全 文 ：浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis，2012，24(6) :1040 － 1044 http:/ /www． zjnyxb． cn
吴智艳，叶静云，程珊，等． 阿魏侧耳菌丝体 RNA提取方法的比较与研究［J］．浙江农业学报，2012，24(6) :1040 － 1044．
阿魏侧耳菌丝体 RNA提取方法的比较与研究
吴智艳，叶静云，程 珊，闫训友*
(廊坊师范学院 生命科学学院，河北 廊坊 065000)
收稿日期:2012-02-03
作者简介:吴智艳(1962—) ，女，河北磁县人，硕士，教授，主要从
事食用菌栽培与深加工方面的教学科研工作。E-mail:lfwuzhiyan
@ 126． com
* 通讯作者，闫训友，E-mail:yanxunyou@ 163． com
摘 要:采用一步法、异硫氰酸胍—巯基乙醇联合变性法和 STE法 3 种方法，分别对阿魏侧耳总 RNA的提取
效果进行比较。结果表明，一步法难以提取 RNA，异硫氰酸胍—巯基乙醇联合变性法提取 RNA效果不理想，
存在蛋白污染，这 2 种方法不适于富含多糖的阿魏侧耳总 RNA的提取;STE法提取阿魏侧耳总 RNA质量高、
完整性好、成功率高，经琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计检测，提取的总 RNA 具有清晰的 28S，18S，5S 三条
带，且 28S的亮度是 18S 的 2 倍左右，OD260 /OD280比值为 1. 8 ～ 2. 0，可作为阿魏侧耳总 RNA 提取的首选方
法。用此方法来提取阿魏侧耳液体发酵不同时期的 RNA，可以满足进一步分子生物学研究的要求。
关键词:阿魏侧耳;RNA提取;STE法
中图分类号:S 646 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2012)06-1040-05
Comparison of the RNA isolation methods for Pleurotus ferulae Lenzi hyphostroma
WU Zhi-yan，YE Jing-yun，CHENG Shan，YAN Xun-you*
(College of Life Science，Langfang Teachers College，Langfang 065000，China)
Abstract:Total RNA of Pleurotus ferulae Lenzi was extracted by single-step method，STE method and guanidinium
isothiocyanate method，whose isolation effects were compared． The results showed that it was difficult to extract total
RNA from Pleurotus ferulae Lenzi by single-step method． Total RNA could be extracted by guanidinium isothiocya-
nate method，but RNA extracted was immingled by some protein and was not enough for molecular biology experi-
ment． Single-step method and guanidiniu isothiocyanate method were not suitable for RNA extraction from Pleurotus
ferulae Lenzi because of its high amylase content． Total RNA extracted by STE method had high quality，which is the
best method of total RNA isolation from Pleurotus ferulae Lenzi． The quality of total RNA was analyzed with agarose
gel electrophoresis and nucleic acid and ultraviolet spectrophotometer． Three bright bands were observed in agarose
gel electrophoresis as 28S，18S and 5S． The band of 28S was twice wider than that of 18S，and the value of OD260 /
OD280 was 1. 8 to 2. 0． These results demonstrated that the quality and purity of RNA obtained by the method of STE
could meet the demands of molecular biology experiment．
Key words:Pleurotus ferulae Lenzi;RNA extraction;STE method
阿魏侧耳(Pleurotus ferulae Lenzi) ，又名白阿
魏菇，白阿魏蘑，商品名百灵菇，是一种珍稀的
食、药兼用真菌［1］。阿魏侧耳不仅营养成分全面
丰富且含量又高，被学者美誉为当今“食用菌皇
后”，近年来国内外学者对阿魏侧耳生理活性作
了一定的研究。阿魏侧耳这种具有药用功能的
名贵珍稀食用菌含有的水溶性多糖作为一种宿
主免疫增强剂具有抗衰老、抗肿瘤、抗病毒、增强
机体免疫力、抗疲劳以及清除超氧阴离子自由基
等作用［2，3］。
分离纯净、完整的 RNA 对于分子克隆的实
验是很重要的，而且是进行基因表达分析的基
础。来源于任何细胞的 RNA 都可以拷贝成双链
DNA并克隆化最终获得相应于特定细胞来源的
cDNA文库。目前对大多数的动植物材料已建立
了多种 RNA 提取方法并提取得到较好的 RNA
样品［4，5］，但这些方法对富含 RNase、多糖以及糖
蛋白的真菌却不太适用，如富含多糖样品的 RNA
提取过程中，多糖也主要分配在水相也可被醇沉
淀，多糖经醇沉淀易与 RNA 共沉淀。本试验分
别采用了一步法、异硫氰酸胍—巯基乙醇联合变
性法和 STE 法三种不同的方法提取阿魏侧耳菌
丝体的 RNA，比较不同方法提取效果，建立 RNA
提取的优化方案，从而对阿魏侧耳液体发酵不同
时期 RNA的表达性差异进行研究，进一步探讨
不同时期阿魏侧耳的基因表达，为药用真菌分子
调控提供理论基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
供试菌种 Pleurotus citrinopileatus，由中国农
业大学提供。培养基配方为:固体培养基:马铃
薯 20%，葡萄糖 2%，蛋白胨 0. 4%，KH2PO4
0. 3%，MgSO4 0. 15%，琼脂 1. 5%，pH 自然。液
体发酵培养基:马铃薯 20%，葡萄糖 2%，蛋白胨
0. 4%，MgSO4 0. 15%， KH2PO4 0. 3%，VB1
0. 005%，pH自然。菌种活化、平板扩大培养和
摇瓶培养参照文献［6］进行。
药品试剂:异硫氰酸胍—酚—氯仿变性液
(4 mol·L －1异硫氰酸胍，25 mmol·L －1柠檬酸钠，5
g·L －1十二烷基肌氨酸钠，0. 1 mol·L －1 β －巯基
乙醇) ，NaAc(2 mol·L －1，pH 4. 0) ，水饱和酚，
70%乙醇，异丙醇，氯仿∶异戊醇(24∶1)。异硫
氰酸胍—巯基乙醇联合变性液(6 mol·L －1异硫氰
酸胍，37. 5 mmol·L －1柠檬酸，0. 75%十二烷基肌
氨酸钠，使用前加入 2% β-巯基乙醇) ，RNA沉淀
液:1. 2 mol·L －1 NaCl，0. 8 mol·L －1柠檬酸二钠。
2 × STE(0. 1 mol·L －1 Tris-Cl，pH 8. 0，2 mmol·
L －1 EDTA，0. 2 mol·L －1 NaCl) ，1% SDS，硅藻土，
酚 /氯仿 /异戊醇混合液(体积比 25∶24∶1)。
1． 2 用具的处理
所有用于 RNA 提取的器皿、试剂均要经过
RNase灭活处理。试剂瓶和研钵用铝箔纸封口后
于烘箱 200℃烘烤 8 h。枪头和离心管要用 0. 1%
的 DEPC水浸泡处理 24 h，然后高温蒸汽灭菌以
除去残余的 DEPC，烘干备用。配试剂用水要用
0. 1% DEPC 水，然后再高温蒸汽灭菌除去
DEPC。Tris-Cl 溶液的配制要用经 DEPC 处理过
的蒸馏水，再经高温消毒。电泳槽和制胶用具可
用去污剂洗涤，DEPC处理过的蒸馏水冲洗干净，
再用无水乙醇干燥［4］。
1． 3 RNA的提取方法
异硫氰酸胍—酚—氯仿一步法［7］提取方案:
取 1 g培养 7 d的新鲜菌丝体置于预冷陶瓷研钵
中，加入液氮研磨成细粉状，粉末迅速转移至用
液氮预冷的 10 mL 离心管中。依次向离心管中
加入 1 mL变性液、100 μL NaAc (2 mol·L －1，pH
4. 0)、1 mL 水饱和酚、0. 2 mL 氯仿:异戊醇混合
液，在冰上放置 15 min使核蛋白质复合体彻底裂
解，4℃以 14 000 r·min －1离心 5 min，取上清加入
等体积的异丙醇，充分混合液体并在 － 20℃沉淀
RNA 1 h，后在 4℃以 14 000 r·min －1离心 15 min，
收集沉淀，加入变性液溶解 RNA，将溶液移至 2
mL离心管，漩涡均匀，并在 － 20℃用等量异丙醇
沉淀 RNA 1 h，在 4℃以 14 000 r·min －1速度离心
15 min收集 RNA沉淀，用 70%乙醇洗涤 2 次，重
复离心，干燥 RNA，将 RNA 溶于 50 μL 无 RNase
的水中，－ 70℃保存备用。
异硫氰酸胍—巯基乙醇联合变性法［4］提取
方案:取 1 g 培养 7 d 的新鲜菌丝体置于预冷陶
瓷研钵中，加入液氮研磨成细粉状，粉末迅速转
移至用液氮预冷的 10 mL 离心管中，依次向离心
管中加入 1. 5 mL 变性液、150 μL NaAc(2 mol·
L －1，pH 4. 0)、1. 5 mL 水饱和酚和 1. 5 mL 氯仿 /
异戊醇混合液(体积比 24∶1)混匀并在冰上放
置 15 min，4℃以 14 000 r·min －1离心 5 min，将上
清水相转移至新的离心管中，加入等体积的酚 /
氯仿 /异戊醇混合液(体积比 25∶24∶1)再抽提
1 次，再将上清水相转移至新的离心管中，加入
0. 25 体积的异丙醇和 0. 25 体积的 RNA 沉淀液。
充分混匀，于室温放置 10 min。4℃以 14 000 r·
min －1离心 15 min，弃上清，将 RNA 沉淀用 70%
乙醇洗涤 2 次，干燥 RNA，将 RNA溶于 50 μL无
RNase的水中，－ 70℃保存备用。
·1401·吴智艳，等． 阿魏侧耳菌丝体 RNA提取方法的比较与研究
STE法［8］提取方案:取 1 g 培养 7 d 的菌丝
体置于预冷陶瓷研钵中，置 － 70℃预冷 1 ～ 2 h
后，依次加入 600 μL 2 × STE，600 μL 1% SDS，适
量的硅藻土，1. 2 mL 酚 /氯仿 /异戊醇混合液(体
积比 25∶24∶1) ，研磨成匀浆，将研磨好的样品
装入 2 mL 的离心管，涡旋混匀，4℃ 14 000 r·
min －1离心 5 min，将上清液转入新的离心管(事
先加入 600 μL的酚 /氯仿 /异戊醇混合液) ，涡旋
混匀，4℃ 14 000 r·min －1离心 5 min。重复酚 /氯
仿 /异戊醇混合液抽提一次。把上清液转到装有
60 μL NaAc(3 mol·L －1，pH 5. 5)的离心管中，再
加入 750 μL无水乙醇，涡旋混匀，把离心管放 －
20℃1 h。4℃下以 14 000 r·min －1离心 15 min，弃
上清。加 750 μL 70%乙醇洗沉淀，4℃ 14 000 r·
min －1离心 5 min，弃上清，用移液枪把残液吸净，
干燥 RNA，用 50 μL 无 RNase 的水溶解沉淀，
－ 70℃保存备用。
1． 4 RNA完整性分析及质量检测［9，10］
RNA的完整性用 1%琼脂糖凝胶电泳，然后
用紫外凝胶成像系统观察。RNA 纯度鉴定:取
1 μL样品，用 DEPC 水稀释，紫外分光光度计测
量其在 230，260 和 280 nm处的紫外吸光值(A)。
每个样品重复 3 次，取平均值。以 OD260 /OD230和
OD260 /OD280比值做纯度分析。
1． 5 阿魏侧耳不同时期 RNA的提取
用所得的最优方案对阿魏侧耳液体发酵第
2，4，7 天，取 3 个阿魏侧耳液体发酵不同时期的
菌丝体进行 RNA 的提取，并对其完整性和质量
进行检测。
2 结果与分析
2． 1 不同方法提取 RNA完整性检测
由电泳分析中 1 ～ 4 条带可见，用一步法提
取的阿魏侧耳菌丝体的总 RNA，未见 28S rRNA，
18S rRNA和 5S rRNA，只有很弱的弥散状带。用
异硫氰酸胍—巯基乙醇联合变性法提取到阿魏
侧耳菌丝体总 RNA，可以看到 28S，18S 和 5S
rRNA三条带，但 28S rRNA 条带的亮度与 18S
rRNA条带亮度几乎一致，5S rRNA 则呈弥散状，
同时在点样孔有蛋白质的污染，用 STE 法提取阿
魏侧耳菌丝体总 RNA 清晰的看到了 28S rRNA，
18S rRNA和 5S rRNA三条带，且 28S rRNA 条带
的亮度约为 18S rRNA 条带亮度的 2 倍，RNA 纯
度高。
1，2:一步法提取法;3，4:异硫氰酸胍—巯基乙醇联
合变性法;5，6:STE法
图 1 不同方法提取的总 RNA电泳分析
Fig． 1 Electrophoresis of total RNA isolated by dif-
ferent methods
2． 2 不同方法提取 RNA纯度、浓度的检测
一步法、异硫氰酸胍—巯基乙醇联合变性法
和 STE法提取的阿魏侧耳总 RNA纯度和浓度见
表 1。从表 l可以看出，一步法提取的总 RNA 的
OD260 /OD280为 2. 115，大于 2，说明 RNA 有降解;
OD260 /OD230为 1. 444，明显小于 2，说明含有杂
质，这与实际操作中多糖较多，沉淀时大量多糖
与 RNA一起沉淀，造成 RNA 沉淀难以溶解相符
合。异硫氰酸胍—巯基乙醇联合变性法提取的
总 RNA的 OD260 /OD280值低小于 1. 8 说明有蛋白
污染，OD260 /OD230明显小于 2 说明有杂质。从图
表中看出 STE法所提取的阿魏侧耳的总 RNA 质
量较好，适合食用菌总 RNA的提取。
2． 3 阿魏侧耳不同时期 RNA的提取结果
由图2可清晰看到28 S rRNA，18 S rRNA和
表 1 不同方法提取 RNA的紫外吸收值
Table 1 Ultraviolet absorption value of different RNA isola-
tion methods
方法 OD260 /OD280 OD260 /OD230
一步法 2. 115 1. 444
异硫氰酸胍—巯基乙醇联合变性法 1. 749 1. 915
STE法 1. 819 2. 041
·2401· 浙江农业学报 第 24 卷 第 6 期(2012 年 11 月)
5S rRNA 三条带，且 28S rRNA 条带的亮度约为
18S rRNA条带亮度的 2 倍。此三个样品 RNA的
OD260 /OD280值都介于 1. 8 ～ 2. 0 之间且 OD260 /
OD230比值在 2 左右。说明此方法所提取 RNA纯
度较高，可做进一步的测序，来比较三个不同时
期 RNA与其多糖分泌之间的关系。
1，2:第 2 天的总 RNA;3，4:第 4 天的总 RNA;5，6:
第 7 天的总 RNA
图 2 阿魏侧耳不同时期总 RNA的提取结果
Fig． 2 Isolation results of total RNA of Pleurotus
ferulae Lenzi in different times
3 讨论
3． 1 不同提取方法结果差异的原因分析
根据结果可知，3 种提取方法中，STE 法提取
的阿魏侧耳的总 RNA 完整性好、纯度高、浓度
高，适合于分子生物学下游试验的使用。异硫氰
酸胍—巯基乙醇联合变性法能提取阿魏侧耳的
总 RNA，但是总 RNA 有部分降解，并含有杂质、
浓度低、效果不够理想，且该法在实验中常有上
清黏稠很难抽提、RNA 沉淀呈黏稠状、不易溶解
的情况。用一步法几乎不能提取出完整的总
RNA，且在实验过程中要两次加入变性剂，加大
了 RNA的损失，以及 RNase的污染［11］。
异硫氰酸胍—巯基乙醇联合变性法与传统
的一步法相比作了如下的改进:将变性液 3 种成
分的浓度提高为原来的 1. 5 倍，并将  －巯基乙
醇的浓度提高到 2%，这样在细胞破碎后就强烈
地抑制住内源性 RNase 活性和有效地防止酚类
化合物的氧化;STE 法和别的 RNA 提取方法比
较，有一个显著特点就是采用硅藻土研磨。一般
的提取方法都是采用液氮研磨，但由于真菌材料
使用了液体培养，即使过滤后菌丝体仍含有较多
的水分，液氮冷冻会形成冰晶而妨碍研磨［12］。研
磨时间越长，这就越增加 RNA 酶污染的机会。
而硅藻土是一种黏土，能吸附 RNA 酶［13］。随同
它所吸附的 RNA 酶可在后续的 RNA 纯化过程
中(酚 /氯仿 /异戊醇混合液抽提)经离心去除。
本方法用酚 /氯仿 /异戊醇多次抽提，使 RNA 留
在水相而 DNA 和蛋白质进入有机相，能将蛋白
质清除干净，去除 DNA 污染。用醋酸钠和无水
乙醇沉淀 RNA，避免了小分子 RNA 的丢失［13］，
用醋酸钠沉淀，能除去高含量的多糖，得到了高
质量的、完整的 RNA。
3． 2 RNA 提取中如何最大程度的降低 RNA 降
解
RNA酶、多糖、多酚等物质均是造成 RNA 难
以成功提取的重要因素。RNA 酶分为外源 RNA
酶和内源 RNA酶两种，前者虽说无处不在，但是
可以通过高温干烘、RNA 酶抑制剂(比如氯仿、
DEPC水等)处理、勤换手套、带口罩等方法加以
解决，但内源 RNA酶来自样品组织内部，不能通
过前期处理和小心预防的方法来清除，这就要求
RNA提取过程中，抑制内源 RNA 酶活性。依据
硅藻土可以有效吸附 RNA 酶的特点，我们在研
磨过程中加入了硅藻土，从而避免了样品 RNA
被降解，结合酚仿抽提有效地去除了 RNA 酶等
蛋白质，大大地提高了 RNA 提取。同时，在提取
过程中，采用高浓度的 NaAc 和无水乙醇沉淀等
步骤，有效地去除了多糖多酚类物质，从而建立
了有效提取样品 RNA的方案。
提取过程中，使用水饱和酚(pH 4. 5)试剂和
采用高速离心是提取成功的关键，因为在偏酸的
条件下，RNA 稳定，而 DNA 不稳定［14］。在高盐
低 pH的缓冲体系下，经 SDS 裂解细胞膜而释放
出的 RNA 释放到缓冲液中，采用酸性的酚—氯
仿混合抽提，低 pH 的酚使 RNA 进入水相，通过
离心，RNA便与仍留在有机相中的蛋白质、多糖
等杂质分离开来，然后在低盐下分离，得到质量
较高的总 RNA［15，16］，同时使用更高的离心力
14 000 r·min －1，保证了细胞杂质的有效清除。
·3401·吴智艳，等． 阿魏侧耳菌丝体 RNA提取方法的比较与研究
针对提取后期 RNA 被降解的问题，可在电
泳时通过提高电压来减少电泳时间。但高电压
电泳会使电泳缓冲液发热，这样会使 RNA 降解。
为解决这个问题，可在电泳前将电泳缓冲液预
冷，电泳时在电泳槽上敷冰袋降温。
3． 3 阿魏侧耳不同时期 RNA 表达与多糖关系
的探讨
由胡彩香作者所写阿魏提取物对阿魏菇菌
丝生长及生物活性影响的研究中，我们可知阿魏
侧耳液体发酵液多糖的含量随着时间的延长先
增大再减少，当液体培养 4 d时，发酵液多糖含量
达到最大值。因此试验中选取对发酵培养第 2
天，第 4 天及第 7 天时阿魏侧耳菌丝体进行 RNA
的提取，进一步探讨 RNA 的表达性差异与其多
糖分泌之间的关系。
参考文献:
［1］ 张金霞，左雪梅，董晨阳．食用菌新秀一阿魏侧耳［J］．土壤
肥料，2003，(6) :46 － 47．
［2］ Kubo K，Aoki H，Nanball H． Anti-diabetic activity presenting
the fruit body of Grifola frondosa(Maitake) ［J］． Biological ＆
Pharmaceutical Bulletin，1994，17:1106 － 1110．
［3］ Ohno N，Adachi Y，Suzuki I，et al． Characterization of the
antitumor glucan obtained from liquid-cultured Grifola frondosa
［J］． Chemical＆ Pharmaceutical Bulletin，1986，34(4:1709 －
1715．
［4］ 周凯松，薛久刚，常宁，等． 一种简单高效的食用真菌总
RNA提取方法［J］．遗传，2003，25(6) :703 － 704．
［5］ F．奥斯伯，R． 布伦特，R． E． 金斯顿，等． (颜子颖，王海林
译)．精编分子生物学实验指南［M］． 北京:科学出版社，
2001:120．
［6］ 闫训友，李娜娜，史振霞，等． 丙酮提取金顶侧耳发酵液多
糖的优化设计［J］．菌物学报，2008，27:413 － 419．
［7］ Chomezynski P，Brar AK，Frohman LA． Single-step method of
RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloro-
form extraction［J］． Analytical Biochemistry，1987，162:156 －
159．
［8］ 淡明，黄海波，郭安平，等．一种简单高效的真菌总 RNA提
取方法［J］．福建热作科技，2006，(4) :19 － 20．
［9］ 淳俊，郑彦峰，王胜华，等．一种广泛适用的 RNA提取方法
［J］．生物化学与生物物理进展，2008，35(5) :519 － 597．
［10］ 郑晓飞． RNA 实验技术手册［M］． 北京:科学出版社，
2004:129 － 131．
［11］ 刘易科，孙洪波，简波，等． 两种大豆总 RNA 提取方法的
改良［J］．西北农林科技大学学报(自然科学版) ，2006，34
(12) :83 － 86．
［12］ 吴小萍，席梦利，缪红艳，等． 百合总 RNA 提取方法的比
较和分析［J］．分子植物种，2006，4(6) :871 － 876．
［13］ 申建斌，田维敏，蒋昌顺．柱花草叶片组织总 RNA提取方
法［J］．热带农业科学，2007，27(3) :13 － 14．
［14］ Baisakh N，Parami N，Subudhi P． cDNA-AFLP analysis re-
veals differential gene expression in response to salt stress in a
halophyte Spartina alterniflora Loisel［J］． Plant Science，
2006，170:1141 － 1149．
［15］ Fang G，Hammar S，Grumet R． A quick and inexpensive
method for removing polysaccharides from plant genomics
［J］． Biotechniques，1992，13:52 － 56．
［16］ 李宏，王新力． 植物组织 RNA 提取的难点及对策［J］． 生
物技术通报，1999，15(1) :36 － 39．
(责任编辑 张 韵)
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