全 文 ：中药新药与临床药理 2011年 3月第 22卷第 2期
柱前衍生 HPLC法分析藤三七多糖中单糖的组成
柳 杨，李 清，王 菲，陈晓辉，孙立新，毕开顺 (沈阳药科大学药学院，沈阳 110016)
摘要：目的 建立柱前衍生 HPLC法测定藤三七多糖中单糖的组成和含量。方法 采用水提醇沉法提取藤三七
多糖，三氟乙酸（TFA）水解，水解产物经衍生化试剂 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生后，利用反相
高效液相色谱法，分析单糖的 PMP衍生物。色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-
20 mmol·L-1醋酸铵缓冲液（22 : 78，v/v）（pH=5.5）；检测波长：245 nm。结果 藤三七多糖中含有 D-半乳糖醛
酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-（+）-树胶醛糖，平均含量分别为 19.43 %，35.73 %，8.46 %，5.89 %。结论
此法简便、快速，重现性好，可用于藤三七多糖中单糖的组成分析和含量测定。
关键词：藤三七多糖；柱前衍生化；HPLC；单糖
中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：1003-9783（2011）02-0199-04
Analysis of Monosaccharide Compositions in Bulbillus Boussingaultiae Pseudobaselloidis Polysaccharides by
Precolumn Derivation HPLC
LIU Yang，LI Qing，WANG Fei，CHEN Xiaohui，SUN Lixing，BI Kaishun（School of Pharmacy，Shenyang Phar－
maceutical University，Shenyang 110016，China）
Abstract：Objective To establish precolumn derivation HPLC method for the determination of monosaccharide com－
positions in Bulbillus Boussingaultiae Pseudobaselloidis Polysaccharides. Methods The polysaccharide was extracted
by hot distilled water，precipitated by alcohol，and hydrolyzed into monosaccharides by trifluoroacetic（TFA）. The
hydrolysate was derivatized with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone（PMP）and then the PMP derivates of monosaccha－
rides were determined by RP-HPLC on a Kromasil C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm）with a mobile phase consist－
ing of 20 mmol·L-1 ammonium acetate buffer（pH=5.5）and acetonitrile in the ratio of 78 ∶ 22. The detection was car－
收稿日期：2010-12-02
作者简介：柳杨，女，硕士研究生，研究方向：药物分析。Email：liuyang19860320@sina.com。通讯作者：毕开顺，教授，研究方向：中药现代化
及质量标准的研究。Email：bikaishun@yahoo.com。
3 讨论
本试验采用高效液相色谱-紫外检测法测定银翘
柴桂颗粒中连翘酯苷的含量，灵敏度高，准确性和精
密度好，操作简便，色谱峰分离优良，回收率高。
银翘柴桂颗粒复方溶液在 200～400 nm波长之间
扫描，连翘酯苷在 330 nm 处响应值大，杂质峰较
少，故选择 330 nm为测定波长。
以本方法跟踪银翘柴桂颗粒中连翘酯苷的保留
率，显示连翘酯苷由药材至颗粒的保留率约为 40%，
结果可为制订银翘柴桂颗粒中连翘酯苷的含量限度提
供参考。
参考文献：
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[7] 张海燕 . 连翘化学成分及药理活性的研究进展 [J]. 中药材，
2000，23（10）：657．
（编辑：修春）
连翘酯苷含量/mg
53.69
55.32
52.56
RSD/%
0.30
2.51
1.58
表 2 每袋银翘柴桂颗粒中连翘酯苷含量测定结果（n=3）
Table 2 Content determination results in Yinqiao Chaigui granula
of each bag
·199·
Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology，2011 March，Vol．22 No．2
藤三七（Anredera cordifolia）为落葵科落葵属多年
生蔓生植物。其营养价值高、口味好，富含蛋白质、
碳水化合物、维生素、胡萝卜素等，具有滋补、壮腰
膝、消散痰、活血、健胃保肝等作用，是一种天然的
药食两用植物。多糖是多种中药的有效成分，具有抗
衰老、抗溃疡、抗肿瘤、降血糖血脂等药理作用。近
年来，有关植物多糖的研究逐渐增多，藤三七多糖及
其单糖组分的研究却未见报道。本文采用柱前衍生化
反相高效液相色谱法，对藤三七多糖进行单糖组成和
含量测定研究，旨在为藤三七化学成分和质量控制研
究提供依据。
1 仪器与试药
Shimadzu LC-10AT vp 高效液相色谱仪（在线脱
气机、SPD-M10A vp 二极管阵列检测器、柱温箱），
CLASS-VP工作站；数显恒温 HH-2型水浴锅（国华
电器有限公司）；RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣
生化仪器厂）；PHS-25数显 pH计（上海精密科学仪
器有限公司）；AGBP210S电子天平（Sartorius公司）；
AB135-S十万分之一天平（METTLER TOLEDO仪器
有限公司）；202-OA型电热恒温干燥箱（天津市泰
斯特仪器有限公司）；TGL-16C离心机（上海安亭科
学仪器厂）
1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）（批号为
F20021225，购于国药集团化学试剂有限公司）； D-
半乳糖醛酸对照品（批号为 WF20060925，购于国药
集团化学试剂有限公司）、D-葡萄糖对照品（批号为
20050913，购于国药集团化学试剂有限公司）、D-半
乳糖对照品（批号为 F20061025，购于国药集团化学
试剂有限公司）、L-（+）-树胶醛糖对照品（批号为
WTCI20061205，购于国药集团化学试剂有限公司）。
乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。
藤三七药材由辽宁省营口市绿色保健蔬菜种苗开发中
心提供，经沈阳药科大学中药学院贾英副教授鉴定为
正品。藤三七多糖由本实验室自制，经紫外光谱分析，
不含蛋白质和核酸类物质。
2 方法与结果
2.1 藤三七多糖的提取 取藤三七药材干粉约 10 g，
精密称定，加入石油醚（60～90 ℃）100 mL回流提取
两次，每次 2 h；弃去提取液，药渣用 80 %乙醇 100
mL浸泡过夜，回流提取两次，每次 2 h。弃去提取
液，药渣加蒸馏水 100 mL回流，提取 3次，每次 2 h。
合并提取液，减压浓缩至 40 mL，用 Sevage 法除去
蛋白。水层加入 95 %乙醇，使其含醇量达 80 %，静
置，离心弃去上清液，沉淀先后用无水乙醇、丙酮、
无水乙醚多次洗涤，真空干燥，即得藤三七粗多糖。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液 取对照品 D-半乳糖醛酸、D-葡
萄糖、D-半乳糖、L-（+）-树胶醛糖适量，精密称定，
置同一 10 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇
匀， 配制成内含 D-半乳糖醛酸 1.289 mg·mL-1，D-
葡萄糖 2.625 mg·mL-1，D-半乳糖 0.521 mg·mL-1，L-
（+）-树胶醛糖 0.511 mg·mL-1的对照品混合溶液。
2.2.2 供试品溶液 取藤三七多糖样品约 15 mg，精
密称定，置 10 mL具塞试管中，加水 1 mL，加热溶
解，再加入 2 mol·L-1三氟乙酸溶液 2 mL，摇匀，密
封。将其放入烘箱中，110 ℃加热水解 8 h，取出，
冷却至室温，4000 r/min 离心 5 min，上清液转移至
10 mL 量瓶中，用 2 mol·L-1氢氧化钠中和至 pH 约
7.0，水定容至刻度，摇匀，备用。
2.2.3 衍生化产物的制备 取单糖对照品混合溶液和
供试品溶液各 100 μL，置 1.5 mL离心管中，依次加
入 50 μL，0.3 mol·L-1 NaOH 和 0.5 mol·L-1 PMP 溶
液，混匀，80 ℃水浴反应 40 min，取出，冷却至室
温，再各加入 50 μL，0.3 mol·L-1 HCl溶液中和，加
入 200 μL氯仿萃取，充分震荡、离心，弃去下层有
机相，如此重复操作 3次，上层水相经 15000 r/min
高速离心 5 min后，取上清液用于 HPLC分析。
2.3 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6
mm，5 μm）；流动相：乙腈-20 mmol·L-1醋酸铵缓冲
液（22 ∶ 78，v/v）（pH=5.5）；流速：1.0 mL·min-1；检
ried out at 245 nm. Results Bulbillus Boussingaultiae Pseudobaselloidis polysaccharides included D -galacturonic
acid，D-glucose，D-galactose and L-（+）-arabinose，and the average contents of the four monosaccharides were
19.43 %，35.73 %，8.46 %，5.89 %，respectively. Conclusion The established HPLC method is simple，fast，re－
producible，and can be used for the determination of monosaccharide compositions in Bulbillus Boussingaultiae Pseu－
dobaselloidis polysaccharides.
Keywords：Bulbillus Boussingaultiae Pseudobaselloidis polysaccharides; Precolumn derivation; HPLC; Monosaccha－
rides
·200·
中药新药与临床药理 2011年 3月第 22卷第 2期
t/min
B
mAU
测波长：245 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。
2.4 方法学考察
2.4.1 线性关系的考察 精密吸取对照品混合储备溶
液 0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2 mL，分别置 10 mL量
瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，配制成系列对照品混
合溶液。按“2.2.3”项下方法进行衍生化处理，按上
述色谱条件下测定。以对照品浓度 X（μg·mL-1）对色
谱峰面积 Y（mAU·s-1）进行线性回归分析。D-半乳糖
醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-（+）-树胶醛糖的回
归方程及其线性关系见表 1。
表1 4种单糖的标准曲线和线性范围
Table 1 Calibration curve equations and linear range of four
monosaccharides
2.4.2 精密度试验 精密吸取对照品混合溶液，按照
“2.2.3”项下的方法进行衍生化，在上述色谱条件下
连续进样 6次，测得 D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-
半乳糖、L-（+）-树胶醛糖峰面积的 RSD分别为 1.9 %，
1.4 %，1.2 %，1.8 %。
2.4.3 重复性试验 取藤三七多糖 6 份，按“2.2.2”
项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.3”项下的方
法进行衍生化处理，在上述色谱条件下，分析测定，
测得 D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-（+）
-树胶醛糖含量的 RSD 分别为 2.4 %， 2.0 %，
3.0 %，2.8 %。
2.4.4 稳定性试验 取衍生化后的供试品溶液，室温
下放置，分别于 0，2，4，6，8，10 h 测定，计算
D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-（+）-树胶
醛糖峰面积的 RSD 分别为 2.9 %，2.6 %，3.0 %，
2.6 %，结果表明供试品溶液中 D-半乳糖醛酸、D-
葡萄糖、D-半乳糖、L-（+）-树胶醛糖衍生物在 10 h
内保持稳定。
2.4.5 加样回收率试验 取 9份藤三七多糖，每份约
7.5 mg，精密称定，平均分成 3组，置具塞试管中，
各组分别精密加入不同量的 D-半乳糖醛酸、D-葡萄
糖、D-半乳糖、L-（+）-树胶醛糖的对照品溶液，按
“2.2.2”项下方法制备低、中、高浓度的供试品溶液，
再按“2.2.3”项下方法进行衍生化处理，在上述色谱
条件下进行测定。计算平均加样回收率分别为 D-半
乳糖醛酸 95.3 %，D-葡萄糖 96.1 %，D-半乳糖
95.4 %，L-（+）-树胶醛糖 95.1 %。
2.5 样品测定 取 3 份藤三七多糖，每份约 15 mg，
精密称定，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶
液，再按“2.2.3”项下方法进行衍生化处理，在上述
色谱条件下进样分析，测得峰面积，计算藤三七多糖
中 D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-（+）-
树胶醛糖的含量。测定结果见表 2，对照品与样品色
谱图见图 1。
表 2 藤三七多糖中各单糖的含量（n=3，%）
Table 2 Four monosaccharides content in Bulbillus Boussingaultiae
Pseudobaselloidis polysaccharides
图 1 对照品（A）与样品（B）的 HPLC色谱图
1. 半乳糖醛酸 2. 葡萄糖 3. 半乳糖 4. 树胶醛糖
Figure 1 HPLC chromatograms of monosaccharides control（A）
and sample（B）
3 讨论
3.1 衍生化条件的选择 本研究所用的多糖提取方法
样品号
1
2
3
D-半乳糖醛酸
19.49
18.84
19.97
D-葡萄糖
35.67
34.91
36.59
D-半乳糖
8.30
8.49
8.59
L- (+) -树胶醛糖
6.06
5.74
5.87
单糖
D-半乳糖醛酸
D-葡萄糖
D-半乳糖
L- (+) -树胶醛糖
标准曲线
Y = 5.14×104X-9.17×104
Y = 5.20×104X-5.35×105
Y = 6.72×104X-5.02×104
Y = 8.49×104X-1.25×105
相关系数
0.9991
0.9990
0.9994
0.9995
线性范围/μg·mL-1
25.78~257.8
52.50~525.0
10.41~104.1
10.21~102.1
t/min
A
mAU
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Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology，2011 March，Vol．22 No．2
和衍生化方法均参考有关文献[1-3]，经 PMP空白试验
证明，残留的 PMP峰与各单糖组分分离良好，不影
响单糖的测定。且本文对多糖的水解及衍生化条件进
行了优化，对藤三七多糖水解时间、PMP衍生化试
剂用量、PMP衍生化温度、PMP衍生化时间、PMP
衍生化萃取剂用量进行考察，确定了最佳衍生化条件
为多糖水解 8 h，衍生化试剂 PMP用量为 50 μL，反
应温度 80 ℃，反应时间 40 min，萃取剂氯仿用量为
200 μL。
3.2 色谱条件的选择 本实验考察了在流动相中加入
磷酸盐和醋酸铵。实验结果表明，采用醋酸盐缓冲液
作流动相时，各单糖组分得到了较好的分离，峰形对
称。在流动相的 pH选择上，本文考察了 pH值对实
验的影响，结果表明流动相的 pH改变对保留时间和
峰形影响明显，当 pH为 5.5时，色谱峰各组分保留
时间适中，分离效果最好。最终确定以乙腈-20
mmol·L-1醋酸铵缓冲液（22 ∶ 78，v/v）（pH=5.5）为洗
脱系统。
3.3 在单糖分析方法中气相色谱法分离单糖繁琐费
时[4]，易出现色谱峰异构化裂分；高效液相色谱法测
定单糖可用糖分析柱和氨基键合相柱，但其价格昂贵[5]。
本文采用价格较低廉的 C18色谱柱，紫外检测器，通
过对色谱条件的优化，可同时分离测定 4种单糖，操
作简便快速。
3.4 藤三七多糖的 PMP衍生物，用上述色谱条件检
测，对比常用单糖标准品经衍生化后的 HPLC图谱进
行分析，其中 D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳
糖、L-（+）-树胶醛糖的色谱峰与藤三七多糖 PMP衍
生物的色谱峰峰位一致。故最终确定了藤三七多糖的
各单糖组成，为藤三七多糖的进一步结构分析和活性
研究奠定基础，也为今后研究藤三七的药用价值提供
参考。
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（编辑：宋威）
收稿日期：2010-11-17
作者简介：王真，女，硕士研究生，研究方向：药物化学。Email:zhen0323@126.com。通讯作者：周洪雷（1967-），男，教授，博士研究生导师，
从事中药及天然药物研究。Email：hongleizhou@yahoo.com.cn。
基金项目：山东省中药学泰山学者研究团队项目，国家创新药物大平台（山东） 2009ZX09301-013。
HPLC- ELSD测定柏子养心丸中黄芪甲苷的含量
王 真 1，2，周洪雷 1（1. 山东中医药大学药学院，济南 250355；2. 济南宏济堂制药有限责任公司，济南
250100）
摘要：目的 建立柏子养心丸中黄芪甲苷的含量测定方法。方法 采用 HPLC-ELSD法，色谱柱 Fortis C18（4.6
mm×250 mm，5 μm），流动相以乙腈-水（35 ∶ 65），漂移管温度 96 ℃，气体流量 2.4 bar，流速为 1.0 mL/min。
结果 黄芪甲苷在 0.2~1.0 μg的范围内线性关系良好，平均回收率为 97.1 %，RSD=0.83 %（n=6）。结论 本方
法准确可靠，重现性好，结果稳定，可作为柏子养心丸质量控制的方法。
关键词：柏子养心丸；HPLC-ELSD；黄芪甲苷；含量测定
中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：1003-9783（2011）02-0202-03
Determination of Astragaloside IV in Baizi Yangxin Pill by HPLC-ELSD
WANG Zhen1，2，ZHOU Honglei1（1. School of pharmacy，Shandong University of TCM，Ji’nan 250355，China；2.
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