｐ ， 平 均 ＧＣ 含 量为 ６ １ ．４％ ， 有 ９个样本聚 为一支 ， 其单系分支支持率为 １ ００％ ； 中 华
个变异 位点 ， 分别是 １ ９ 位 点 Ａ－ Ｇ 变异 、 １ ９ ４ 位 点秋海棠与秋海棠聚为一大支 。 同 时 ， Ｎ Ｊ 树得到的结

表 ２ 红 白二丸及其近缘易混品 的 ＩＴＳ２ 序列特征及遗传距离

原植物名平均序列长度 ／ｂｐ平均 ＧＣ 含量 ／％种 内 Ｋ２Ｐ距 离 （ 平均值 ） 种间 Ｋ２Ｐ距 离 （ 平均值 ）
中华秋海裳 ３ ０９ ６０ ．２０－０ ．０４０ ３ （ ０ ．０１０ ４ ）０－０ ． １ ４４ ６（０ ． ０７７ ４ ）
秋海裳 ３ ０８ ６０ ． １ ０－０ ．００９８ （ ０ ．００４ １ ） ０－０ ． １２４ ２（ ０． ０６３ ０ ）
掌裂叶秋海裳３ １ ０５８ ． ６０－０ ．００９ ７（ ０ ． ００３ ３ ） ０ ．０８ ８４－０ ． １ ４９ ９（ ０． １ ０９ ３ ）
柔毛秋海裳 ２４６ ６ １ ．４ ０－０ ．０２９２（ ０ ．０ １０ ２ ） ０ ．０９９０－０ ． １４９ ９（ ０ ． １ ２ １ ９ ）
注 ： 种 间距 离 为 一 个物 种与 其他 ３ 个物种之 间 的 距 离

表 ３ 红 白二丸药材 ＩＴＳ２ 序列种内 变异位点

Ｇｅｎ Ｂａｎｋ 登录号单倍型＾异位点 ／ｂｐ
２４８６１６３１３２１９８２２２２ ５４２６６２８ ７２９０
ＫＴ９ ８９４４５Ａ １Ｇ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ｔ Ｔ Ｔ Ｃ Ｃ Ａ Ａ
ＫＴ９８ ９４５０ Ａ２＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊丁＊ ＊
ＫＴ９８ ９４５５Ａ３＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ Ｃ ＊ Ｇ ＊ ＊ Ｓ
ＫＴ９ ８９４５６ Ａ４Ｃ Ｔ Ａ ＊ ＊ ＊ Ｃ ＊ Ｇ ＊ ＊ Ｇ
ＫＴ９８ ９４５７Ａ５＊＊ ＊ ＊ ＊ ＊ Ｃ ＊ Ｇ ＊ ＊ Ｃ
ＫＴ９８ ９４６０ Ａ６＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ Ｇ ＊ ＊ ＊
ＫＴ９８９４６２Ａ７＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ Ｃ ＊ Ｔ Ｇ ＊
ＫＴ９ ８９４６８ Ａ８＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ Ｇ Ｔ Ｇ Ｇ
ＫＴ９８９４６９

Ａ９

＊ ＊ ＊ Ｇ Ｇ Ｃ ＊ Ｃ ＊ Ｔ Ｇ ＊
注 ： “＊ ” 表示与 第 一行碱基相 同
２３２ （Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｍｏｄｅ ｒｎｉｚａｔ ｉｏｎｏｆＴｒａｄｉ ｔ ｉｏｎａｌ Ｃｈ ｉｎｅｓ ｅＭｅｄ ｉｃ ｉ ｎｅ ａｎｄ Ｍａｔ ｅ ｒｉａ Ｍｅｄ ｉｃａ ］
世界科学技术一中医茜现代化★专题过论 ： ＤＮＡ条形码技术在中药材及其种源鉴定中的应用
果 与 Ｕ ＰＧＭ Ａ 树得到 的结果类似 ， 掌裂叶秋海棠和发现 ： 第 一次 ＰＣＲ 体 系 中 模板 Ｄ ＮＡ 的量是 ２ 叫 ，
柔毛秋海棠均单独 聚为一支 ， 秋海棠和 中华秋海棠ＰＣＲ 成功率为 ５０ ％ ， 然后将第一次 ＰＣ Ｒ 失 败的 样
聚为一大支 。 品 Ｄ ＮＡ 进行浓度测定 ， 发现浓度偏高 ， 其 中 最高 的
３ ． ， ＾ ３个样 品浓度达到 了 １４ １ ０ｎ ｇ
． ｎＬ＇ ９ １ １ｎｇ ． ｎＬ － １ 和
Ｓ ＳＳ ｉｉ ｇｗＬ－ １ 。 于是将 Ｐ ＣＲ 失败样 品 的 Ｄ ＮＡ 模板量
３ ． １ＤＮ Ａ 提取与 ＰＣ Ｒ 扩增改为 １ 从 ， 水 相应 的增加 １ 叫 ， 重新 ＰＣＲ ， 结果电
本实验采 用的是植物 ＤＮ Ａ 试剂 盒提取法提取泳检测条带单 一清晰 ， ＰＣＲ 成功率达 到 了 １ ００％ 。
６ ７ 份样品 总 ＤＮＡ ， 提 取效率高 、 方便 。 通过实验这表 明 Ｐ ＣＲ 体系 中模板 ＤＮ Ａ 浓度过高会导致 ＰＣＲ
扩增 失 败 。 因 此 ， 合 适 的 模 板 Ｄ ＮＡ 浓 度是 保 证
表 ４ 红 白 一丸种 内 Ｋ２Ｐ 遗传距离及其与各近缘易混 品的ＰＣＲ 扩增成功 白勺重要因 孛 ； 之一■
３ ． ２ 红 白 二丸 药材及其近缘 易 混品 的 鉴定
内一 ． ． ０側严 ０ ．書“０ ４軒 丨ＴＳ ２賴 的 Ｋ２ Ｐ ｉｔ传距—果細 ，
中华秋海裳 与秋海裳种间０．０２ ３ ３００ ．００９ ７不 同产地 的 ２２ 份 中 华秋海棠 的种 内最大遗传距离
中华秋海裳 与掌裂叶秋海裳种间 ０ ． １ １ ８ ９０ ．０９５６０ ． １０４ ６为 ０ ．０ ４０３ ， 中华秋海棠与其近缘易混 品 掌裂叶秋海
中华秋海裳 与柔毛秋海裳种 间０． １４４ ６０ ．０９９００． １ １５２棠 、 柔毛秋 海棠 、秋海 棠间 的 最小种间遗传距离 为
ｆ：參纖鐵＿７／／＾ ＼
■ １０ Ｂｅｇｏｎ 丨ａ  ｓｉ— ｓ ＫＴ ９８９４ ５６＿ｉＵＪ ｜— １Ｍ Ｂｅｇｏｎｉ ａ ｓ ｉｎｅｎｓ ｉｓ ＫＴ９８９４４ ５｜
々爾＿＿滅、Ｖ＇ ／
１ １ｊ１ １
秋海裳和 中 华秋海棠
图 １ 基于 １ＴＳ２ 序列构建红 白二丸药材及其近缘易混品 ＵＰＧＭ Ａ 树
注 ： Ｂｏ ｏ ｔ ｓ ｔｒ ａｐ １００ ０ 次重 复 ； 支上仅显示 自 展 支持率 彡 ５ ０ ％ 数值
［ ＷｏｒｌｄＳｃ ｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｍｏｄｅ ｒｎ ｉｚａ ｔｉｏｎｏｆ Ｔｒａｄｉｔ ｉ ｏｎａ ｌＣｈ ｉｎ ｅｓｅ Ｍｅｄｉ ｃ ｉｎ ｅａｎｄＭ ａｔｅ ｒｉａＭｅｄｉｃａ ］２３３
２０ １ ６ 第十八卷 第二期 ★ Ｖｏ Ｌ １ ８ Ｎｏ ．２
＼ ！ｆ
＂
ｆＩ
ｙＣ＼＼＼＼＼１ １ １ｆ１ １／／／ ／
（讀
义，卿 ｖ册ｙ＃１ １ １Ｉ１ １
秋海裳和 中 华秋海裳
图 ２ 基 于 ＩＴＳ２ 序 列构建红 白二丸药材及其近缘 易混品 Ｎ Ｊ树
注 ： Ｂｏ ｏ ｔ ｓ ｔ ｒａ ｐ１０００ 次重 复 ； 支上仅显示 自 展支持率 彡 ５０ ％ 数值
分别 为 ０ ． ０９ ５６ 、 ０ ． １ ４４２ 、 ０ ． ００００ 。 除秋海棠外 ， 中树的结果均表 明 ： 中华秋海棠与其近缘易混品掌裂
华秋海棠与 掌裂 叶秋海棠 、柔 毛秋海棠的最小种间叶秋海棠 、 柔毛秋海棠能很好 的 区分 ； 而 中 华秋海
遗传距离均远远大于 中 华秋海棠的种 内 最大遗传棠和秋海棠不能 有效 区分 。 《 全国 中草药汇编 》将
距离 ， 这表明 中华秋海棠与其近缘易混品 掌 裂叶秋秋海棠和 中 华秋海棠定 为两种 不同 的药材 ， 而 《 中
海棠 、柔毛秋海棠被很好的 区分 ； 而 中华秋海棠与国植物志 》 和 ＦＺ〇ｍ０／ ＣＡ ｉ ｒｕｚ 将秋海棠 和中 华秋海
秋海棠则不能被有效区分 。棠分别处理为原亚种 ｆｉ ．ｇｒａｍｉｈｓｕ ｂｓ ｐ ．ｇｒａｎ出ｓ 与亚
基 于ＵＰＧＭ Ａ法 构 建 的 系 统 发 育树 （ ＵＰＧＭＡ种ｆｉ ．ｇｒａｎｆ／ ：＇ ＇ｓｓ ｕｂ ｓｐ ． （Ａ ．Ｄ ． Ｃ ．）Ｉ ｒｍ ｓｃｈ ． １ ３ ６ ’ ３ ７ 〗 。
树 ） 是在假设一■ 棵进化树中所有物种 的进化速率是根据 《 中 国植物 志 》 和 Ｈｏｒｎ０／ＣＴｉ ｉｎ ａ 分类标 准 ，
相 同的 的情况下构建的系 统发育树 ， 结果发现掌裂在实践 中 即 使是对一株具备全部重要性状 的个体
叶秋海棠和柔毛秋海棠均单独分 为一支 ， 表现出 良开展 鉴定 ， 也无法对秋海棠的种下单元进行准确分
好的 单系性 ， 而秋海棠和 中 华秋海 棠都聚 在一支 ； 类 。 在考察全国 各地馆藏标本时也发现该种 的鉴定
而 Ｎ ｊ 树不用假设进化树 中 所有物 种的进化速率相十分混乱 ， 同一地 区 、 同 一地点 、甚 至同 号 的标本往
同 ， 其得到的结果与 Ｕ ＰＧＭ Ａ 树的结果相似 ， 支持 了往被鉴定为不 同亚种 １ ３ ８ １ 。 所 以 本文希望以 形态学
ＵＰＧＭＡ 树的结果 。为基础 ， 结合分子生物学手段提 出新的 种下分类处
通过分析序列 变异位点 、 遗传距离 和 系统发育理及标准 。 考虑到 丨Ｔ Ｓ２ 是一种用于区分物种间 的
２ ３４（ＷｏｒｌｄＳｃｉ ｅｎｃ ｅａｎｄＴｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｍｏｄｅ ｒｎ ｉｚａ ｔｉｏｎｏｆ Ｔｒａｄ ｉｔ ｉｏｎａｌ Ｃｈｉ ｎｅ ｓｅＭｅｄｉ ｃｉ ｎｅａｎｄ Ｍａ ｔｅ ｒｉａ Ｍｅｄ ｉｃａ ］
世界科学技术一中医药现代化 ★专题讨论 ： Ｄ ＮＡ 条形码技术在中药材及其种源鉴定中的应用
ＤＮＡ 条形码 ， 针对秋海棠和 中华秋海棠的特异性分和 ＵＰＧＭ Ａ 树 ） 分析结果均 能够很好地将红 白二丸
子标记仍需要开发 。药材 与其近缘易混品掌裂叶秋海棠 、柔 毛秋海棠有
效区分 ， 中 华秋海棠和秋海棠不能有效区分 。 因此 ，
ＩＴＳ２ 序列 在物种水平上可 以准确鉴定红 白二丸药材
本实验对 ６ 个不同产地的 ６ ７ 份红 白二丸药材及其近缘易混品 ， 证明 ＩＴＳ２ 条形码技术在物种水平
及其近缘易混 品进行 Ｄ ＮＡ 条形码研究 ， 基于 ＩＴＳ２上对中草药具有 良好的鉴定能力 。 该研究为红 白二
序列 的变异位点 、最近距离 法 、 系统发育树 （ ＮＪ 树丸药材的真伪鉴别和安全有效用药提供技术支持 。
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８２ ． ｈｉ ｄｄｅｎ ａｓｓａｓ ｓ ｉｎ ｓ ｉｎｔ ｒａｄ ｉ ｔ ｉｏ ｎ ａｌｍ ｅ ｄ ｉ ｃ ｉｎ ｅｓｃ ｏｎ ｔａ ｉ ｎ ｉ ｎｇａ ｒｉ ｓ ｔ ｏｌ ｏ ｃ ｈ ｉｃａ ｃｉｄｓ ．
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ｎｏｖ ｅｌＤＮＡｂａ ｒｃ ｏｄｅｆｏｒ  ｉｄｅ ｎ ｔ ｉ ｆｙ ｉｎｇ ｍｅｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ａ ｌｐ ｌａｎ ｔｓｐ ｅｃ ｉｅ ｓ ．ＰＬｏＳＯｎｅ，３４Ｋｅｌ ｌｅ ｒＡ， Ｓｃ ｈ ｌｅ ｉ ｃ ｈｅ ｒ Ｔ ，Ｓｒ ｈｕ ｌ ｔｚＪ ， ｅｌａ ｌ ．５ ．８Ｓ －２８ＳｒＲＮＡ ｉｎ ｔｅ ｒａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎａ ｎｄ
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３７ＧｕＣＺ ，Ｐ ｅｎｇＣＩ ，Ｔｕ ｒ ｌａｎｄＮＪ ．Ｂ ｅｇｏｎ ｉａ ｃｅａｅ ． Ｉｎ ： Ｗ ｕＺＹ ， Ｒａｖｅ ｎＰＨ３ ８李行娟 ， 田代科 ， 李春 ， 等 ？ 秋海棠 （ Ｂｅ ｇｏｎ ｉａ ｇｒ ａｎｄ ｉ ｓ） 的历史文化 、
ａ ｎｄＨｏｎｇＤＹ ，Ｅｄ ｓ ． ，Ｆｌ ｏ ｒａ ｏ ｆ Ｃｈ ｉｎａ ，Ｖ ｏｌ ．１ ３ ，Ｂ ｅ ｉｊ ｉｎ ｇ ： Ｓｃ ｉ ｅ ｎｃ ｅＰ ｒｅ ｓｓ ； Ｓ ｔ利用 、 资源多样性和研究进展 ． 植物学研究 ， ２ ０ １ ４ ， ３ ： １ １ ７－ １ ３ ９ ．
Ｉ ｄｅ ｎ ｔｉ ｆｉ ｃａｔ ｉｏ ｎｏｆＨ ｏ ｎ ｇｂ ａ ｉ ｅ ｒｗ ａ ｎ （Ｂｅｇｏ ｎ ｉａＳｉｎｅ ｎ ｓｉｓ ）ａｎ ｄＩ ｔｓＲ ｅ ｌ ａ ｔｉ ｖｅＡｄｕ ｌｔｅ ｒ ａｎ ｔ ｓ
Ｂａｓｅｄｏ ｎＩ ＴＳ２Ｓ ｅｑｕ ｅｎ ｃ ｅ
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２
，Ｌ ｉＤａｎｐ ｉ ｎｇ
２
（１ ．Ｃｏ ｌ ｌｅｇｅｏｆＰｈａ ｒｍａｃｙ，Ｈｕ ｂｅ ｉＵｎｉｖ ｅｒｓ ｉ ｔｙｏｆＣｈ ｉｎ ｅｓｅＭｅｄ ｉｃｉｎ ｅ ，Ｗｕｈａ ｎ４３００６５ ，Ｃｈ ｉｎａ ；
２ ．Ｈｕｂ ｅ ｉＩｎｓ ｔ ｉ ｔｕｔ ｅ
ｆｏ ｒＦｏｏｄ ａｎｄＤ ｒｕｇＣｏｎｔ ｒｏｌ ，Ｗｕｈ ａｎ４３００ ７５ ，Ｃｈ ｉｎａ；
３．Ｉｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕｔ ｅｏｆＣｈ ｉｎｅｓｅＭａ ｔｅ ｒ ｉａＭｅ ｄ ｉｃａ，Ｃｈ ｉｎａＡｃａｄｅｍｙｏｆ Ｃｈ ｉｎｅ ｓｅＭｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅ ｎｃ ｅｓ ，Ｂｅ ｉｊ ｉｎｇ１ ００ ７００，Ｃｈ ｉｎ ａ）
Ａｂ ｓ ｔ ｒａ ｃ ｔ ：Ｔｈ ｉ ｓｓ ｔｕ ｄｙａ ｉ ｍｅｄｔｏｅｓ ｔａｂｌ ｉ ｓｈａｍｏ ｌ ｅｃｕ ｌ ａ ｒｉｄ ｅｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏｎｍ ｅ ｔｈｏｄｆｏ ｒＨｏｎ ｇｂａ ｉ ｅ ｒｗ ａｎ（Ｂ ．ｓ ｉｎ ｅｎｓ ｉｓ ）ａｎｄｉ ｔ ｓ
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（ 责任编辑 ： 马雅静 张志华 ， 责任译审 ： 朱黎婷 王 晶 ）
２３６［ ＷｏｒｌｄＳｃ ｉｅｎ ｃｅ ａ ｎｄ Ｔｅｃｈ ｎｏｌ ｏｇｙ／Ｍｏｄｅｒｎ ｉｚａｔ ｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｄｉ ｔｉ ｏｎａ ｌＣｈ ｉｎ ｅｓ ｅＭ ｅｄ ｉｃ ｉｎ ｅａｎｄＭａｔ ｅｒ ｉａ Ｍｅｄｉ ｃａ ］