全 文 ：尹尚军 ,陈引伟 ,汪财生 ,等.利用响应曲面法优化乙醇提取红山药色素工艺条件 [ J] .江苏农业科学 , 2011, 39(2):390-395.
利用响应曲面法优化乙醇提取红山药色素工艺条件
尹尚军 , 陈引伟 , 汪财生 , 刘丽平 , 章洁妮
(浙江万里学院生物与环境学院 ,浙江宁波 315100)
　　摘要:通过红山药色素溶剂提取筛选 , 运用 Box-Bebnken响应曲面设计法 , 以乙醇浓度 、液料比 、溶剂 pH值 、温
度为自变量 , 以色素提取液的 D
460 nm值为指标 , RSM分析法优化乙醇提取红山药色素工艺 ,并对红山药色素粗品进行
化学成分初步鉴定。结果表明:乙醇为红山药色素提取最佳溶剂。乙醇法提取最佳工艺条件为:乙醇体积分数 60%,
液料比 10mL∶1 g, pH值 3.08, 温度为 79.0 ℃, 此时红山药色素粗品得率为(30.24±0.26)%, 一次性提取率达
72.63%, 色价 39.4。化学成分初步鉴定表明色素粗品中主要含有黄酮类化合物。
　　关键词:红山药;色素;提取;响应面分析;黄酮类化合物
　　中图分类号:TS264.4　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2011)02-0390-06
(上接第 389页)
毒 ,溶剂回收处理简单 、无残留 ,萃取后的药材残渣性状基本
无变化 ,对药材中其他成分破坏较少 。但因系统需高压操作 ,
对仪器要求高 ,成本亦高 。相对而言 ,水蒸气蒸馏工艺简单 ,
成本低 ,但提取率也相对较低 (1.59%),是超临界 CO2萃取
得率的 61.15%。
参考文献:
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究 [ J] .中国粮油学报 , 2008, 23(4):157-159.
　　自从 19世纪中期第一个人工合成有机色素问世以来 ,合
成色素被大量应用于食品工业中 。自 20世纪 70年代开始 ,
由于合成色素的安全性受到怀疑 ,并确认部分合成色素具有
潜在的致畸致癌及其他毒副作用 ,很多品种相继被禁止使用 ,
允许使用的品种 、用量及使用范围受到了严格的限制 [ 1-2 ] 。
为此 ,寻找具有一定药物疗效和保健功能的天然色素资源是
当今发展趋势 。
红山药为薯蓣科(Dioscoreaceae)薯蓣属(DioscoreaL.)植
物中的薯莨 (DioscoreacirrhosaLout.)野生种的红肉品种群 ,
分布于云南 、浙江 、福建等一带山区 ,当地俗称 “红山芋 ” 、“红
孩儿 ”。其块茎形状似由大小不一的不规则球状串连起来的
“糖葫芦 ”,表皮棕黑色 ,断面深橙红色 ,味苦极涩 ,入药具有
活血止血、收缩子宫 、抗菌等多种功效 [ 3] 。笔者对红山药初
步研究发现 ,其富含黄色素 、薯蓣皂苷 、氨基酸 、鞣质及硒 、磷
等重要微量元素 ,集营养 、保健 、色素于一体的功能性疗补中
药材 ,尤其是红山药色泽鲜艳 ,色素含量极为丰富 。据文献资
料查证 ,有关红山药研究尚属萌芽阶段 。本试验旨在通过红
山药色素提取溶剂选择 ,在单因素提取试验基础上 ,采用 4因
素 3水平的响应曲面分析法 ,用回归分析法优化溶剂浸提法
提取红山药色素的工艺条件 ,为该天然色素开发及其生产应
收稿日期:2010-10-22
作者简介:尹尚军(1968—), 女 ,副教授 , 研究方向为植物生理生化
分析。
通信作者:汪财生 ,高级实验师 , 主要从事功能性食品开发研究。
Tel:(0574)88222232;E-mail:wangcaisheng@zwu.edu.cn。
用提供参考 。
1　材料与方法
1.1　材料和试剂
试验用红山药为当年 11月份采收的新鲜野生红山药 ,收
购于浙江省台州市杜桥镇农贸市场 。选择新鲜无腐烂根状
茎 ,洗净 ,去皮后切成 3 ～ 5 mm的薄片 , 60 ℃下烘干 ,粉碎 ,过
80目筛后保存于二氧化硅干燥器中备用 。
盐酸、乙酸 、乙醇 、丙酮 、乙醚 、石油醚 、乙酸铅 、氯化亚铁
等试剂均为分析纯 。
1.2　仪器与设备
S53 /54紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司生
产), AB-L分析天平(梅特勒 -托利多仪器有限公司生产),
DZF-6021型真空干燥箱 (上海谊恒实验仪器有限公司生
产), pH计(梅特勒 -托利多仪器有限公司生产)。
1.3　溶剂选择及特征光谱扫描
准确称取红山药粉末(1.00 g)8份 ,分别加入 0.1%盐酸
(V/V)、0.2%乙酸(V/V)、95%乙醇(V/V)、10 g/L柠檬酸、丙
酮、乙醚 、蒸馏水 、石油醚溶剂 50 mL,常温振荡密闭浸提 1h,
4 000r/min离心 10min,上清液目测对比观察 ,并于 300 ～
700nm波长下扫描确定特征吸收波长 ,选取最佳溶剂 。
1.4　工艺流程
原料※预处理※红山药粉末※溶剂密闭浸提※抽滤※提
取液※浓缩※色素浓缩液※真空干燥※色素粗品 。
1.5　试验设计
准确称取等量红山药粉末若干份 ,按上述工艺流程分别
—390— 江苏农业科学　2011年第 39卷第 2期
DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2011.02.024
对影响乙醇法提取的条件即乙醇浓度 、温度 、料液比 、pH值 、
时间进行单因素试验 ,以不同浸提条件下提取液最大波长下
测定吸光值为响应值 ,综合单因素影响试验结果 ,并根据 Box
-Benhnken的中心组合试验设计原理 [ 4] ,设计响应面分析法
优化乙醇法提取条件 ,再借助试验设计软件 DesignExpert
(7.1.3版),采用响应面法的中心组合设计 (CentralCom-
positeDesign, CCD)考察乙醇法提取中各因素对红山药色素
提取效果的影响 ,并进行工艺优化 。
1.6　色素色价 、得率分析
乙醇法提取响应面优化条件下进行重复试验 ,所得提取
液于 0.1 MPa、60 ℃下真空浓缩 ,喷雾干燥得粗品色素粉末 。
色素质量的纯度用色素色价表示 ,色价计算公式为:E=D×
f/(100m)[ 5 ] 。式中 E为色价值 , D为溶液在最大吸收波长处
的吸光度值 , f为溶液稀释倍数 , m为样品质量 。色素样品得
率计算公式为:样品得率 =(色素粗品质量 /红山药粉末质
量)×100% 。
1.7　色素化学成分初步鉴定 [ 6 ]
1.7.1　盐酸 -镁粉反应　取乙醇溶解的红山药色素粗品溶
解液 5mL,加入少许镁粉 ,振荡后再加入 2滴 36%盐酸 ,观察
颜色变化。
1.7.2　中性醋酸铅反应 　取乙醇溶解的红山药色素粗品溶
解液 5mL,逐渐滴加新配制的饱和中性醋酸铅溶液 ,观察颜
色变化 。
1.7.3　氯化亚铁呈色反应　取乙醇溶解的红山药色素粗品
溶解液 5mL,加入 1% FeCl2溶液 1 ～ 2滴 ,振荡后观察其颜
色变化 。
1.7.4　NaOH溶液反应　取乙醇溶解的红山药色素粗品溶
解液 5mL,加入 10%NaOH溶液 1 ～ 2滴 ,振荡后观察其颜色
变化 。
1.7.5　紫外扫描　取上述红山药色素粗品粉末少许分别用
水及乙醇溶解后 , 3 000 r/min离心 10 min,于 200 ～ 700nm下
紫外可见分光光度计上扫描鉴定 。
2　结果与分析
2.1　提取溶剂选择与特征吸收波长扫描
红山药粉末经各种不同极性的提取溶剂浸提后 ,上清液
于紫外分光光度计 300 ～ 700 nm波长下扫描结果如图 1所
示 。相同浸提条件下 ,有机溶剂乙醇浸提效果最好 ,蒸馏水 、
丙酮次之 ,其他溶剂效果不佳 。乙醇 、柠檬酸 、乙酸浸提红山
药色素呈现深浅不同的黄色 , 0.1%盐酸浸提后呈黑色沉淀 。
其中乙醇浸提液呈深褐黄色 ,颜色鲜艳 ,接近红山药颜色 ,因
此后续试验选用乙醇作提取溶剂 。从各溶剂浸提液扫描光谱
可知 ,红山药色素在可见光区 460 nm左右处有较大特征吸收
峰值 ,因此 ,后续试验吸光值均在 460 nm下检测 。
2.2　乙醇法提取单因素试验结果
2.2.1　乙醇浓度对红山药色素提取的影响　准确称取 6份
红山药粉末 ,每份 5g,置于 6个三角瓶中 ,按固液比 1 ∶10加
入 20% ～ 100%的不同浓度乙醇 , 0.1 moL/L盐酸调 pH值为
5, 50℃恒温水浴锅密闭振荡浸提 2 h,过滤 ,将滤液以相应的
溶剂定容至 1 000 mL容量瓶中 , 检测吸光值 D460 nm。结果
(图 2)表明 ,随着乙醇浓度提高 ,提取液吸光值升高 ,至 80%
乙醇浓度左右时基本趋于稳定 ,之后有平缓下降的趋势 。
2.2.2　料液比对红山药色素提取的影响　称取 9份红山药
样品 ,每份 5.000g,置于 6个三角瓶中 ,加入不同体积的 80%
乙醇 , 0.1moL/L盐酸调 pH值为 5, 50 ℃条件下恒温水浴锅
密闭振荡浸提 2h,过滤 ,将滤液定容至 1 000 mL,测其吸光度
D460 nm。结果(图 3)表明 ,料液比对色素提取液吸光值的影响
较大 ,随料液比增大提取液吸光值增高 ,至料液比 1 ∶8后变
化趋于稳定 ,色素不再溶出 。
2.2.3　温度对红山药色素提取的影响　称取 7份红山药样
品 ,每份 5.000g,置于 6个三角瓶中 ,按料液比 1 ∶8的比例
加入 80%乙醇 , 0.1 moL/L盐酸调 pH为 5,不同的温度条件
下恒温水浴锅密闭振荡浸提 2 h, 过滤 , 将滤液定容至
1 000mL,测其吸光度 D460 nm。结果(图 4)表明 ,色素的浸出
量随浸提温度升高而增加 ,在 50 ～ 70 ℃之间变化不大 ,考虑
到色素的稳定性以及乙醇的沸点较低 ,同时也考虑到节能 ,提
取温度选择不宜太高 。
2.2.4　浸提时间对红山药色素提取的影响　称取 7份红山
药样品 ,每份 5.000g,置于 6个三角瓶中 ,按料液比 1 ∶8的
比例加入 80%乙醇 , 0.1 moL/L盐酸调 pH为 5, 60 ℃条件下
恒温水浴锅密闭振荡浸提 1 ～ 4 h, 过滤 , 将滤液定容至
1 000mL,测其吸光度 D460 nm。图 5表明 ,色素的浸出量随浸
—391—尹尚军等:利用响应曲面法优化乙醇提取红山药色素工艺条件
提时间延长而有增加趋势 , 3 h后趋缓 。因此 ,考虑到工作效
率 ,浸提时间选择为 3h。
2.2.5　pH值对红山药色素提取的影响　称取 7份红山药样
品 ,每份 5.000 g,置于 6个三角瓶中 ,按料液比 1 ∶8加入
80%乙醇 ,以 0.1 moL/L盐酸与 0.1 moL/LNaOH调出不同
的 pH值 , 60 ℃条件下恒温水浴锅密闭振荡浸提 3 h,过滤 ,将
滤液定容至 1 000 mL,测其吸光度 D460 nm。溶液的 pH值对色
素提取的影响较大 ,色素溶液的吸光度随 pH值增大而减小
(图 6)。考虑到实际生产中提取时间较长 ,为防止色素溶液
在提取过程中的损失和原料的腐烂 ,提取液的酸碱度不能太
酸 , pH值应以 3 ～ 7为宜 。试验过程中发现色素液放置几个
小时后在酸性条件下颜色没有变化 ,呈均匀的橙黄色 。而在
碱性条件下颜色加深 ,变红色 ,透明度降低。 pH值升至 10左
右时有沉淀出现 ,提示该色素在酸性条件下相对稳定 。
2.3　响应面分析法优化乙醇法提取红山药色素参数
2.3.1　响应面分析因素水平的选取　响应面分析法已经广
泛应用于化学化工 、生物工程 、食品工业等方面 [7 ] 。为了在
现有试验的基础上寻找到整个区域上因素的最佳组合和响应
值的最优值 ,在单因素试验基础上采用响应面分析方法研究
几个因素间交互作用对乙醇浸提红山药色素的影响 ,以确定
最佳提取工艺参数 。考虑到工作效率及时间对其他因素影响
较小 ,因此 ,试验在 3 h提取条件下 ,选取乙醇浓度 、温度 、料
液比 、pH值 4因素 ,设计 4因素 3水平响应面分析方法 ,实际
考察的变量及其试验水平编码见表 1,响应值与自变量的关
系可用下列模型来表示:
y=β0 +∑ βixi+∑ βixi2 +∑ βijxixj (1)
其中 y为预测值 , β0为截留系数 , βi为线性项 , βi为二次项 , βij
为交互作用项 , xi和 xj为自变量 。
表 1　试验因素水平及其编码
变量 编码
编码水平
-1 0 1
乙醇浓度(%) x1 60 80 100
液料比(V/m) x2 6 8 10
pH值 x3 3 5 7
温度(℃) x4 40 60 80
　　每个试验组均设有 2个重复组 ,响应值取重复组的平均
值 ,采用 DesignExpert7.1.3软件对结果进行回归分析 ,以确
定公式(1)的各项系数 。
2.3.2　乙醇法提取红山药色素多元二次模型方程的建立及
方差分析　准确称取等份的红山药样品 ,根据 Box-Behnken
的中心组合设计原理设计 4因素 3水平的响应面分析试验
(Box, Behnken, 1960),其中包括析因试验设计 24个 , 4个中
心试验 ,平行试验 3次 。每份红山药样品 5.000 g,于三角瓶
中恒温水浴锅密闭振荡浸提 3 h, 过滤 , 将滤液定容至
1 000mL,测其吸光度 D460 nm ,得 Box-Behnken试验设计结果
见表 2。通过 DesignExpert软件对表 2试验数据进行二次多
项回归拟合 ,获得 D460 nm值对 pH值 、温度 、料液比及乙醇浓度
的二次多项式回归拟合方程:
y=1.56-0.20x1 +0.14x2 -0.056x3 +0.12x4 -0.11x1 x2 -
0.11x1x3 +0.035x1x4 +0.013x2x3 -3.875 ×10-3 x2x4 +
0.048x3x4 -0.085x12 -0.061x22 +0.16x3 2 +0.18x42 (2)
式中 , y为红山药乙醇提取液 D460 nm预测值 , x1 、x2 、x3 、x4分别
为影响红山药色素提取的乙醇浓度、料液比 、pH值以及浸提
温度编码值 。方程中各项系数绝对值的大小直接反映了各因
素对色素提取液吸光值的影响程度 ,系数的正负反映了影响
的方向 。
　　由方程(2)的方差分析 (表 3)可见 ,所建立模型 P<
0.001 6 ,表明模型因素水平极显著 ,失拟值为 0.205 2(P>
0.05),由误差引起的失拟不显著 。模型确定系数为 0.861 5,
校正确定系数为 0.712 4 ,表明该模型方程因变量与全体自变
量间线性关系明显 ,模型的变异系数值为 8.39%,说明模型
精密度较好 。综合以上各参数表明该试验方法可靠 ,各因素
水平间设计合理 ,模型方程能较好地反映红山药色素提取液
D460 nm值与乙醇浓度 、液固比 、温度及 pH值之间的变化规律
关系 。因此可用该回归模型预测红山药乙醇法浸提液实际
D460 nm值结果 。
为检验方程的有效性 ,对红山药提取液吸光值的数学模型
进行方差分析 ,并对各因子的偏回归系数进行检验。回归方程
各项系数的方差分析表明(表 3),模型一次项乙醇浓度对红山
药色素提取液 D460 nm值线性和曲面效应极显著(P<0.001);一
次项料液比 、温度 ,温度二次项 pH值效应高度显著 (P<
—392— 江苏农业科学　2011年第 39卷第 2期
0.01);pH值二次项影响显著(P<0.05);pH值一次项影响不
显著 ,各因素交互项对响应值的影响不显著。表明各影响因素
对红山药色素提取液吸光值不是简单的线性关系 。
表 2　Box-Behnken设计及其试验结果
试验
编号 x1 x2 x3 x4
D460nm
实测值 预测值
1 60 6 5 60 1.41 1.36
2 100 6 5 60 1.15 1.19
3 60 10 5 60 1.80 1.87
4 100 10 5 60 1.09 1.25
5 80 8 3 40 1.82 1.89
6 80 8 7 40 1.76 1.68
7 80 8 3 80 1.85 2.04
8 80 8 7 80 1.98 2.02
9 60 8 5 40 1.88 1.78
10 100 8 5 40 1.37 1.31
11 60 8 5 80 2.05 1.95
12 100 8 5 80 1.68 1.62
13 80 6 3 60 1.62 1.59
14 80 10 3 60 1.90 1.84
15 80 6 7 60 1.55 1.45
16 80 10 7 60 1.89 1.76
17 60 8 3 60 1.80 1.78
18 100 8 3 60 1.75 1.60
19 60 8 7 60 1.69 1.89
20 100 8 7 60 1.21 1.28
21 80 6 5 40 1.29 1.42
22 80 10 5 40 1.67 1.71
23 80 6 5 80 1.66 1.67
24 80 10 5 80 2.02 1.94
25 80 8 5 60 1.63 1.56
26 80 8 5 60 1.65 1.56
27 80 8 5 60 1.50 1.56
28 80 8 5 60 1.48 1.56
2.3.3　响应曲面分析及优化工艺条件的确定　由表 3分析
表明 ,影响红山药色素提取液 D460 nm值在所选取各因素水平
范围内 ,按对结果影响由大到小排序为乙醇浓度 >料液比 >
温度 >pH值。根据回归方程(2)预测 4个因素对红山药色
素提取液 D460 nm的响应曲面图及等高图见图 7至图 12 , 6组
图直观地反映了各因素对响应值的影响 。
对模型方程解逆矩阵选择红山药色素乙醇法提取最佳工
艺条件为乙醇浓度 60.436 35%, 液料比 9.727 76 ∶1
(mL/g), pH值 3.079 34 ,温度 79.371 75℃,其理论预测红山
药色素提取液 D460 nm为 2.143 11。为检验响应曲面法所得结
果的可靠性 ,采用上述优化提取条件 ,考虑生产实际修正参
数:乙醇浓度 60%,液料比 10 ∶1(mL/g), pH值 3.08 ,温度为
79.0℃进行红山药色素重复提取 ,得色素提取液实际 D460 nm
为 2.155 ,与理论预测值 2.143 11很接近 。因此 ,基于响应面
法所得的优化提取工艺参数准确可靠 ,具有实用价值 。
表 3　响应面二次多项模型方差分析
变异源 平方和 自由度 均方 F值 P值
模型 1.55 14 0.11 5.78 0.001 6＊＊
x1 0.47 1 0.47 24.53 0.000 3＊＊＊
x2 0.24 1 0.24 12.34 0.003 8＊＊
x3 0.04 1 0.04 1.98 0.182 5
x4 0.18 1 0.18 9.15 0.009 7＊＊
x1x2 0.05 1 0.05 2.62 0.129 4
x1x3 0.05 1 0.05 2.42 0.143 7
x2x4 0.00 1 0.00 0.26 0.621 3
x2x3 0.00 1 0.00 0.04 0.851 1
x2x4 0.00 1 0.00 0.00 0.956 2
x
3
x
4 0.01 1 0.01 0.48 0.498 9
x12 0.04 1 0.04 2.28 0.155 3
x22 0.02 1 0.02 1.17 0.298 2
x32 0.15 1 0.15 7.86 0.014 9＊
x42 0.21 1 0.21 10.71 0.006 1＊＊
失拟项 0.23 10 0.02 2.91 0.205 2
误差项 0.02 3 0.01
总 和 1.80 27
确定系数=0.861 5;校正确定系数=0.712 4;变异系数=8.39%。
　　注:＊＊＊为差异极显著(P<0.001), ＊＊为差异高度显著(P<
0.01), ＊为差异显著(P<0.05)。
2.4　红山药色素质量分析及工艺评价
试验按上述响应面优化工艺重复提取 ,经真空浓缩后喷
雾干燥 ,得棕红色红山药色素粗产品 , 得率为 (30.24 ±
0.26)%,一次性提取率为 72.63%。该优化工艺较适合红山
药色素提取 ,并能较完全提取该类色素物质 ,色素粗品色价达
39.4。
2.5　色素化学成分初步鉴定
红山药色素粗品乙醇溶解液加入镁粉 -盐酸产生的气
泡 ,由黄色变为橙红色 。逐滴加入新配制的饱和中性醋酸铅
溶液 ,立即产生黄色沉淀 ,且沉淀量随着溶液量增多而增多 ,
—393—尹尚军等:利用响应曲面法优化乙醇提取红山药色素工艺条件
沉淀最后变为墨绿色 。滴 1% FeCl2溶液 1滴后 ,溶液由黄色
变为黑色。滴入 2滴 10% NaOH液 ,则观察到溶液明显加深
呈红棕色。综上所述 ,红山药粗品色素中含有酚类化合物与
FeCl3溶液反应显示出一定颜色 ,并在碱性条件下色素溶液加
深 。表明色素分子中主要含有黄酮类化合物 ,且结构中具有
酚羟基 。
从图 13紫外光谱扫描可看出 ,该色素在水中溶解度较
小 ,但乙醇与水溶液吸收图谱表现一致 ,而且产品成分比较复
杂 。其主要化学成分在紫外 280 ～ 300nm之间有个较强的吸
收带Ⅱ ,比较尖锐 , 340 ～ 380 nm之间有较弱的吸收带 Ⅰ ,可
见光区 460 nm左右有弱的吸收带 ,表明该化合物中含有 3个
或 3个以上共轭双键 [ 8 ] ,具有黄酮类化合物特征 ,并含有长共
—394— 江苏农业科学　2011年第 39卷第 2期
轭发色基团 ,使特征吸收带发生红移现象 。
3　结论与展望
红山药色素易溶于有机溶剂乙醇 、甲醇 、丙酮 ,少量溶于
水 ,难溶于乙醚及石油醚 。根据成分初步鉴定乙醇提取的红
山药色素粗品中主要含有黄酮类物质 。
通过采用中心组合设计试验和响应面分析分别表明乙醇
浓度 、液料比 、pH值及提取温度 4因素对红山药色素提取液
D460 nm值的影响 。乙醇法提取红山药色素工艺参数的回归方
程为:
y=1.56-0.20x1 +0.14x2 -0.056x3 +0.12x4 -0.11x1 x2 -
0.11x1x3 +0.035x1x4 +0.013x2x3 -3.875 ×10-3 x2x4 +
0.048x3x4 -0.085x12 -0.061x22 +0.16x3 2 +0.18x42
　　方差分析结果表明拟合检验极显著 , 决定系数达
0.861 5 ,该方程能较好地预测红山药色素乙醇提取液的
D460 nm值随各参数变化的规律 。
优化得到乙醇法提取红山药色素最佳工艺条件为:乙醇
浓度(V/V)60%,液料比 10 ∶1(mL/g), pH值 3.08,温度为
79.0℃。该工艺稳定且重复性较好 ,此条件下提取红山药色
素粗品得率为(30.24±0.26)%,一次性提取率达 72.63%。
红山药色素色泽鲜艳 ,含色素量高 ,主要化学成分具有一
定的保健及医药功能 ,并可作为食品添加剂 ,是一类值得开发
的天然色素 。
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