全 文 ：※工艺技术 食品科学 2008, Vol.29, No.09 277
灰树花多糖的超滤分离及免疫活性研究
杨 阳 1,2，刘承初 1，贾 薇 2，刘艳芳 2，杨 炎 2，张劲松 2，周昌艳 2,*
(1.上海海洋大学食品学院，上海 200090；上海农业科学院食用菌研究所，上海 201106)
摘 要：目的：从灰树花子实体中提取分离灰树花多糖并进行免疫活性检测。方法：热水和稀碱提取灰树花子
实体多糖后，利用乙醇沉淀法和超滤法获取灰树花水溶性及碱溶性子实体多糖，通过小鼠脾淋巴细胞转化增殖实验
检测免疫活性。结果：利用乙醇沉淀法获得水溶性及碱溶性多糖两个组分，得率分别为 6.67% 和 5.88%，利用超
滤法获得分子量范围分别为大于 1000kD、100 ～1000kD 以及 10 ～100kD 的共六个灰树花子实体多糖组分，其中
水溶性多糖组分 GFP100、GFP10 和 GFP1 的得率分别为 3.99%、0.51% 和 3.94%，碱溶性多糖组分 GFAP100、
GFAP10 和 GFAP1 的得率分别为 2.42%、2.32% 和 3.04%，利用超滤法获得的六个多糖组分均显示了显著的促进小
鼠脾淋巴细胞转化增殖作用。结论：超滤法应用于灰树花子实体多糖的分离要优于传统乙醇沉淀法，该法工艺简
便，多糖得率更高，且不损害其活性。
关键词：灰树花多糖；超滤；分子量；免疫活性
Study on Ultrafiltration Separation and Immunocompetence of Polysaccharides from Grifola frondosa
YANG Yang1,2，LIU Cheng-chu1，JIA Wei2，LIU Yan-fang2，YANG Yan2，ZHANG Jin-song2，ZHOU Chang-yan2,*
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 200090, China；
2. Edible Fungi Institute, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106, China)
Abstract：Objective: To separate Grifola frondosa fruit body polysaccharide by ethanol precipitation and ultrofiltrationr (UF)
and investigate the effects of Grifola frondosa fruit body polysaccharides on immune function of mice. Methods: Water-soluble
polysaccharides were extracted from Grifola frondosa fruit body with hot water and then the residue was further extracted with
dilute sodium hydroxid to obtain alkali-soluble polysaccharides. Both the two polysaccharides were precipitated out from the
extracting solutions by ethanol, and they were further separated by UF according to their molecular weights (> 1000 kD, 100 to
1000 kD and 10 to 100 kD) respectively. The immunocompetences of different polysaccharide components derived from
Grifola frondosa were investigated using immunocyte cultivation technique in vitro. Results: The yield of water-soluble
polysaccharides is 6.67%, and the yield of alkali-soluble polysaccharides is 5.88%. The yields of water-soluble polysaccharides
with molecular weight more than 1000 kD (GFP100) , 100 to 1000 kD (GFP10) and 10 to 100 kD (GFP1) are 3.99%,0.51% and
3.94%, respectively, and the yields of alkali-soluble polysaccharides with molecular weight more than 1000 kD ( GFAP100),
100 to 1000 kD (GFAP10) and 10 to 100 kD (GFAP1) are 2.42%, 2.32% and 3.04%, respectively. All the polysaccharide
components separated by UF can significantly increase the proliferation rate of mouse spleen lymphocytes. Conclusion: The
ultrafiltration separation of Grifola frondosa polysaccharides is simple and feasible.
Key words：Grifola frondosa polysaccharides；ultrafiltration；molecular weight；immunocompetence
中图分类号：TS201 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2008)09-0277-04
收稿日期：2008-05-30
基金项目：科技部农转资金项目(2006GB2C000090)
作者简介：杨阳(1982-)，男，硕士，研究方向为天然活性物质及其开发。E-mail：yy_sfu@yahoo.cn
* 通讯作者：周昌艳(1969-)，女，副研究员，硕士，研究方向为药用真菌及应用。E-mail：changyanz@sina.com.cn
灰树花 ( G r i f o l a f r o n d o s a ) 隶属于层菌纲
(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophomles)、多孔菌
科(Polyporaceae)、树花属，是一种药、食兼用的珍稀
食用菌。经过大量的化学和药理分析发现，灰树花多糖
是一种有效的生物免疫调节剂，其具有明显的抗肿瘤、
抗 H I V 病毒、改善免疫系统功能、调节血糖、血脂及
胆固醇水平、降血压等作用，对防止癌细胞的生成和转
移、艾滋病、高血压、肥胖证、糖尿病以及免疫系统
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近年研究表明，灰树花多糖的生理活性大小与其多
糖结构、分子量、溶解度等因素密切相关。而提取工
艺的不同，造成了获得的灰树花多糖在结构、分子量
大小以及分支度等方面具有较大差异，抗肿瘤以及免疫
增强等生理活性也存在较大差别。因此，采用何种提
取分离办法，直接影响了灰树花药用价值的开发和利
用。目前对灰树花多糖的提取多采用热水提取、醇析
的工艺，该工序繁杂，不易获得多糖粗品，且得糖率
低，难以工业化应用。超滤是一种新型膜分离技术，
利用不同的孔径截留不同分子量物质，不仅具有常温操
作、无相态变化，可以防止杂菌污染和热敏性物质失
活等特点，而且比上述方法更适于工业化生产。超滤
法应用于多糖的提取分离，具有比传统工艺分离效率
高，避免活性物质失活等优势，已成为活性多糖的重
要研究手段。
本研究将用传统的乙醇沉淀法以及利用不同截留分
子量的中空纤维超滤膜联用的超滤法法对灰树花子实体
多糖进行提取分离，并考察其促进小鼠淋巴细胞转化增
殖的作用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
灰树花子实体干品取自浙江庆元食用菌研究所。
PMI 1640 培养基、DMEM 培养基、440μg/ml 谷氨
酰胺、1 0% 胎牛血清 GIBCO 公司；100μg/ml 的链
霉素、100IU/ml 的青霉素 Amersco 公司；二甲基亚砜
(DMSO)、PHA Sigma 公司；显色剂 Alamar Blue
Biosource 公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 实验动物
C578L 小鼠，8 周龄，体重 20～25g，购自国家实
验动物中心上海分中心。
1.3 仪器与设备
QuiStand Benchtop Systems 超滤设备、中空纤维
柱(1000、100、10kD) Amersham 公司；BC-R2001 型
旋转蒸发仪 上海贝凯生物化工设备有限公司；冷冻干
燥机 Thermo Savant 公司；台式冷冻离心机 SORVALL
公司；Synergy 多功能酶标仪 基因有限公司。
1.4 方法
1.4.1 灰树花多糖水提液的制备
灰树花干子实体，粉碎机粉碎，95% 乙醇浸泡 48h
脱脂，挥干乙醇后料水比 1:10 沸水提取 3 次，每次 2h，
合并 3 次提取液，过滤，得水溶性灰树花粗多糖提取
液，滤渣保留备用。
1.2.2 灰树花多糖碱提液的制备
水提后的灰树花子实体残渣，烘箱烘干，料液比
1:5 ，4% 稀碱(NaOH)溶液室温浸泡提取 2 次，每次 24h，
合并提取液，过滤，得碱溶性灰树花粗多糖提取液。
1.4.3 乙醇沉淀法工艺流程
灰树花粗多糖提取液(碱溶性粗多糖提取液需预先用
醋酸中和至 pH7.0)离心取上清液，浓缩后，加入 4 倍 95%
乙醇沉淀，静置 2 4 h，离心收集沉淀部分，少量热水
溶解沉淀，水浴挥去乙醇后冷冻干燥，得粗多糖干制
品 。
1.4.4 超滤法工艺流程
采用截留分子量分别为 1000、100 和 10kD 的中空纤
维超滤膜三个组件联用的办法。灰树花粗多糖提取液
(多糖碱提液过滤前需预先用醋酸中和至 pH7.0)离心取上
清液，上清液在室温、压力 0.2MPa 条件下依次进行连
续超滤处理，得到三部分不同分子量范围的多糖截留
液，截留液经浓缩、冷冻干燥得粗多糖干制品。流程
如 下 ：
1.4.5 淋巴细胞增殖实验供试样品的配制
待测的样品透析、冷冻干燥后，精确称取多糖样
品于灭过菌的 Eppendorf 管中，用磷酸缓冲液生理盐液
(PBS)配制成浓度 10mg/ml。充分溶解然后以 15000r/min
离心 30min，无菌条件下转移至新的无菌 Eppendorf 管
中，将样品稀释成浓度为 5、2、0 . 5 m g / m l 待用。
1.4.6 小鼠淋巴细胞的制备
选取 8～10 周龄，体重 28 ± 1g 的 Balb/C 小鼠颈椎
脱臼处死，取脾脏，用 P B S 冲洗 3～4 次。将脾脏磨
碎后过 100 目筛，过筛后的混悬液以 400r/min 离心 6min。
吸去上清液，沉淀中按每只小鼠 1.5ml 的量加入氯化铵
溶液，反复冲打，静置 10min 后，加 PBS 至 50ml，然
后以 300r/min 离心 6min，吸去上清液，加 PBS 缓冲液
冲洗并离心两次后，吸去上清液，加入培养基混匀，
用细胞计数仪计数并稀释成 2 × 106 个 /ml 细胞液备用。
1.4.7 淋巴细胞增殖率的测定
将 2 × 106 个 /ml淋巴细胞悬浮液加至 96孔板中，每
孔加 180ml，同时加入 20μl 样品液，以 20ml PBS 和 20ml
60mg/ml 的 PHA 溶液分别作阴、阳性对照。于 37℃、
含 5% 的 CO2 条件下培养 3d，加入 20ml Alamar Blue 试
离心 ，
取上清液 1000kD
超滤膜
透过液 1
冷冻干燥
1000kD
超滤膜
1000kD
超滤膜
粗多糖
提取液
透过液 2
冷冻干燥 冷冻干燥
GFP100/GFAP100 GFP10/GFAP10 GFP1/GFAP1
截留液 3截留液 2截留液 1
→ →→
→→→
功能紊乱都有一定的疗效，且无任何毒副作用[1 -4 ]。
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剂，再培养，加 Alamar Blue 试剂前及变色后分别用
ELISA 自动读板仪测定波长 570nm和 600nm处的吸光度，
然后根据 Alamar Blue 试剂的公式计算各种样品对淋巴细
胞增殖率。计算公式为：
1.4.8 分析测定
总糖含量测定：苯酚 - 硫酸法；还原糖含量测定：
DNS 法；蛋白质含量测定：BCA 蛋白质试剂盒定量测
定法；多糖含量采用总糖含量减去还原糖含量来定量。
2 结果与分析
2.1 超滤法与乙醇沉淀法提取分离灰树花多糖的比较
本研究利用乙醇沉淀法获得水溶性多糖组分 GFP 和
碱溶性多糖组分 GFAP，利用不同分子量的中空纤维超
滤膜三个组件联用的超滤法获得了三部分水溶性灰树花
多糖 GFP100(分子量大于 1000kD)、GFP10(分子量 100～
1000kD)、GFP1(分子量 10～100kD)及三部分碱溶性灰树
花多糖 GFAP100(分子量大于 1000kD)、GFAP10(分子量
100～1000kD)、GFAP1(分子量 10～100kD)，测定各多
糖组分的总糖、还原糖、蛋白质含量并计算得率，结
果如表 1 、2 所示。
表1 乙醇沉淀法和超滤法提取分离水溶性灰树花子实体多糖的比较结果
Table 1 Separation results of water-soluble polysaccharides by
ethanol precipitation and ultrofiltrationr (UF)
本研究采用超滤法进行多糖的分级分离，多糖的总
得率达到了 16.2%，与采用传统的乙醇沉淀法相比(得率
为 12.5%)具有更显著的目标产物分离能力。从多糖含量
来看，超滤法得到的水提多糖和碱提多糖各组分均显示
了较高的多糖含量，其中水溶性多糖中组分 GFP1 多糖
含量最高，达到了 45.0%，碱溶性多糖中组分 GFAP100
多糖含量也达到了 3 2 %，这表明，采用超滤法提取分
离灰树花子实体多糖不仅切实可行，且优于传统的多糖
提取分离方法。
2.2 不同分子量的灰树花子实体多糖质量分布情况考察
结果
本研究利用不同截留分子量的中空纤维超滤膜，考
察了灰树花子实体多糖在大于 1000kD、100～1000kD 以
及 10～100kD 这三个分子量范围内的质量分布情况，结
果如图 1 所示。
图1 不同分子量的灰树花子实体多糖质量分布情况
Fig.1 Molecular weight distribution of Grifola frondosa polysac-
charide
据文献报道，分子量 10kD 以下的灰树花多糖没有
活性[5]，因此本实验并没有将分子量小于 10kD 的灰树花
多糖作为考察目标。由图 1 可知，通过超滤得到的水提
和碱提灰树花子实体多糖在大于1000kD、100～1000kD以
及 10～100kD 这三个分子量范围内的质量比例约为 2:1:2。
其中分子量 10～100kD 的多糖组分得率最高，为 6.98%，
分子量范围为 100～1000kD 的多糖组分得率最低，仅为
2.83%。
2.3 不同分子量的灰树花多糖对促进小鼠脾淋巴细胞转
化增殖的影响
近年来大量研究表明多糖的药理活性与其初级结
构、高级结构、分子量、溶解度、黏度有着密切的
关系，而多糖分子的多级结构与其分子量又有着直接的
关系[6]。本实验以促进小鼠淋巴细胞的转化增值作用为
依据，考察了不同分子量范围的各超滤多糖组分对促进
免疫功能的影响，结果如图 2 所示。图 2 表明，各超
滤多糖组分在浓度 50、200 和 500mg/ml 时均具有显著的
促进小鼠脾淋巴细胞转化增殖作用。从多糖溶解性质上
来看，水溶性子实体多糖对小鼠脾淋巴细胞的转化增殖
作用要略高于碱溶性子实体多糖，其中分子量范围为
100～1000kD的多糖组分GFP10在浓度50mg/ml时增殖作
用最强，为 338.8%。从多糖分子量上来看，分子量范
117216 × A570(nm样品)－ 80586 × A600(nm样品)
117216×A570(nm对照)－ 80586×A600(nm对照)
淋巴细胞增殖率(%)= × 100
注：以上数据为三次重复实验平均值。下同。
样品编号 得率(%)
总糖含量
(%)
还原糖含量
(%)
多糖含量
(%)
蛋白质含量
(%)
GFP100 3.99 47.2 2.87 44.3 31.4
GFP10 0.51 22.9 2.2 20.7 30.3
GFP1 3.94 47.9 2.87 45.0 45.2
GFP 6.67 38.97 8.71 30.26 47.78
12
10
8
6
4
2
0
分子量大
于1000kD
得
率
(%
)
子实体多糖
分子量100
～1000kD
分子量10
～100kD
6.41
2.83
6.98
表2 乙醇沉淀法和超滤法提取分离碱溶性灰树花子实体多糖的比较结果
Table 2 Separation results of alkali-soluble polysaccharides by
ethanol precipitation and ultrofiltrationr (UF)
样品编号 得率(%)
总糖含量
(%)
还原糖含量
(%)
多糖含量
(%)
蛋白质含量
(%)
GFAP100 2.42 34.2 2.22 32.0 27.3
GFAP10 2.32 32.9 1.94 31.0 17.0
GFAP1 3.04 16.5 1.99 14.51 34.8
GFAP 5.88 41.50 5.72 35.78 13.0
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围100～1000kD的多糖组分GFP10和GFAP10在水提和碱
提多糖中增殖作用分别最强，分子量范围 10 ～100kD 的
多糖组分 GFP1 和 GFAP1 在水提和碱提多糖中增殖作用
分别次之，分子量大于 1000kD 的多糖组分 GFP100 和
GFAP100 在水提和碱提多糖中增殖作用则分别最低。这
表明，灰树花子实体多糖的活性部位主要位于分子量
100～1000kD 范围之间。
图2 灰树花超滤多糖各组分对脾淋巴细胞的增殖作用
Fig.2 Proliferation on mouse spleen lymphocytes effects of
Grifola frondosa polysaccharides
3 讨 论
超滤膜具有不对称微孔结构，在分离过程中大分子
溶质和微粒随溶液切向流经膜表面，小分子物质和溶剂
则在压力驱动下穿过致密层上的微孔而进入膜的另一
侧，因而超滤膜可以长期连续使用并保持较恒定的产量
和分离效果，且在相当低的压力差下仍具有高流通率，
将超滤技术应用于多糖的提取分离研究，具有分离效率
高、能耗低、设备简单、可连续生产、无污染等优
点，更适于工业化生产和大规模临床应用。从文献报
道来看，目前获得的活性灰树花多糖均为 β- 葡聚糖，分
子量从几万到几百万不等，且活性差异很大，这可能
与选取灰树花的不同原料来源以及不同的提取分离方法
有关。灰树花多糖主要存在于子实体细胞壁，通常采
用热水、酸、碱浸提法，但酸法易导致糖链降解。本
研究在多糖超滤提取工艺中采用热水和稀碱两种方式结
合提取后，利用不同截留分子量的中空纤维超滤膜组件
作为分离介质，过滤时不容易产生浓差极化，不仅提
高了过滤效果，且具有同时进行脱盐与浓缩的作用，避
免了传统的有机溶剂法试剂残留等问题。此外，对灰
树花多糖的纯化，实质是获得一定分子量范围的单一组
分，本研究通过超滤法对灰树花多糖按分子量范围进行
分级分离，有利于减少多糖的后续纯化负担，为获取
不同的活性部位提供了条件。
免疫活性是灰树花多糖最重要的生物活性之一，
而有效获取多糖组分且不损伤其活性的提取工艺，是
实现灰树花药理价值的重要途径。 目前众多研究者已探
索出多种成功提取灰树花多糖的办法，但主要都集中
于实验室制备，未能使其药理价值发挥更大的作用。
本研究通过超滤法提取分离灰树花多糖， 并通过小鼠脾
淋巴细胞转化增殖实验证明其生物活性得到了有效保
留，这表明，超滤法是实现灰树花多糖大规模批量制
备的可行方式之一，也为其工业化生产提供了理论依
据和工艺参考。
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450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
对照 GFP100 GFP10 GFP1 GFAP100 GFAP10 GFAP1 PHA
脾
淋
巴
细
胞
增
值
率
(%
)
样品
50μg/ml
200μg/ml
500μg/ml
60μg/ml