全 文 ：中国药房 2008年第 19卷第 12期 China Pharm acy 2008 Vol.19 No.12 · 929·
柱前衍生 RP -HPLC 法测定法半夏中 γ-氨基丁酸的含量
陈文琼 1 *,余敏灵 2 ,陈文秋 2 ,余施筱 2(1.四川乐山市人民医院 ,乐山市 614000;2.四川乐山市食品药品检验
所 ,乐山市 614000)
中图分类号 R284.1;R927.2 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2008)12-0929-02
摘 要 目的:建立以反相高效液相色谱法测定法半夏中γ-氨基丁酸含量的方法。方法:在碱性条件下 ,氨基酸与异硫氰酸苯酯
反应 ,生成异硫氰酸苯-氨基酸的衍生物;采用 Venusil-AA 氨基酸分析柱(250 mm×4.6 mm , 5μm)、二元梯度洗脱方式测定样
品含量 ,流动相A 为 0.05 mol· L -1醋酸钠溶液(pH 6.5),流动相 B为乙腈-水(80∶20),检测波长为 248 nm 。结果:γ-氨基丁酸
检测浓度在 2.056 ～ 12.336 μg ·mL -1范围内与峰面积积分值呈较好的线性关系;加样回收率为 99.0%, RSD =0.92(n=6)。结
论:本方法简便 、准确 、重现性好 ,可用于法半夏的质量控制 。
关键词 柱前衍生;反相高效液相色谱法;法半夏;γ-氨基丁酸;含量测定
Determining of γ-aminobutyric Acid in Fabanxia by Pre-column Derivatization RP-HPLC
CHEN Wen-qiong(Sichuan Leshan M unicipal Peoples Hospi tal , Leshan 614000 , China)
YU Min -ling , CHEN Wen -qiu , YU Shi-x iao(Sichuan Leshan Ins tit ut e fo r Food and Drug Control , Leshan
614000 , China)
ABSTRACT OBJECTIVE:To dete rmine the content of γ-aminobuty ric acid in Rhizom a Pinelliae Praeparatum.METHO_
DS:In alkaline condi tion , am ino acids reacted w ith phenyl isothiocyanate and resulted in the derivatives o f benzene isot hio-
cyana te -amino acid com plex.A Venusil-AA amino acid analysis column(250 mm ×4.6 mm , 5 μm)was used and the ab-
so rbance at 248 nm was measured.The m obile phase A is 0.05 mol·L -1 sodium ace tate solution(pH 6.5)and the mobile phase
B consisted o f ace tonitrile-w ater (80∶20).RESULTS:T he linear range of γ-aminobuty ric acid w as from 2.056μg ·mL -1 to
12.336μg ·mL -1 , and the recovery w as 99.0%(RSD =0.92 , n =6).CONCLUSION :This m ethod is sim ple , accurate and
reproducible , and it can be used fo r quality control o f Rhizom a Pinelliae Praeparatum.
KEY WORDS Pre-co lumn derivatization;RP -HPLC;Rhizom a Pinelliae Praeparatum;γ-aminobuty ric acid;Content de-
termina tion
*副主任药师。研究方向:医院药学。电话:0833-2119361。E-
mail:Lssrm yy_zbb@s ina.com
法半夏为天南星科半夏属植物半夏 Pinellia ternate(Th_
unb.)Breit.的干燥块茎经炮制加工而成的中药材 。它富含氨
基酸 [1 ] ,其中所含的 γ-氨基丁酸具有多种生理作用 [1 ～3 ] ,其含
量的高低与半夏的质量有密切的关系。因此 , 笔者采用柱前衍
生反相高效液相色谱 (RP -HPLC)法对法半夏中γ-氨基丁
酸的含量进行了测定 。
1 仪器与试药
1100型高效液相色谱仪 、 VWD 紫外检测器 、Chem Sta-
tion色谱工作站 (美国 Agilent公司);Cary100型紫外可见分
光光度计(美国 Varian公司);γ-氨基丁酸对照品(成都市科
龙化工试剂厂 ,批号:20021101 ,含量>99.0%);异硫氰酸苯酯
(北分瑞利集团公司 ,批号:AAD06001);乙腈(色谱纯 , 上海陆
都化学试剂厂);其它试剂均为分析纯;法半夏由乐山市康发药
业股份有限公司提供(批号:070306 、070502 、070906), 经乐山
市食品药品检验所王世强主管中药师鉴定 , 植物来源为天南星
科半夏属植物半夏 Pine llia ternate(T hunb.)Breit.的干燥块
茎 。
2 方法与结果
2.1 对照品贮备液的制备
精密称取γ-氨基丁酸对照品 0.205 6 g , 置于 100 mL 量
瓶中 , 加 0.1 mol ·L -1盐酸溶解并稀释至刻度 , 摇匀 , 精密量
取 5 mL , 置于 100 mL 量瓶中 , 加 0.1 mol· L -1盐酸至刻度 ,
摇匀 ,作为对照品贮备液 。
2.2 供试品贮备液及阴性对照贮备液的制备
取法半夏 (批号:070306)适量 , 粉碎后混匀 , 精密称取
13.154 2 g ,置于离心管中 ,加 0.1 mol ·L -1盐酸 40 mL ,超声
振摇 10 min , 3 000 ～ 5 000 r ·min -1离心 15 min , 分取上清
液 , 置于 100 mL量瓶中 , 残渣用 0.1 mol ·L -1盐酸提取 3次
(30 、20 、10 mL),分取上清液 , 置于上述量瓶中 , 加 0.1 mol ·
L -1盐酸至刻度 ,摇匀 ,作为供试品贮备液 。取除法半夏外的空
白炮制品 ,同法制得阴性对照贮备液 。
2.3 样品的衍生化
精密量取供试品贮备液适量(20 ～ 400μL), 置于 1 mL 量
瓶中 , 加异硫氰酸苯酯-乙腈溶液(25μL∶2 mL)200 μL , 再
加三乙胺-乙腈溶液(1.4∶8.6)稀释至刻度 , 摇匀 , 放置 1 h ,
转移至试管中 , 加正己烷 1 mL , 振摇 ,分取下层液体 ,滤过 , 取
续滤液作为被测溶液 。
2.4 检测波长的选择
取对照品贮备液 400μL , 按“2.3”项下方法衍生化后 , 取
续滤液于 200 ～ 400 nm 波长范围内扫描 。结果发现 ,该溶液在
248 nm波长处有最大吸收 ,所以选择 248 nm 为检测波长 。
2.5 色谱条件
· 930· China Pharmacy 2008 Vol.19 No.12 中国药房 2008年第 19卷第 12期
色谱柱:Venusil-AA 氨基酸分析柱(250 mm×4.6 mm ,
5μm);流动相 A:0.05 mol ·L -1醋酸钠溶液(pH 6.5),流动相
B:乙腈-水(80∶20), 梯度洗脱(梯度见表 1);流速:1 mL ·
min -1;检测波长:248 nm ;柱温:25 ℃;进样量:5μL 。
表 1 流动相洗脱梯度(V)
Tab 1 Gradient elution of mobile phase(V)
时间/min A/% B/%
0 100 0
4 97 3
16 89 11
17 79 21
32 66 34
34 0 100
38 0 100
2.6 系统适应性试验
分别取供试品贮备液 400μL 、对照品贮备液 80μL 、阴性
对照贮备液 400μL , 按 “2.3”项下方法衍生化后 , 取续滤液照
上述色谱条件分别进样 。结果 , 供试品贮备液有与对照品贮备
液色谱图中 γ-氨基丁酸色谱峰相对应的峰 , 且该色谱峰与其
它峰的分离度>1.5 ,理论塔板数为 28 392;阴性对照贮备液无
此色谱峰 ,表明阴性对照无干扰 。色谱见图 1。
2.7 线性关系考察
精密量取对照品贮备液 20 、40、80、100 、120 μL ,分别置于
1 mL 量瓶中 , 按“2.3”项下方法衍生化后 , 取续滤液照上述色
谱条件测定 , 以 γ-氨基丁酸的检测浓度(C , μg ·mL -1)对峰
面积积分值(A)进行线性回归 , 得回归方程为 A=53.558 5C —
4.418 6(r =0.999 9 , n =5)。结果表明 , γ-氨基丁酸的检测
浓度在 2.056 ～ 12.336 μg ·mL -1范围内与峰面积积分值呈
较好的线性关系 。
2.8 精密度试验
精密量取对照品贮备液 200μL ,按“2.3”项下方法衍生化
后 ,取续滤液照上述色谱条件连续进样 5次 。结果 ,峰面积的平
均值为 504.6 , RSD =0.9%,表明仪器精密度良好 。
2.9 重现性试验
精密量取供试品贮备液 400 μL , 共 6份 , 分别置于 6个
1 mL 量瓶中 ,按“2.3”项下方法衍生化后 , 取续滤液照上述色
谱条件测定 。结果 ,峰面积的平均值为 386.8 , RSD=1.1%,表
明方法重现性良好 。
2.10 加样回收率试验
精密量取供试品贮备液 200μL ,分别置于 6个 1 mL 量瓶
中 , 分别精密加入对照品贮备液 30 、35 、40 、45 、50 、55 μL , 按
“2.3”项下方法衍生化后 ,取续滤液照上述色谱条件测定 ,计算
加样回收率 ,结果见表 2。
表 2 加样回收率试验结果(n=6)
Tab 2 Results of recovery test(n=6)
样品含量/μg 加入量/μg 测得量/μg 回收率/ % x/ % RSD/ %
3.946 3.084 7.025 99.8
3.946 3.598 7.508 99.0
3.946 4.112 8.027 99.2 99.0 0.92
3.946 4.626 8.546 99.4
3.946 5.140 8.947 97.3
3.946 5.654 9.578 99.6
2.11 样品含量测定
取法半夏适量 ,粉碎后混匀 ,精密称取粉末约 12 g ,置于离
心管中 ,按“ 2.2”项下方法制备供试品贮备液;精密量取供试品
贮备液 400μL , 置于 1 mL 量瓶中 , 按 “ 2.3”项下方法衍生化
后 ,取续滤液照上述色谱条件测定 ,计算样品含量 ,结果见表3。
表 3 样品含量测定结果(n=3)
Tab 3 Results of content determination of samples(n=3)
批号 样品含量(标示量)/ ‰
070502 0.18
070906 0.13
070306 0.15
2.12 稳定性试验
取“ 2.11”项下续滤液 , 分别在 0 、2 、6、12 h进样测定 。结
果 , RSD =0.7%, 表明供试品溶液在室温条件下 12 h内稳
定 。
3 讨论
试验中加入正己烷的目的是除去中药材提取和衍生化反
应后被测溶液中的脂溶性物质 。
本方法简便 、准确 、重现性好 ,可用于法半夏的质量控制 。
参考文献
[ 1] 徐国均.生药学[ M ] .北京:人民卫生出版社 , 1987:409.
[ 2] 王 营 ,刘 伟 ,余胜利 ,等.γ-氨基丁酸对胰腺癌SW1990
细胞生长及 VEGF 表达的影响 [ J] .山东医药 , 2006 , 46
(31):3.
[ 3] 雷 奇 , 闫剑群 , 施京红 , 等 .GABA 在摄食和味觉机制
中的作用[ J] .世界华人消化杂志 , 2006 , 14(19):1 906.
(收稿日期:2007-09-17 修回日期:2008-01-12)
《中国药房》杂志———《文摘杂志》(AJ)收录期刊 ,欢迎投稿 、订阅