全 文 ：第2 期
1 9 94 年
东 北 师 大 学 报 自 然 科 学 版
J O UR N L A OF N OR T H E AT SN OR ML A UN IVR E ST I Y
N o
.
2
1 94 9
红缘层孔菌多糖 F P Z 的结构
与体外抗肿瘤作用的研究
张丽萍 苗春艳 张秉信
( 东北 师大生物 来 , 长春 , 1 3 0 0 2 4 )
摘要 从红 缘层孔菌子实体 中分离纯化一葡聚糖 , MW 约为 1Z 4 K d , 红外光谱
证 明其含 日型糖普键 , 比旋值 〔a 〕犷为 + 49 。 , 爪 p为 。 . 2 2 , 凯氏定氮及紫外光谱
分析证 明 F P : 为蛋 白多糖 。 F P : 与刚果红络合及 N a O H 浓度对其粘性行为的影
响均显示 俘 l( ~ 3) G L c 为主链 的分子特性 。 高碘酸氧化 、 S m it h 降解 、 甲基化
分析证实 F P : 确 以 p (1 ~ 3) G L 。 为主链 , 其 6 位上带有分支点 , 平均每 3 个搪
残基带有 1 个支链 。 日一消除反应表明 F P : 中的蛋 白质是以 T hr 一。一糖普键及 S er -
O
一糖普键相联 。 F P : 于体外对 S 一 18 0 肿瘤细胞 无抑制作用 。
关键词 红缘层孔菌多糖 F P Z ; 糖链结构 ; 抗肿瘤
近年研究表明许多真菌多糖具有抗肿瘤 , 抗病毒 、 保肝等多种生物功能 , 因此从真
菌中开发新的多糖药物是当今学术界一个新动向 。 我们从红缘层孔菌子实体中提取的水
溶性多糖能增加小 鼠溶血素及凝集素的含量 “ 〕 , 并对小鼠血清及肝脏合成蛋白质的能力
有明显促进作用 〔2〕 。 本文主要报道从粗糖中分离纯化的 F P : 的结构及体外对 S 一 180 肿瘤
细胞有无抑制作用 。
1 材料与方法
1
.
1 F P
Z 的制备 按文献 〔1〕 的方法分离提取 F P Z 。 经链霉蛋白酶及 S ve ag e 法脱去游
离蛋白 , H ZO : 脱色得浅棕色粉末 。
1
.
2 糖的组成分析 采用 G · C 与 P . C 测定 ` 3〕 。
1
.
3 分子量测定 采用 S e p h a r o s e C L 一 4 B 柱层析 ( 9 0 又 1 . s e m , l % N a C I洗脱 , 2 . Zm L /
1 2m i n )
, 用标准葡聚糖 l 0 0 0 K d 、 s o o K d 、 1 5 3 K d 、 8 4K d 为对照 , 酚硫酸法测多糖分布 。
1
.
4 多糖 中蛋 白质测定 采用凯氏定氮法测定蛋白质含量 ,紫外光谱法测定蛋白质的分
布 。
1
.
5 氨墓酸组 成分析 样品经 6m ol / L H CI 封管水解 2 h4 ( 1 10 ℃ ) , 采用 日立 8 3 5一 5 0 型
氨基酸分析仪 , 由吉林大学协助测定 。
1
.
6 F P
: 与 刚果红的络合实验 F P : 溶在 38 拌m ol / L 的刚果红溶液中 , 将溶液中 N a O H
收稿 日期 : 1 9 9 3一 0 3一 0 5
DOI : 10. 16163 /j . cnki . 22 -1123 /n. 1994. 02. 020
浓度由 。 调至 0 . 4m o l/ L, 手动调节各对应碱浓度下溶液的最大吸收波长 。
1
.
7 粘度测定 采用毛细管粘度计按常规方法测定 。
1
.
8 高碘酸氧化 准确称糖样 5 4 m g 与 2 5 m m o l / L N a I O 4 溶液于暗处 ( 1 8 ` C ) 反应 10 2h
至 2 2 3 n m 处光吸收值不变时止 。
1
·
9 Sm i t h 降解 按文献 〔3〕 方法进行 。
2
.
10 甲基化 按 H a k o m o r i 法对 F P : 进行甲基化 。
1
.
1 1 日一消除反应 将 l m g F P Z 加 o · Zm o l / L N a O H 5 m l , 4 5℃ , 反应 3 Om i n , 2 4 0 n m 有光
吸收表 明存在 。一糖昔键 。 再将 F p Z 加入 Zm o l / L N a B H ` (含 0 . Zm o l / L N a O H ) 溶液中 , 氮
气流下反应 3 o h ( 47 ℃ ) , 以 l m ol / L H CI 中和 , 流水及蒸馏水透析 、 浓缩后分为两部份 。
一部份进行氨基酸组成分析 , 另一部份经 S即 h a r os e C L 一 4 B 柱层析检验多糖与蛋 白的分
布 。
1
.
12 F L 羊膜细胞 肿瘤细胞 S 一 1 8 0 均
|
11斗we|ell走叫ses.1一刁-l毛
沐芝尸
1 00 1 2 0 14 0 16 0
V c ( n l l )
图 1 1 1, 2 的分子量测定 s e p h a r , , s e e L 一 4 B 柱层析
l = 1 0 0 0 K d 2 一 5 0 0K d 3 = F P Z
4 = 1 5 3 K d 5 ~ 8 4K d
、 ~ 一 _ _ _ _ _ 一 _ _ _ _ 一 _ 二 _ _ 二 _ - 艺
0
.
1 0
.
2 0
.
3 0
.
4
C
N刃 H一 L
N a 0 H 浓度对 F P Z与刚果红络合的影响
x
一
x 示 F P : 与刚果红的络 合
一 一 一 一示刚果红
取 自白求恩医大应用基础研究所 。
1
.
13 细 胞 培养 液 R P M l l 6 40 培 养液
( G IK C O 美国 ) 内含 10 纬小牛血清为生长
液 , 含 5%小牛血清为维持液 。
2 结果与讨论
从红缘层孔菌水溶性粗糖中分离纯化
一葡聚糖 F P : 。 经 S e p h a r o s e C L 一 4 B 柱层析 ,
F P : 呈单一对称峰 , 由洗脱体积 V 。 查标准
曲线 , 其 M W 约为 21 4 K d 。 F P : 的比旋值
〔a 牙 为 + 4 9 0 , 刀驴 为 O · 2 2 ( C = 0 · 1 6 ,
H
Z
O )
, 红外光谱分析 , 8 9 c0 m 一 ’处的吸收峰
显示其具有 p型糖昔键 〔 , ’ 。
F P Z 经酶与 S e va ge 法联 合脱蛋白后 ,
S e p h a r o s e C L
一
4 B 柱层析图谱中 , F P : 的糖
峰与蛋白峰重合〔幻 F P : 为蛋白多糖 。 凯氏
定氮法测其结合蛋白的含量为 1 . 8写 。
F P Z 可与刚果红结合成西夫碱式的化
合物 。 向此溶液加 N a O H , 调整碱浓度由 o
增至 .0 2m ol / L , 在此区间 , 溶液的最大吸
收波长稳定在 S OOn m 左右 , 因刚果红可与
多糖结合成紫红色的络合物 。 当 N a O H 浓
度大于 0 . 25 m ol / L 后 , 最大吸收波长锐降
(图 l ) 。
此现象在与水溶液中呈三股螺旋构象
的树舌多糖 、 斜顶菌多糖一样 , 其最大吸
啊l当几|翩。即
(utuà.x口提
一 7 5 一
收波长的下降是由于氢氧化钠浓度较高时 , 破坏了稳定三股螺旋的氢键 , 使其发生了三
股螺旋至单股螺旋的变化 。 刚果红不能与单股螺旋结合 , 因而不再呈现与多糖络合时的
紫红色 。
F P Z 的粘性行为与 N a O H 浓度的依赖关系也显示了其在水溶液中呈三股螺旋的构象
特点 。 当 N a O H 浓度由 0 . 02 m ol / L 增至 0 . Zm ol / L 时 , 粘度明显下降 , 其下降趋势与硬
葡聚糖 (S 。 ler og lu ca n) 受 N a O H 浓度的影响 , 构象 由三股螺旋、 单股螺旋~ 无规线团的
变化 , 因而粘度随之变化的趋势相一致 〔 5, 。 }
0
.
1
C 、 . (、日。 ,1 1
图 3 N a o H 浓度对 F P Z特性粘度 〔们 值的影响
中 , l ~ 6 糖昔键较多 , 而且不存在其它可被
、、、、门日r飞l11
ì月I,,
0
.
2
0
.
1 小 J
X
层
口。:口O
nJ
ǎ UO
曾有 多篇文献报道 , 从香菇 、 裂褶菌 、
猪菩 、 云芝 、 树舌等许多真菌中提取出以
俘 (1 ~ 3) G L c 为主链 , 6 位上带有支链的 .
葡聚糖 。 而这些多糖在水溶液 中几乎均呈子
三股螺旋构象即 。 这就提示 F P Z 可能也具 兰
有 p ( 1一 3 ) G L 。 为主链的结构 , 因而在溶叠
液 中显示三股螺旋 的构象特点 。 为确定
F P Z 的糖链 结构 , 分 别进行高碘酸氧化 、
Sm it h 降解 、 完全甲基化 , 结果如下 : F P Z
与 N a I O ` 氧化作用 10 h2 , 紫外光谱检测反
应完全后 , 测得每摩尔 己糖消耗 10 不为
0
.
61 摩尔 , 甲酸释放量为 0 . 30 摩尔 。 10 不
消耗量约等于甲酸生成量的 2 倍 , 提示 F zP
高碘酸氧化的键型 。 高碘酸氧化的另一部
份产物经 N a B H ; 还原后进行完全酸水解 ,
G
·
C 分析可检 出甘油与 G L 。 。 另一部份
产物经 Sm it h 降解 , 透析袋 内仅检出 G L c ,
说明主链是 由 p (1 ~ 3) 糖昔键构成 , 不受
高磺酸的氧化破坏 。 透析袋外仅检出甘油 ,
表明支链可能是以 (l ~ 6) 昔键相连或处 。
于链的末端 。 F P : 经 H a K 0 m or i 法进行完 苦
全甲基化 , 甲基化糖进行酸水解 , N a B H 4 -
还原 , 乙酞化 , 经 G · C 及 G · C 一M · S 分
析可检测出 2 , 3 , 4 , 6一 G L 。 (表明糖残基
处于链的末端 ) 。 2 , 4 , 6一 G L 。 (表明糖残
基以 1~ 3 昔键相连 ) 。 2 , 4一 G L 。 (表明 6 位
上含支化点的 1一 3 糖昔键 ) 。 三种甲基化糖
的比例为 1 . 0 : 3 . 0 4 : 1 . 02 。 综合高碘酸
氧化 、 Sm iht 降解 、 甲基化的分析结果 , 可
l
~
护.一一一 -一一一一- ~一~一一曰 。图 4 卜消除后 , 对 F P : 多糖与蛋白的检测
见 日 (l ~ 3) G L c 构成了分子的主链 , 6 位上有分支 , 约每 3 个糖残基带有 1 个支链 、 支
链为 1 个 G L 。 。
一 7 6 一
F P
:经 日一消除反应后 , 氨基酸组成分析表明 , 苏氨酸 、 丝氨酸的含量分别下降 61 %
与 4 6纬 。 而其它氨基酸的组成基本不变 。 表明 F P : 中的蛋白质与多糖是通过 T h r 一。 糖昔
键及 eS 卜。一糖昔键相连的 。 日消除后 , 在糖峰范围内测不到蛋 白的分布 (图 4 ) , 多糖与蛋
白确以对碱不稳定的 。一糖昔链相联 。
取 S 一 180 肿瘤细胞进行常规培养 , 达对数生长期时使用 , 临用前将细胞液稀释成 2 . 5
X l护 个 /m L , 取 96 孔板 , 每孔加 。 . l m L S 一 1 8 0 肿瘤细胞悬液 , 再加不同浓度 ( 1 2 0。 , 60 0 ,
3 0 0
,
1 5 0拜g / m L ) 的 F p Z 多糖液 , 于 3 7℃ , 5% CO Z 中培养 , 分别于不同时间 ( 4 8 、 9 6 、
1 4 h) 用中性红摄入法测定细胞存活率 。
表 1 F P Z 对 S 一 1 80 肿瘤细胞的体外作用
肿瘤细胞存活率
多搪浓度
拼g / m l
生理盐水
1 2 0 0
6 0 0
3 0 0
1 5 0
1 4 4h
0
.
2 6士 0 . 0 5
0
.
3 1士 0 . 0 2
0
.
2 8士 0 . 0 1
0
.
2 4士 0 . 0 4
0
.
2 1士 0 . 0 2
0
.
1 9士 0 . 0 3
0
.
2 4士 0 . 0 8
0
.
2 1士 0 . 0 5
0
.
2 1士 0 . 0 2
0
.
2 3士 0 . 0 3
0
.
0 8士 0 . 0 2
0
.
0 8士 0 . 0 1
0
.
0 9士 0 . 0 3
0
.
0 8士 0 . 0 1
0
.
0 8士 0 . 0 4
实验结果表明 , 离体条件下 , F P : 对 S 一 1 80 肿瘤细胞无直接杀伤作用 。 日本静 冈大学
教授水野卓从红缘层孔菌子实体中分离出的以 日(1 ~ 3 ) G L 。 为主链 , 并带有 日(1 ” 6 ) G cL
分支的葡聚糖 , 该多糖对小鼠移植性肿瘤 S 一 1 80 的抑瘤率达 1 0 % 〔的 , 和上述多糖一样 ,
F P : 对 S 一 1 80 肿瘤细胞无直接毒性 , 它也将通过激活动物机体的免疫功能 , 激活巨 噬细
胞 , 杀伤细胞 , 杀伤性 T 细胞的活性 , 而起到对肿瘤细胞攻击的作用 。
参 考 文 献
张丽萍 . 红缘层孔菌多搪的研究 1一F P I 、 F P : 的分离与鉴定 . 东北师大学报 19 8 7 , 4 : 86 ~ 91
张丽萍等 . 红缘层孔菌多搪对小鼠核酸蛋白质合成的影响 . 东北师大学报 , 19 93 , 2 : 1 04 ~ 10 8
梁忠岩 , 张翼伸 . 斜顶菌 中水溶性多搪的研究 . 高等学校化学学报 , 19 8 3 , 3 : 3 64 ~ 3 69
梁忠岩 , 张翼伸 . 斜顶菌水溶性多糖的构象研究 . 生物化学杂志 , 19 8 5 . 5 : 1 41 ~ 1 47
S h
u q u im BO
e t a l
.
B e h a
v i o u o f
s e l e
r o g l
u e a n I n a q u e o u s s o l
u t i o n e o n t a i n i
n g s od i
u m h y d
r o x id e
.
I
n t J B i o l M
a e r o-
m o l
.
1 9 8 7
, 19 : 1 53 ~ 15 7
T a k a
s
h i M i
z u n o e t a l
.
S t u d i e
s o n H o
s t 一m e d i a t e d A
n t i t u m o
r
P o ly
s a e e h a
r id
e s .
P
a r t V
.
C h e rn
l e a l S t
r u e t u r e a n d
A n t i r u m o
r
A e t i v i t y o f A w a t
e r 一 s o l u b l e G l
u e a n is o l a t
e
d f
r o m T
s u g a s a r u n o k o
s
h i ka k e
, t h
e
f r
u i t b司 y o f F o m i -
t o p s i s p i n i e o l a
.
B u l l F a e A g
r
S h i
z u o k a U n i v
.
N o
.
3 2
, 2 9一 4 0
St ud y on St r u ct ur al D et er m in at i on and Ant i
一
t u m or
A et iv it y o fFo m e sP in i c ol aP ol y s a c ch rd i e sP F
z
Z h an gL ip in g M i a oh C un yn aZ h n a gB in gn e x
(D ep a
rt rn
ent o fB i ol o g y
,
N o
r t h e a
s t N o r m a l U n i v
e r s i t y , C h a n g e h u n
, 13 0 0 2 4 )
A b s t r a e t A g l u e a n h a s b e e n is o l a t e d f r o m P in i o o l a F o m e s f r u i t b o d i e s
.
I t s m o l e e u l a r
w e i g h t w a s a b o u t 2 1 4 K d
. 〔a 〕扩= 4 9 0 , 刀s P = 0 . 2 2 , F P : e o n t a i n 2 . 8% p r o t e i n . C o m p l e x f o r -
m a t io n w i t h C o n g o R e d a n d e f f e e t s o f e o n e e n t r a t i o n s o f N a O H o n i n d i e a t e d e h a r a e t e r o f
m a i n e h a i n e o m p o s e d o f 日( l ~ 3 ) G L e . T h e s t r u e t u r e o f F P : w a s d e t e r m i n e d b y p e r i o d a t e
o x id a t i o n
,
Sm it h d e g r a t i o n
,
m e t h y l a t io n
,
1
.
R e t e
.
T h e m a i n e h a i n o f F P
Z 15 e o m P o s e d
o f 日( l ~ 3 ) 1i n k e d G L e , S i n g l e 日( 1~ 6 ) l i n k e d G L 。 a t t a e h e d , o n a v e r a g e , t o e v e r y t h r e e
s u g a r r e s id u e o f t h e m a i n e h a in
.
T h e p o l y s a e e h r id e s e o m b i n e p r o t e i n b y f o r m i n g o
一
g l y e o
-
s id i e b o n d s t h r o u g h T h r a n d S e r
,
F P : h a s b e e n e x a m i n e d b y 件e l im a t i o n . F P : w a s n o t
f o u n d t h e a n t i t u m o r a e t i v i t y o n t h e S a r e o m a 1 8 0 e e l l s
.
K e y w o r d s
e h a i n
f o m e s P i n i e o l a P o l y s a e e h r id e s F P
: ; a n t i t u m o r ; s t r u e t u r e o f P o l y s a e e h r id e
(上接 第 70 页 )
R e s e a r c h o n t h e E x t e r n a l B a e t e r i o s t a s i s C a u s e d b y t h e F e r m e n
-
t a t i v e P r o d u c t s o f G l o e o s t e ur m I
n e a rn a t u m 5
.
I T 口 E T Im a i
L a n H e n g e h u n T a i L o n g j i e L i Z h i p i n g
( cS h
o o l o f L i f e cS i e n e e s
,
N o rt h
e a s t N o
r
m a l U n i v e
r s i t y , C h a n g e h u n
, 13 00 2 4 )
A b s t r a e t B y m e a n s o f t h e e u P a n d P l a t e
,
t h e e x t e r m a l b a e t e r i o s t a s is o f f e r m e n t a t i v e
p r o d u e t s o f G l o
e o s t e er u m i n
c a r n a t u n o n 5 15 k i n d s o f b a e t e r i a f r o m h u m a n b o d y w a s a n a l
-
y s e d
.
T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e f e r m e n t a t i v e p r l d u e t s
,
f r o m t h e e o n e e n t r a t i o n o f o r i g i
-
n a l l i q u i d t o 2 5%
, a l l d e m o n s t r a t e d v e r y o b v i o u s b a 。 t e r io s t a t i。 a e t io n
.
K e y w o r d s g l o e o s t e r e u m i n e a r n a t u m 5
.
I t o e t I m a i ; f e r m e n t a t i v e p r o d u e t ; b a e t e r i o s t a t i e
a C t 1 0 n
78