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收稿日期:2008-10-28作者简介:韩晶(1983-),女 ,在读硕士研究生 ,主要从事药物分析研究;E-mail:hanjing0591@yahoo.cn。＊通讯作者:毕开顺 , Tel:024-23986296, E-mail:Bikaishun@yahoo.com。
柱前衍生 HPLC法分析白土茯苓多糖中单糖的组成
韩　晶 ,陈晓辉 ,孙立新 ,占志惠 ,毕开顺＊
(沈阳药科大学药学院 ,辽宁 沈阳 110016)
　　摘要　目的:建立柱前衍生 HPLC法测定白土茯苓多糖中单糖的组成。方法:以三氟乙酸(TFA)水解白土茯苓
多糖 , 水解产物加入 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)进行衍生化 , 采用反相高效液相色谱法 , 测定白土茯苓多糖
中单糖的衍生物。色谱柱:KromasilC18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流动相:100 mmol/L醋酸铵缓冲液(pH =
5.5)∶乙腈 =77∶23(V/V);检测波长:245 nm。结果:白土茯苓多糖中含有甘露糖 、鼠李糖 、葡萄糖 、半乳糖和木糖 ,
其摩尔比为 66∶1∶7590∶452∶528。结论:该方法简便 、准确 ,可以测定出白土茯苓多糖中单糖的组成。
关键词　白土茯苓多糖;柱前衍生化;HPLC;单糖
中图分类号:R284.1　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2009)06-0893-03
AnalysisofMonosaccharideCompositionsinHeterosmilaxjaponica
PolysaccharidebyPrecolumnDerivationHPLC
HANJing, CHENXiao-hui, SUNLi-xin, ZHANZhi-hui, BIKai-shun
(ShenyangPharmaceuticalUniversity, Shenyang110016, China)
Abstract　Objective:ToestablishprecolumnderivationHPLCmethodtodeterminethemonosaccharidesinHeterosmilaxjaponica
polysaccharide.Methods:Heterosmilaxjaponicasamplewashydrolyzedwithtrifluoroacetic(TFA)andderivatedby1-phenyl-3methyl-5-
pyrazolone(PMP).ThemonosaccharidecompositionofHeterosmilaxjaponicapolysaccharidewascarriedoutbyreversed-phasetech-
niqueonaKromasilC18 columnwithamobilephasecomposedof100 mmol/Lammoniumacetatebuffer(pH5.5)andacetonitrileinthe
ratioof77∶23.Thedetectionwascarriedoutat245nm.Results:TheHeterosmilaxjaponicapolysaccharidecomposedofmannose, rham-
nose, glucose, galactoseandxylosewithamolarratioof66∶1∶7590∶452∶528.Conclusion:TheHPLCmethodwithprecolumnderivatiza-
tionisappropriatefortheanalysisofmonosaccharidecompositionofHeterosmilaxjaponicapolysaccharideandthemethodissimple,
quickandaccurate.
Keywords　Heterosmilaxjaponicapolysaccharide;Precolumnderivation;HPLC;Monosaccharide
　　白土茯苓为百合科肖菝葜属植物肖菝葜 Heter-
osmilaxjaponicaKunth的干燥块茎 ,味甘 、淡 ,性平 ,
临床上多用于治疗阳梅毒疮 、筋骨挛痛 、钩端螺旋体
病 〔1〕。本文采用柱前衍生化反相高效液相色谱法
对白土茯苓多糖进行单糖组成方面的研究 ,旨在为
白土茯苓药理活性方面的深入研究提供可靠依据 。
1　仪器与材料
1.1　仪器　LC-10AD高效液相色谱仪(日本岛津
公司 ):SPD-10A紫外检测器 , CLASS-VP工作站。
SK250H超声波清洗器 (上海科导超声仪器有限公
·893·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 6期 2009年 6月
司);SZ-96自动纯水蒸馏器 (上海亚荣生化仪器
厂);PHS-25数显 pH计(上海精密科学仪器有限公
司);DK-98-1型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪
器有限公司);TG-328A型分析天平(上海天平仪器
厂);HC-2516高速离心机(科大创新股份有限公司
中佳分公司)。
1.2　材料　白土茯苓药材来源于贵州 ,经沈阳药
科大学孙启时教授鉴定为百合科肖菝葜属植物肖菝
葜 HeterosmilaxjaponicaKunth的干燥块茎。甘露
糖 、鼠李糖 、葡萄糖 、半乳糖和木糖对照品纯度均在
99.0%以上 ,购于国药集团化学试剂有限公司;1-
苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)为分析纯 ,购于中国
医药集团上海化学试剂公司;三氟乙酸(TFA)为化
学纯 ,购于国药集团化学有限公司;冰醋酸 、乙腈为
色谱纯 ,水为重蒸水 ,其它试剂均为分析纯 。
2　方法与结果
2.1　色谱条件　色谱柱:KromasilC18柱 (250 mm
×4.6 mm, 5μm);流动相:100mmol/L醋酸铵缓冲
液(pH =5.5)∶乙腈 =77∶23(V/V);检测波长:245
nm;流速:1.0mL/min;进样量:20μL;柱温:35℃。
2.2　白土茯苓多糖的提取　白土茯苓样品干燥粉
碎 ,取粉末约 10 g,精密称定 ,加入石油醚 (60 ～
90℃)60 mL回流提取 2次 ,每次 2 h,弃去提取液 ,
药渣用乙醚 60mL回流提取 2次 ,每次 2 h,弃去提
取液 ,药渣用 80 %乙醇 60 mL浸泡过夜 ,回流提取
2次 ,每次 2 h。弃去提取液 ,药渣于水浴上挥干溶
剂后 ,加蒸馏水 80mL回流 ,提取 2次 ,每次 2h。合
并提取液 , 活性炭脱色后减压浓缩至 40 mL, 用
Sevage法除去蛋白 。加入 95%乙醇 ,使其含醇量达
80 %,静置 ,离心后弃去上清液 ,沉淀先后用无水乙
醇 、丙酮 、乙醚多次洗涤 ,真空干燥 ,即得白土茯苓多
糖 。提取收率约 1.5%。
2.3　溶液的制备
2.3.1　供试品溶液的制备:取白土茯苓多糖样品
约 2 mg,精密称定 ,置于 5 mL安瓿中 ,加入水 1 mL
溶解后 ,再加入 4 mol/L三氟乙酸 1 mL,封管后于
110℃烘箱中水解 2 h,得水解液 ,真空干燥箱 30℃
下烘干 。干燥后的样品 ,用氨水溶解 ,并转移至 5
mL量瓶中 ,氨水定容至刻度 ,摇匀 ,即得 。
2.3.2　对照品溶液的制备:分别取甘露糖(Man)、
葡萄糖 (Glu)、半乳糖 (Gal)约 0.0180 g, 鼠李糖
(Rha)、木糖(Xyl)对照品约 0.0150 g,精密称定 ,用
氨水溶解 ,并转移至 5mL量瓶中 ,氨水定容至刻度 ,
摇匀 ,即得。
2.4　衍生化产物的制备　取单糖对照品混合溶液
和供试品溶液各 100 μL与 100 μL的 PMP/甲醇溶
液(0.5mo1/L)置于具塞试管中混合均匀 , 70℃水
浴中反应 30min。取出后冷却至室温 ,加入 100 μL
醋酸中和 ,用水补足体积至 1 mL,再加入 1 mL氯
仿 ,充分振荡后除去有机相 ,重复 3次。水相经 15
000 r/min高速离心 3 min后 ,用水稀释 10倍 ,进行
HPLC分析 。
2.5　方法学考察
2.5.1　线性关系:取甘露糖 、鼠李糖 、葡萄糖 、半乳
糖和木糖对照品混合溶液 0.03、 0.1、 0.25、 0.5、
1.0、5.0mL,置 10 mL量瓶中 ,氨水定容至刻度 ,摇
匀 ,作为系列对照品混合溶液。按 “ 2.4”项下进行
衍生化处理 ,按 “2.1”项下色谱条件进样 ,记录色谱
图。以对照品浓度 (X)为横坐标 ,色谱峰峰面积
(Y)为纵坐标绘制标准曲线。再将对照品衍生产物
溶液逐级稀释 ,进样 ,计算当信噪比为 3时所对应的
对照品溶液的质量浓度以确定检测限(LOD),结果
见表 1。
　表 1 　5种单糖衍生产物的线性关系
单糖 相关系数 线性关系(×104) LOD/ng
Man 0.9998 Y=4.11X-2.21 0.18
Rha 0.9997 Y=2.92X-2.75 0.37
Glu 1.0000 Y=2.97X 0.36
Gal 0.9999 Y=4.34X-2.03 0.60
Xyl 0.9998 Y=3.08X-3.02 0.12
2.5.2　精密度试验:取对照品混合溶液 ,按 “2.4”
项下进行衍生化 ,依照 “ 2.1”项下色谱条件连续进
样 6次 ,测定甘露糖 、鼠李糖 、葡萄糖 、半乳糖和木糖
峰面积的 RSD分别为 2.2%、2.1%、2.0%、2.7%
和 3.0 %。
2.5.3　重复性试验:取白土茯苓多糖 6份 , 按
“2.3”项下操作制备溶液 ,再按 “2.4”项下方法进行
衍生化处理 ,在 “ 2.1”项色谱条件下 ,进行测定 ,记
录峰面积 ,计算甘露糖 、鼠李糖 、葡萄糖 、半乳糖和木
糖含量的 RSD分别为 1.0%、2.3%、2.1%、1.8%
和 1.5 %。
2.5.4　稳定性试验:取白土茯苓多糖 ,按 “ 2.3”项
下操作制备溶液 ,再按 “ 2.4”项下方法进行衍生化
处理 ,分别于衍生化反应结束后 0、2、4、6、8和 10 h
进样 ,记录峰面积 ,结果表明样品溶液在 8 h内稳
定 ,甘露糖 、鼠李糖 、葡萄糖 、半乳糖和木糖峰面积的
RSD分别为 2.2 %、2.5 %、1.6 %、1.8 %和 1.5
%。
2.6　样品的测定　取白土茯苓多糖 3份 ,按 “2.3”
·894· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 6期 2009年 6月
项下操作制备溶液 ,再按 “2.4”项下方法进行衍生
化处理 ,在 “ 2.1”项色谱条件下进行测定 ,记录峰面
积 。根据分析和计算 ,求得白土茯苓多糖中甘露糖 、
鼠李糖 、葡萄糖 、半乳糖和木糖之间的摩尔比为
66∶1∶7590∶452∶528。色谱图见图 1。
图 1　对照品与样品衍生产物色谱图
A.5种单糖对照品　B.白土茯苓多糖水解后样品
1.甘露糖　2.鼠李糖　3.葡萄糖　4.半乳糖　5.木糖　
6.PMP
3　讨论
3.1　多糖水解时间的选择　本实验中以甘露糖与
葡萄糖峰面积比为考察对象 ,考察了封管后白土茯
苓多糖完全水解所需的时间 。结果表明 ,水解 2、4
和 6 h所得到的单糖比例是一致的 ,故选择水解时
间是 2 h。
3.2　衍生化条件的改进　本文采用醋酸中和反应
介质中的碱性环境 ,并且在整个衍生化过程中没有
进行干燥 。醋酸的加入使 13 min左右的 PMP色谱
峰明显减小 ,不再影响甘露糖的测定 。干燥步骤的
简化并没有影响产物的性质 ,也没有产生任何影响
分离的杂质 ,而且缩短了反应时间 ,降低了衍生产物
在多个步骤中的损失 ,具有简单 、易行的特点 。
3.3　色谱条件的优化　本实验中考察了以磷酸盐
缓冲系统和醋酸铵缓冲系统作为流动相时 ,衍生产
物的分离效果 。实验结果表明 ,采用磷酸盐缓冲系
统时 ,衍生产物均有严重拖尾现象 ,并且葡萄糖与半
乳糖不能达到基线分离 。采用醋酸铵缓冲系统作为
流动相时 , pH对保留时间影响较大 ,当流动相 pH
值为 5.5时 ,各色谱峰能在保持较好的分离状态下
得到合适的保留时间。
　　本文建立的 PMP柱前衍生化高效液相色谱法
分析单糖的方法准确可靠 ,可同时检测多个单糖 ,取
样量少 ,且分离效果较理想 ,适合于白土茯苓多糖样
品的单糖组成测定 ,所得到的结果从侧面反映了白
土茯苓多糖的结构 。
参 考 文 献
[ 1] 国家中医药管理局 《中华本草 》编委会 .中华本草
[ M] .上海:上海科学技术出版社 , 1999:8, 106.
本刊投稿须知
1　本刊从 2006年第 1期起将刊登 “作者简介 ”内容 ,请作者在文章首页下脚按 “姓名 、出生年 、性别 、职称 、
研究方向和联系方式 ”等内容注明。
2　来稿应为打印稿 ,投稿时不必附软盘;实验性文章应附单位介绍信 。
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4　投稿同时请从邮局汇寄处理费(50元 /篇),切勿在稿件中夹带现金;汇款时请注明文章第一作者姓名及
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·895·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 6期 2009年 6月