全 文 ： 2009, Vol. 30, No. 24 食品科学 ※分析检测324
柱前衍生-HPLC分析天山花楸多糖中的
单糖组成
孟 磊，常军民 *，孙 莲，薛照芸
(新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830011)
摘 要：目的：测定分析天山花楸中的单糖组成。方法：天山花楸多糖样品用 2mol/L硫酸溶液水解成单糖，用
1-苯基 -3-甲基 -5-吡唑啉酮(PMP)衍生化，采用反相高效液相色谱法于波长 245nm处检测各单糖。结果：天山花
楸多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖 7 种单糖组成。结论：此
法简单、快速、重现性好，可用于天山花楸多糖中单糖组成分析。
关键词：高效液相色谱法；天山花楸多糖；柱前衍生化；单糖
Use of Pre-column Derivatization HPLC for Determination of Monosaccharide Compositions and Contents in
Sorbus tianschanica Ruper. Polysaccharide
MENG Lei，CHANG Jun-min*，SUN Lian，XUE Zhao-yun
(College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)
Abstract：Objective: To determine the monosaccharide compositions in polysaccharide from Sorbus tianschanica Ruper..
Methods: Sorbus tianschanica Ruper. polysaccharide samples were hydrolyzed with 2 mol/L sulfuric acid solution, and
derivatized with 1- phenyl-3 - methyl -5 - pyrazolone (PMP), and further separated by RP-HPLC using a equivalent elution
process detected at 245 nm. Results: Polysaccharide of Sorbus tianschanica Ruper. was composed of mannose, rhamnose,
galacturonic acid, glucuronide acid, glucose, galactose, arabinose. Conclusion: The method was simple, fast and reproducible, and
can be used in determination of polysaccharide compositions of Sorbus tianschanica Ruper..
Key words：HPLC；Sorbus tianschanica Ruper. polysaccharides；pre-column derivatization；monosaccharide
中图分类号：TS207.3 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)24-0324-03
收稿日期：2008-12-16
基金项目：新疆维吾尔自治区高校科研计划重点项目(XJEDU2005119)
作者简介：孟磊(1969－)，女，高级实验师，研究方向为天然药物。E-mail：cszx5034@163.com
*通讯作者：常军民(1965－)，男，副教授，博士，研究方向为天然药物分析。E-mail：cjmcjn2471@yahoo.com.cn
天山花楸多糖是从蔷薇科花楸属植物天山花楸
(Sorbus tianschanica L.)[1]中分离得到的一种杂多糖。多
糖的单糖组成分析是进行多糖质量控制和获取多糖基本
信息的重要环节。因为糖类物质不具有发色基团[2]，故
不能用紫外检测。而衍生化方法可以使糖类样品带上发
色基团，使紫外检测信号增强，大大提高检测灵敏度。
应用 PMP作为衍生化试剂可以在温和的反应条件下与糖
链进行定量反应，并用于单糖的组成分析。天山花楸
多糖中单糖组分分析未见报道，本实验采用 PMP衍生
化法研究天山花楸多糖中单糖组成，为天山花楸进一步
的药理研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
天山花楸于 2007年 8月底采自新疆呼图壁林场，经
新疆医科大学药学院生药学教研室帕丽达教授鉴定为
Sorbus tianschanica Ruper.的嫩枝叶。
葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、鼠李
糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcUA)标准品(生化试剂) 上海试
剂二厂；半乳糖醛酸(GalUA)、阿拉伯糖(Arab)标准品
均为生化试剂；1-苯基 -3-甲基 -5-吡唑啉酮(衍生化试剂
P M P )、硫酸、盐酸、氢氧化钠均为分析纯；乙腈、
甲醇均为色谱纯。
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Agilent1100高效液相色谱仪(配ChemStations色谱工作
站) Agilent公司；PHS-3C酸度计 上海雷磁公司；VP-
ODS色谱柱 (150mm× 4.6mm，5μm) 日本岛津公司。
1.2 方法
1.2.1 色谱条件
VP-ODS色谱柱；流动相：醋酸铵缓冲溶液(pH
5.5)-乙腈(78:22，V/V)；柱温 25℃；流速 0.8ml/min；
检测波长 245nm[3]。
1.2.2 多糖的提取与精制
称取干燥至恒重过40目筛的天山花楸粉末100g，加
水适量，于 95℃时超声提取 30min，过滤，滤渣加水
适量于 95℃时再超声提取 30min，共提取 3次，合并提
取液，于旋转蒸发仪上浓缩至 100ml。在其中加 95%乙
醇至含醇量达 80%，4℃时静置过夜。于 40000r/min条
件下离心分离 5min，离心后的沉淀物加少量 90℃热水溶
解后，再加 95%乙醇至含醇量达 80%，静置过夜，离
心分离。将得到的粗多糖溶于热水，采用 Sevag法(氯
仿:正丁醇 =4:1，V/V)除蛋白 8次。加 1%活性炭脱色，
抽滤，加入乙醇使含醇量达 80 %，静置过夜，离心分
离。沉淀物置于 60℃的真空干燥箱中干燥，即得精制
的淡黄色的天山花楸多糖。将精制后的多糖在波长
260～280nm区间内扫描，结果显示无吸收峰时为蛋白基
本除尽。
1.2.3 多糖的水解
称取天山花楸多糖 20mg置于 10ml具塞试管内加入
2ml 2mol/L H2SO4于 100℃水解 8h得水解样品溶液。用
4mol/L氢氧化钠水溶液中和至 pH值约为 7.0，并以水稀
释到 5 ml 离心，取上清液待衍生化。
1.2.4 单糖标准品的衍生化
(GalUA)、0.0030g阿拉伯糖(Arab)，于 10ml容量瓶溶
解并定容混匀。取该溶液 50μl与 50μl 0.5mol/L PMP甲
醇溶液及 50μl 0.3mol/L NaOH涡旋混合 30s，在 70℃条
件下反应 30min(反应机理如图 1所示)，冷却至室温，加
入 50μl 0.3mol/L HCl进行中和并加入去离子水 100μl稀
释混匀，加入 1ml氯仿涡旋混匀 30s静置 5min，吸取下
层液弃去，从“加入 1ml氯仿”到“吸取下层液弃去”
重复 3次，经 0.45μm微孔滤膜滤过，进样 5μl。结果
见图 2 a。
分别精确称取 0.0018g甘露糖(Man)、0.0036g半乳
糖(Gal)、0.0036g鼠李糖(Rha)、0.0039g葡萄糖(Glc)、
0 .0039g 葡萄糖醛酸(Glc U A)、0 . 0042g 半乳糖醛酸
图2 HPLC测定7种单糖标准品(a)及天山花楸样品(b)的色谱图
Fig.2 HPLC chromatograms of seven monosaccharide standards
(a), Sorbus tianschanica Ruper. sample (b)
40
35
30
25
20
15
10
5
0
a
m
A
U
M
an R
ha
G
lc
U
A
G
al
U
A
G
lc
G
al
A
ra
b
80
70
60
50
40
30
20
10
0
b
m
A
U
M
an
时间(min)
0 5 10 15 20 25
R
ha
G
lc
U
A
G
al
U
A
G
lc
G
al
A
ra
b
1.2.5 样品的衍生化
精密吸取天山花楸多糖水解液 100μl按照 1.2.4节的
“加入 0.5mol/L的 PMP甲醇溶液 80μl”处理后，进行
H PLC 分析。结果见图 2b。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的绘制
单糖 相关系数 标准曲线 线性范围(mmol/L)
甘露糖 0.9986 y=544.3x－ 1337.2 0.0937～0.2500
鼠李糖 0.9988 y=743.58x－ 1825.9 0.1875～0.5000
葡萄糖醛酸 0.9988 y=1179.3x－ 3080 0.1875～0.5000
半乳糖醛酸 0.9991 y=1069.2x－ 2589.2 0.1875～0.5000
葡萄糖 0.9988 y=788.39x－ 1970.1 0.1875～0.5000
半乳糖 0.9989 y=906.99x－ 2249.2 0.1875～0.5000
阿拉伯糖 0.9989 y=905.77x－ 2230.1 0.1875～0.5000
表1 7种单糖标准的标准曲线
Table 1 Calibration curves for seven monosaccharide standers
取单糖混合标准溶液25μl按 1.2.4节中“加入0.5mol/L
的 PMP甲醇溶液 80μl”处理后，分别进样 3.0、4.0、
5.0、6.0、8.0μl，测定峰面积，用峰面积对各单糖的
OR
HO
OH
OH
OH
O N
N
CH3
O
N
N
RO
HO
OH
OH
OH
O
N
N
H3C
H
O NN
CH3
碱性
OR
HO
OH
OH
O
OH
CH3
N
NO
HO
RO OH
OH
OH
OH
O
N
N
H3C
－H2O
图1 糖链与衍生化试剂PMP的反应机理
Fig.1 Mechanism of glycan derivatization using PMP as derivate
PMP
H3C
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单糖 RSD(%) 平均峰面积
甘露糖 1.98 806.61
鼠李糖 2.9 1460.27
葡萄糖醛酸 1.3 1889.71
半乳糖醛酸 2.6 2472.31
葡萄糖 1.8 1094.17
半乳糖 2.2 1434.01
阿拉伯糖 2.6 1601.77
表2 精密度实验结果
Table 2 precision test
浓度回归得各单糖标准曲线、相关系数及线性范围见
表 1 。
2.2 精密度实验
取标准单糖混合溶液，依前述衍生化和色谱条件，
连续进样 5 次，测得吸收峰面积的 RSD 结果见表 2。
2.3 回收率实验
取已知含量天山花楸多糖样品 100μl加入一定浓度
的单糖混标 25μl，再以1.2.4节中“加入0.5mol/L的PMP
甲醇溶液 8 0μl”步骤处理后，重复测定 6 次，进样
5μl，测得吸收峰面积的 RSD和平均回收率结果见表 3。
单糖 RSD(%) 平均回收率(%)
甘露糖 1.7 103.1
鼠李糖 3.4 98.4
葡萄糖醛酸 2.2 97.5
半乳糖醛酸 2.2 98.4
葡萄糖 2.9 99.2
半乳糖 2.6 101.3
阿拉伯糖 2.6 98.8
表3 回收率实验结果
Table 3 Recovery test
成分
保留时间(min)
标准单糖 天山花楸多糖
甘露糖 7.435 7.471
鼠李糖 10.259 10.309
葡萄糖醛酸 13.314 13.408
半乳糖醛酸 14.137 14.209
葡萄糖 17.121 17.261
半乳糖 18.841 19.009
阿拉伯糖 21.345 21.553
表4 标准单糖及多糖水解衍生物的保留时间
Table 4 Retention time of standard monosaccharides and
polysaccharide hydrolysate derivatives
2.4 多糖样品分析
将混合单糖标准品图谱与天山花楸多糖的图谱对
照，可以确定天山花楸多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄
糖、半乳糖、阿拉伯糖 5 种中性单糖和半乳糖醛酸、
葡萄糖醛酸 2种酸性单糖组成，保留时间见表 4。由面
积归一化法计算得知天山花楸多糖中甘露糖、鼠李糖、
葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉
伯糖的物质的量比是3.06: 17.6: 12.0: 17.2: 14.0: 20.8: 15.2。
3 讨 论
3.1 本实验方法没有对衍生化中和后的水相进行干燥，
该步骤的简化并未影响衍生物的性质，也未产生任何影
响分离的杂质，而且在一定程度上缩短了反应时间，
降低了反应产物在多个步骤中的损失。PM P (保留时
间 8min左右)与各单糖组分分离良好，不影响单糖的
测定。
3.2 实验了不同 pH值的缓冲液对保留时间的影响，发
现缓冲液的 pH值对保留时间影响很大，pH值增大 0.1
个单位，保留时间延长将近一倍。同时考察了不同比例
流动相[醋酸铵缓冲溶液(pH5.5)-乙腈 77:23、78:22、79:21、
80:20]对保留时间、分离度尤其是两个糖醛酸的分离度
的影响，实验表明当流动相的比例为 77:23时，保留时
间较短，但分离度不如流动相比例为 78:22，79:21的，
PM P的峰与甘露糖的峰分不开，且保留时间长；流动
相的比例为 80:20时，PMP的峰与甘露糖的峰也分不开，
流动相的比例只有在 78:22时分离效果最好。
3.3 分别考察了流动相的流速为 0.6、0.8、1.0ml/min
时对保留时间及分离度的影响，结果表明流动相的流速
越快，保留时间越短，两个糖醛酸的分离效果相对较
差，当流速为 0.6ml/min时，两个糖醛酸都可分开，但
保留时间过长；流速为 0.8ml/min时，各个单糖的分离
度基本大于 2.20，综合考虑保留时间和分离效果两个因
素，选择最佳流速为 0.8ml/min。
参考文献：
[1] 杨玲玲, 常军民, 姚军. HPLC测定天山花楸中的苦杏仁苷[J]. 华西
药学杂志, 2007, 22(5): 589-590.
[2] 戴红, 张宗才, 张新申, 等. 芦荟多糖及其分离分析[J]. 氨基酸和生
物资源, 2004, 26(1): 5-7.
[3] 徐瑾, 李彤, 张庆合, 等. 柱前衍生化高效液相色谱等度洗脱分析单
糖的方法建立[J]. 生命科学仪器, 2005(2): 30-32.