全 文 ：　收稿日期:2006-04-10(修改稿)
　作者简介:莫佳琳 ,女 , 1977年生;助理研究员 ,博士;研究方向:生物技术在制浆造纸中的应用。
E-mail:maggiemo@163.com
贝壳状革耳菌诱变提高产漆酶能力
及其生物漂白的研究
莫佳琳　付时雨　詹怀宇
(华南理工大学制浆造纸工程国家重点实验室 , 广东广州 , 510640)
摘　要:本研究从贝壳状革耳菌(Panus conchatus ,是一株具有选择性降解木素的白腐菌)菌株出发 ,通过原生质体融合和紫外诱变技术处理 ,
获得产漆酶酶活较高的诱变融合菌株 ,诱变株 28-7的漆酶酶活高峰达 17290 IU/L ,比原始菌的酶活高峰 2318 IU/ L提高约 7.5倍。诱变菌株
分泌的漆酶预处理荻苇浆 、麦草浆和芦苇浆 ,LQP浆和 OLQP浆的白度较未经处理的高 ,卡伯值下降 ,黏度变化不大。经过漆酶/介体生物处
理可提高纸浆的可漂性 ,对后续漂白有促进作用。实验结果初步证明 , 原生质体融合和紫外诱变技术可以作为改良白腐菌 Panus conchatus
的手段。
关键词:漆酶;原生质体融合;紫外诱变;酶活;生物漂白
中图分类号:Q55 文献标识码:A 文章编号:1000-6842(2006)04-0029-04
　　漆酶(p-diphenol:O2 oxidoreductase;EC 1.10.3.2)是
一种含铜的多酚氧化酶 ,它能氧化酚类和芳香类化合
物 ,将分子氧还原生成水[ 1] 。漆酶来源广泛 ,不同来源
的漆酶其氧化能力和反应性能有较大差别[ 2] 。目前认
为 ,真菌特别是白腐菌产生的漆酶降解木素效果最佳。
真菌漆酶具有广泛的底物作用范围 ,能氧化酚类和芳
香类化合物 ,在氧化还原介体存在的条件下 ,真菌漆酶
还能氧化一些非酚类和异生类物质[ 3] 。因此 ,漆酶在
木素降解 、生物制浆 、生物漂白 、催化合成 、有毒化合物
的生物消除等方面有重要的生产应用价值[ 4-5] ,成为酶
工程与环境保护交叉领域研究的热点。
贝壳状革耳菌(Panus conchatus)是一种降解木素
能力很强的白腐菌 ,其木素降解酶系主要是漆酶 ,所产
生的漆酶在助剂存在下能有效降解纸浆中的残余木
素[ 6] 。漆酶是重要的木素降解酶之一[ 7] ,近年来国内
外对不同来源的漆酶的研究很多 ,主要集中在优化菌
种的生理条件 ,提高其产漆酶的能力 ,如碳源 、氮源 、金
属离子 、诱导剂对漆酶产生的影响[ 8-10] 。随着遗传育
种技术的推广和深入 ,对漆酶的研究已经深入到细胞
工程方面 ,通过原生质体融合和紫外诱变技术 ,提高供
试菌发酵的效率 ,选育具有高产漆酶的菌种。
本课题通过对贝壳状革耳菌进行原生质体融合和
紫外诱变 ,实现基因重组 ,希望融合子和诱变株的性状
能够通过互补得到改善 ,使其产漆酶的能力得到更大
的提高 ,更好地应用于纸浆生物漂白。
1　材料与方法
1.1　供试菌
贝壳状革耳菌为本实验室选育的菌株。
1.2　培养基
完全培养基(CM):麦芽汁 ,琼脂粉 2%,自然 pH
值。
基本培养基(MM)(1L):10 g葡萄糖 ,0.01 g CaCl2 ,
2 g KH2PO4 , 0.25 g MgSO4 , 0.5 g 酒石酸胺 , 0.5 g
NH4NO3 ,10 mL 微量元素 。微量元素溶液配制比例为
(mg/L):CuSO4·5H2O 2 , FeSO4·7H2O 7.5 , MnSO4 2.5 ,
ZnSO4 2 ,CoCl2 3。
1.3　去壁酶
用质量分数为 1%的纤维素酶 、质量分数为 0.2%
的蜗牛酶和浓度为 0.6 mol/L 的 MgSO4 配制 ,过滤除
菌后使用 。
1.4　融合剂[ 11]
用渗透压稳定剂(0.6mol/L 的甘氨酸缓冲液 ,pH
值8.0)将聚乙二醇(PEG6000)配制成 30%的融合剂 ,
过滤除菌备用。
1.5　方法
1.5.1　漆酶活力测定[ 12]
用等体积 0.5 mmol/L 2 ,2-连氮-二(3-乙基苯并噻
29　Vol.21 , No.4 , 2006 Transactions of China Pulp and Paper
中　国　造　纸　学　报
唑-6-磺酸)(ABTS)溶液和酶液反应 ,测定反应前 3 min
内420 nm处吸光值的增加 ,每分钟使 1μmol ABTS 转化
所需的酶量为 1个活力单位(IU)。
1.5.2　变色圈法快速测酶活
在MM 琼脂培养基中加入 0.01%愈创木酚 ,制成
平板。将菌丝接入此平板培养 ,如长出的菌丝出现紫
红色的变色圈 ,说明该菌产漆酶 ,变色圈颜色越深 ,尺
寸越大 ,漆酶酶活越高。
1.5.3　菌丝体的培养
将供试菌在 CM培养基的试管斜面上 ,39℃培养 3
d ,接入装有 25 mL MM 培养基的三角瓶中 ,静置培养 4
d ,挑出菌丝体 ,过滤 ,用无菌水洗净 ,打碎 ,接入装有
100 mL MM 培养基的三角瓶中 , 39℃下振荡培养(135
r/min)24 h ,过滤 ,用无菌水和 0.7 mol/L 盐水洗净备
用。
1.5.4　原生质体的制备和融合
将混合酶液(质量分数 1%的纤维素酶+质量分
数0.2%的蜗牛酶)加入菌丝体中 ,39℃,150 r/min振
荡培养3 h ,在显微镜下观察到原生质体释放 。用血球
计数板计数 ,稀释至原生质体数目约为107个/mL。G2
漏斗过滤 ,取等量原生质体溶液用少量 0.6 mol/L 盐
水清洗 ,3000 ～ 4000 r/min离心 15 min ,去掉上清液 ,残
渣用 1 mL 0.6 mol/L 盐水清洗 。3000 ～ 4000 r/min ,离
心15 min ,去掉上清液 ,在沉淀中加入 1.5 mL 、30℃的
PEG6000 ,摇匀后于 39℃下保温 20 min ,涂布于 MM 琼
脂培养基上 ,39℃培养 48 h ,观察菌落生长情况 。挑取
再生菌落通过生长拮抗实验鉴定融合子 。
1.5.5　紫外诱变
诱变样的原生质体稀释 1/10 ～ 1/10000 ,涂平板 ,
距15W紫外灯下 30 cm 分别照射 7 、8 、9 、10 、11 min ,放
入39 ℃培养箱避光培养 ,选取致死率在 95%以上的
菌株 。通过生长拮抗实验鉴定诱变株。
1.5.6　贝壳状革耳菌的固体发酵
经粉碎的稻草以每瓶 10g 分装于 300 mL 三角瓶
内 ,在 0.1 ～ 0.15 MPa压力灭菌 30 min。每瓶接种量
10 mL 菌液 。39℃静置培养。每隔 2 d取样 ,稻草用 4
层纱布包好 ,挤出发酵液 ,残渣用少量水洗 ,再挤 ,重复
3次 ,使酶液总体积约 100 mL。3500 r/min 离心分离
15 min ,上清液用于测定酶活。
1.5.7　漆酶处理(L)
纸浆(浆浓 10%)在 0.5MPa氧压下 ,在 50℃和 pH
值5.0的缓冲溶液中 ,加入 2.0 IU/g 漆酶(对绝干浆)
及1%的NHA(介体),在高压釜(带电动搅拌)中处理 2
h ,洗净 。
1.5.8　氧脱木素(O)
氧脱木素在高压釜(带电动搅拌)中进行。条件:
浆浓 10%,MgSO4用量0.05%,NaOH 用量 2.0%,氧压
为1.0MPa ,时间 60 min。
1.5.9　螯合处理(Q)
螯合处理条件:浆浓 10%, EDTA 用量 1.0%, pH
值3 ,温度 70℃,时间 60 min。
1.5.10　H2O2 漂白(P)
纸浆 H2O2 漂白条件为:浆浓 10%, H2O2 用量
2.0%,NaOH 用量 2.0%, MgSO4 用量 0.05%, 温度
90℃,时间 4 h。
2　结果和讨论
2.1　原生质体融合
原生质体融合速度比较快 ,20 min可以完成 ,所以
其融合过程很难观察到。将融合后的原生质体涂片 ,
观察其形态及细胞核数目 。原生质体融合的方式一般
是2个原生质体融合在一起的双核原生质体 ,原生质
体互相靠近 ,先出现膜接触 ,呈现“8”字型 ,随后膜消
失 ,融合完全;另一种方式是 2个或多个原生质体黏合
在一起 ,接触面质膜发生溶解 ,原生质体从溶解的部位
两两交换物质(核或细胞质)。3个或更多原生质体融
合的情况很少见 。供试菌经过同种原生质体融合 ,得
到30个不同的原生质体融合株。用变色圈法筛选出
8个酶活较高的融合株 ,编号分别为 1 、10 、17 、21 、23 、
24 、26 、28。
2.2　紫外诱变
紫外光的最佳照射时间也就是菌种突变率最高的
照射时间 ,通过测定菌种存活率的大小确定最佳照射
时间 。由靶子学说可知 ,紫外线在诱变之初 ,菌种原生
质体数目很大 ,而此时辐射剂量很少 ,辐射作用呈单击
现象 ,这时紫外光的照射作用的效率很高 。随着照射
时间延长 ,存活的原生质体逐渐减少 ,变异原生质体逐
渐增加 , 突变率增大[ 13-14] 。将原始种贝壳状革耳菌
(Panus conchatus)和上述 8个融合株的原生质体分别
进行紫外诱变 ,致死率均为 99%以上 。用变色圈法筛
选出 12个酶活较高的诱变菌株 ,编号分别为 5a-2 、5a-
4 、5a-5 、5a-7 、21-1 、21-4 、23-2 、24-7 、28-1 、28-2 、28-7。将
再生菌落接种在平板培养基的两边 ,它们之间有拮抗
作用 ,拮抗线呈线状 。诱变株的特征见表1。
2.3　诱变菌株稻草固体发酵产酶活力实验
将经过原生质体融合和紫外诱变的菌株接入稻草
固体发酵 ,与原始菌进行对比 ,观察其产酶能力的变
化。以30 d为周期 ,从第 5 d起每 2 d测 1次酶活 。
30 中　国　造　纸　学　报 第 21 卷　第 4 期　
表 1　诱变菌的菌落特征
编号 生长时间/ d
变色圈
直径/ cm 菌落形态特征
1 4 3.8 圆形 ,丝状 ,无孢子 ,菌丝排列较疏松
10 4 3.6 圆形 ,丝状 ,无孢子 ,菌丝排列疏松
17 4 3.3 圆形 ,丝状 ,无孢子 ,菌丝排列疏松
21 4 3.9 圆形 ,丝状 ,无孢子 ,菌丝排列紧密
23 4 3.5 圆形 ,丝状 ,无孢子 ,菌丝排列疏松
24 4 3.8 圆形 ,丝状 ,无孢子 ,菌丝排列较疏松
26 4 3.5 圆形 ,丝状 ,无孢子 ,菌丝排列较疏松
28 4 3.6 圆形 ,丝状 ,无孢子 ,菌丝排列较疏松
5a-2 4 4.3 圆形 ,丝状 ,无孢子 ,菌丝排列紧密
5a-4 4 3.8 圆形 ,丝状 ,无孢子 ,菌丝排列较疏松
5a-5 4 4.1 圆形 ,丝状 ,无孢子 ,菌丝排列紧密
5a-7 4 3.6 圆形 ,丝状 ,无孢子 ,菌丝排列较疏松
21-1 4 4.1 圆形 ,丝状 ,无孢子 ,菌丝排列紧密
21-4 4 4.5 圆形 ,丝状 ,无孢子 ,菌丝排列较紧密
23-2 4 3.9 圆形 ,丝状 ,无孢子 ,菌丝排列疏松
24-7 4 3.9 圆形 ,丝状 ,无孢子 ,菌丝排列较疏松
28-1 4 4.0 圆形 ,丝状 ,无孢子 ,菌丝排列紧密
28-2 4 3.8 圆形 ,丝状 ,无孢子 ,菌丝排列疏松
28-7 4 3.7 圆形 ,丝状 ,无孢子 ,菌丝排列紧密
　　从图 1和图 2 可以看出 ,供试菌经过原生质体融
合和紫外诱变处理 ,获得的诱变株产漆酶能力明显高
于原始菌 。其中诱变株 28-7的漆酶酶活高峰达 17290
IU/L ,比原始菌的酶活高峰 2318 IU/L 提高约 7.5倍。
原生质体融合技术不仅可以使遗传基因高频重组 ,还
图 1　白腐菌 Panus conchatus产漆酶的情况
为筛选出集双亲优良性状于一体的融合子成为了可
能。通过原生质体的融合再生 ,虽未经诱变处理 ,同样
可改变遗传性能而获得增产。原生质体通过进一步诱
变处理 ,则可大大促进诱变效果。紫外诱变技术是诱
变和筛选优势菌种的一种方法 ,具有设备简单 ,诱变效
率高 ,操作安全简便的特点 ,紫外光照射能使微生物的
DNA分子形成“胸腺嘧啶二原体” ,造成复制错误 ,引
起基因突变 ,从而获得高降解活性的变异菌种 。一般
认为 ,紫外诱变的作用机理是其作用于 DNA 碱基对 ,
造成DNA 损伤或畸变。由于去除细胞壁后 , 染色体
DNA更容易引起死亡突变 ,原生质体对紫外的敏感性
比较强 ,与一般诱发突变不同的是 , 用物理因子(如
UV)诱变原生质体 ,再生菌落的正变频率提高 ,为筛选
高产菌株提供了更多的机会。
图 2　诱变株产漆酶情况
2.4　诱变菌株的遗传稳定性
19个诱变菌株经过传代 10次 ,菌株 21 、28 、5a-2 、
5a-4 、5a-5 、5a-7 、21-1 、21-4 、28-1 、28-2 、28-7的漆酶酶活
下降均在 15%之内 ,其他诱变菌株漆酶酶活的下降在
30%～ 60%之间。这些不稳定的诱变菌株可能是在传
代过程中 ,亲株自身回复突变或转化而形成原养型融
合子。多数只经过原生质体融合的菌株 ,稳定性都比
较差 ,也许因为这些融合子是原生质体聚合状态下所
形成的异核体 ,经传代后子代发生分离形成缺陷型亲
株。
2.5　诱变菌株所产漆酶的生物漂白
漆酶可直接作用于纸浆的残余木素 ,具有较高的
脱木素选择性 ,因此 L/NHA漂白纸浆被认为是最具发
展潜力的生物漂白方式之一。本实验选取诱变菌株
28-7培养9 d产生的漆酶结合介体NHA对纸浆进行预
处理 ,结果见表 2。
表2可知荻苇浆经过酶用量 2.0 IU/g(对绝干浆)
漆酶处理 ,卡伯值降低 17.8%,白度下降 3.4%ISO ,黏
度变化较小 。L/NHA具有较高的脱木素选择性 ,不氧
化或降解纸浆中的碳水化合物 。白度下降可能因为漆
酶的氧化作用导致发色基团增加 。再经 QP 漂白后 ,
白度72.5%ISO ,较QP浆白度增加 3.3%ISO ,黏度1250
31　第 21卷　第 4 期 贝壳状革耳菌诱变提高产漆酶能力及其生物漂白的研究
mL/g ,比荻苇 QP 浆黏度高 。
表 2　不同浆种漆酶生物漂白的结果
浆种 漂序 酶用量/IU/ g 白度/ %ISO 卡伯值 黏度/mL·g -1
荻苇
未漂 — 37.3 11.9 1429
L/NHA 2.0 33.9 9.8 1373
QP — 69.2 3.9 1137
LQP 2.0 72.5 3.1 1250
OQP — 75.0 2.8 1182
OLQP 2.0 83.2 2.0 1117
麦草
未漂 — 41.7 10.5 1305
L/NHA 2.0 40.7 9.6 1247
QP — 72.7 4.2 1178
LQP 2.0 74.6 4.0 1040
OQP — 79.8 3.3 1157
OLQP 2.0 81.8 0.8 1066
芦苇
未漂 — 38.0 11.9 1429
L/NHA 2.0 35.8 9.8 1366
QP — 71.3 3.9 1137
LQP 2.0 74.7 3.1 1250
OQP — 77.3 2.8 1182
OLQP 2.0 84.1 2.0 1117
　　荻苇OLQP 浆 ,白度达 83.2%ISO ,比 OQP 浆白度
升高 8.2%ISO。卡伯值和黏度下降不多 。
麦草浆经过酶用量 2.0 IU/g 漆酶处理 ,卡伯值降
低8.7%,白度下降 1.0%ISO ,黏度变化较小 ,再经 QP
漂白后 ,白度 74.6%ISO ,较 QP 浆白度增加 1.9%ISO ,
黏度 1042 mL/g , 比 QP 浆略有下降。
氧脱木素麦草浆经过酶用量 2.0 IU/g(对绝干浆)
漆酶处理 ,卡伯值 、黏度下降;OLQP 浆 ,白度达81.8%
ISO ,比OQP 浆白度升高 2.0%ISO。
芦苇浆经过酶用量 2.0 IU/g 漆酶处理 ,再进行QP
漂白后 ,白度 74.7%ISO ,较 QP 浆白度增加 3.4%ISO ,
黏度 1250 mL/g ,比QP浆高。
氧脱木素芦苇浆经过酶用量 2.0 IU/g(对绝干浆)
漆酶处理 ,卡伯值 、黏度下降;OLQP 浆 ,白度达84.1%
ISO ,比OQP 浆的白度高 6.8%ISO ,黏度下降较少。
未漂浆经过漆酶处理后 ,卡伯值降低 ,纸浆的可漂
性有所提高 ,对后续漂白起到促进作用。一般认为 ,
L/NHA脱木素过程中存在一个氧化还原循环 ,即漆酶
氧化介体成为小分子化合物自由基 ,并扩散到纸浆中 ,
与纸浆中的木素反应使之降解 。漆酶生物漂白可改善
纸浆的可漂性 ,有利于后续工段残余木素的脱除 ,减少
化学试剂的用量和对环境的污染。
3　结　论
3.1　贝壳状革耳菌经过原生质体融合和紫外诱变 ,其
产漆酶的能力大大提高 。其中诱变株 28-7的漆酶酶
活高峰达 17290 IU/L ,比原始菌的酶活高峰 2318 IU/L
提高约7.5倍 。
3.2　诱变菌株经过传代 10次 ,11个菌株的漆酶酶活
保持较高的稳定性。
3.3　诱变菌产生的漆酶用于纸浆的生物漂白 ,处理荻
苇浆 、麦草浆和芦苇浆 ,LQP 浆和 OLQP 浆的白度比未
经漆酶处理的高 ,卡伯值降低 ,黏度变化不多 。
通过原生质体融合和紫外诱变技术 ,贝壳状革耳
菌产漆酶的酶活大大提高 ,诱变菌用于漂白不同原料
的纸浆 ,均可提高纸浆的可漂性。实验结果初步证明 ,
原生质体融合和紫外诱变技术可以作为改良贝壳状革
耳菌的手段之一 。
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32 中　国　造　纸　学　报 第 21 卷　第 4 期　
Improving Laccase Activity of Panus Conchatus by Mutagenesis and Used for Biobleaching
MO Jia-lin＊　FU Shi-yu　ZHAN Huai-yu
(StateKey Lab of Pulp and Paper Engineering , South China University of Technology , Guangzhou , Guangdong Province , 510640)
(＊E-mail:maggiemo@163.com)
Abstract:Panus conchatus , a kind of white rot fungi , produces laccase with high yield , which degrades lignin selectively.Laccase has been used wide-
ly in many fields and it has an interest in enzyme engineering and environmental protection.However , the most important thing for us was to obtain the
strains with higher laccase activity.The purpose of the study was to screen the strains with higher laccase activity , and then , the pulp was biobleached
with these mutant strains.In this paper , the mutant strains with higher laccase activity were obtained by protoplast fusion and ultraviolet mutagenesis.
19 mutant strains with higher laccase activity were obtained by screening and the highest laccase activity was 17290 IU/ L, which was 7.5 times higher
than that of the primary strain.In the experiment , three kinds of pulp were treated by laccase producing by mutant strains.Another bleaching sequence
was Laccase/mediator biobleaching , i.e.Laccase/ NHA treatment(L), oxygen treatment(O), chelating agent treatment(Q)and hydrogen peroxide
bleaching(P), the physical properties of the bleached pulp were improved in a certain extent.The brightness of LQP pulp and OLQP pulp was higher ,
Kappa value was lower and viscosity had a little decrease compared with the unbleaching pulp.The pulp bleaching performance was improved compara-
tively after treatment by laccase/mediator system.It was proved that protoplast fusion and ultraviolet mutagenesis are the effective methods to improve
laccase activity of Panus conchatus , and the results of our work are significant for the potential application of laccase.
Key words:laccase;protoplast fusion;ultraviolet mutagenesis;activity;biobleaching (责任编辑:孙秋菊)
33　第 21卷　第 4 期 贝壳状革耳菌诱变提高产漆酶能力及其生物漂白的研究